PLoS ONE: Down-regulacija AP-4 inhibira proliferaciju navede staničnog ciklusa i potiče apoptozu u ljudskim rak želuca Cells

Sažetak pregled

Pozadina pregled

AP-4 spada u osnovnu spirale -loop-helix leucin-zatvarač podskupinu; kontrolira ekspresiju ciljanog gena, regulira rast, razvoj i staničnoj apoptozi te je implicirano u tumorogenezi. Naše prethodne studije pokazale su da AP-4 je često prekomjerno izražen u želučanim raka i mogu biti povezani s lošom prognozom. Svrha ovog istraživanja je ispitati da li utišavanje AP-4 mogu mijenjati biološke karakteristike želučanih stanica raka. Pregled

Metode pregled

Dvije specifične siRNA ciljanja AP-4 su bile namijenjene, sintetizirati, i transfckciranu u staničnim linijama raka želuca i humanih normalnih stanica sluznice. AP-4 ekspresija je mjeren u realnom vremenu kvantitativnog PCR i Western blot. proliferacija stanica i za kemijsku osjetljivost su detektirani CCK-8 testu. Test staničnog ciklusa i apoptoza ispitivanje provedeni su protočnom citometru i relativni izraz regulatora staničnog ciklusa su otkrivene u realnom vremenu, kvantitativni PCR i Western blot, ekspresija faktora uključenih u apoptoznu put je ispitano u mRNA i proteina.

Rezultati

izraz AP-4 su utihnuli po siRNA transfekcije i učinci AP-4 obaranje trajao od 24 do 96 sati. SiRNA posredovana utišavanje AP-4 potisnut staničnu proliferaciju, induciranu apoptozu i osjetljivi na stanice raka na citostatike. Pored toga, razina ekspresije p21, p53 i caspase-9 je povećana kada AP-4 je obaranje, ali je ekspresija ciklina D1, Bcl-2 i Bcl-X _{L je inhibirana. To ne induciraju zaustavljanje staničnog ciklusa, kada AP-4 je bio obaranje na p53 mana rak želuca stanične linije Kato-III. Pregled}

Zaključci

Ovi rezultati ilustrirani da utišavanje gena AP-4 mogu učinkovito proliferaciju stanica inhibirana, pokreću apoptozu i senzibilizirani stanica raka na citostatike in vitro, što ukazuje da AP-4 siRNA posredovane utišavanje ima potencijalnu vrijednost u liječenju ljudskog raka želuca pregled

Izvor. Liu X, Zhang B, Guo Y, Liang Q, Wu C, Wu L, et al. (2012) Down-regulacija AP-4 inhibira proliferaciju navede staničnog ciklusa i potiče apoptozu u ljudskim karcinoma želuca stanica. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10,1371 /journal.pone.0037096 pregled

urednik: Vladislav V. Glinskii Sveučilišta Missouri-Columbia u Sjedinjenim Američkim Državama Netlogu

Primljeno: 4. lipnja 2011; Prihvaćeno: 18. travnja 2012; Objavljeno: 16. svibnja 2012 pregled

Copyright: © 2012 Liu i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Iako je incidencija i mortaliteta povezanih s rakom želuca postupno smanjio u posljednjih nekoliko godina u većini područja u svijetu [1], [2], rak želuca ostaje svjetski zdravstveni problem, a ostaje najčešći uzrok od raka povezanih smrtnih slučajeva s malo poboljšanje dugoročnog opstanka. Najučinkovitiji liječenje karcinoma želuca bila potpuno kirurško uklanjanje tumora, D2 Limfadenektomija. Osim toga adjuvantna kemoterapija i radioterapija su pomogli poboljšati prognozu. Čak i tako, 5-godišnje preživljenje je ostala vrlo loša [1], [3]. Više od milijun novih slučajeva dijagnosticira se svake godine, pogotovo u istočnoj Aziji, poput Japana, Koreje i Kine. U tim zemljama, raka želuca i dalje najčešći uzrok smrti od raka povezane, a precizan patogeneze ostaje nepoznat. [3] pregled

transkripcijski faktori su važni regulatorni dijelovi [4]. Oni su pripadali helix-loop-helix obitelji i odigrao važnu ulogu u proliferaciji i diferencijaciji stanica, određivanje stanične linije, ekspresija unutarstanični genetskih informacija, i drugi bitni procesi [5]. Kao član osnovni spirala-loop-Helix leucin-zatvarač (bHLH-LZ) podskupinu bHLH proteina [6], aktivirajući obogaćivanja vezujući protein 4 (AP-4) u početku je bio identificiran kao stanični protein koji veže se na majmunski virus 40 (SV40) pojačivač i aktivira virusni kasni transkripciju gena [7]. AP-4 je prisutno izražava transkripcijski faktor, te može kontrolirati transkripcijske mreže tijekom stanične diferencijacije formiranjem homodimere i vezanje simetričnog DNA sekvence, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11] [ ,,,0],12]. AP-4 je ligand za imunoglobulin kapa promotora E-box elemenata koji mogu biti uključeni u imunodeficijentnim bolestima [13], [14]. Osim toga, za razliku od drugih hLH proteina, AP-4 sadrži dva dodatna protein dimerizacija motive koji se sastoje od leucin ponoviti elemenata LR1 i LR2. Stoga, AP-4 prikazuje specifičnu tripartitni dimerizacija strukturu, što ukazuje da AP-4 mogu komunicirati sa raznim faktorima transkripcije [8], [14]. AP-4 regulira ekspresiju nekih gena [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Na primjer, to aktivira transkripciju gena hMTIIA i sudjeluje u regulaciji ljudskog proenkephalin izraza [22], a može igrati ulogu u ekspresiji gena egzokrine gušterače obitelji [23]. Nedavno je prekomjerna ekspresija AP-4 je bio prijavljen u rak debelog crijeva, raka dojke i raka prostate [9], [18], [24]. Pregled

RNA interferencije (RNAi) je proces slijed određeno radno mjesto -transcriptional utišavanje gena inicirao dvostruke uzvojnice RNA [25], što može dovesti do ušutkavanja specifične stanične gena i pružiti snažan pristup reverzne genetike za analizu funkcija gena in vitro i in vivo [26]. Trenutno se najčešće upotrebljavaju za utišavanje gena molekule nukleinskih kiselina sekvenca-specifične bili mali smetaju RNA [27], nazvana siRNA, koji se sastoji od simetričnih parova od 19-21 parova baza [28]. Postupak siRNA mogu inhibirati ekspresiju ciljnog gena specifičnog, učinkovitosti i izdržljivosti [29]. Pregled

ranije izvijestili smo da AP-4 je povećana kod raka želuca, te da može biti povezan s lošom prognozom [30]. U ovom istraživanju, možemo dodatno ispitati funkciju AP-4 u ljudskim stanicama raka želuca s RNA interferencije. Pregled

Rezultati

Posebni siRNA ciljanja izraz AP-4 u ljudskim stanicama raka želuca i čovjeka normalne sluznice stanice pregled

procijeniti učinak siRNA posredovane šutnje ekspresije AP-4 gena, kontrola siRNA i AP-4 specifična siRNA su transfektirane u stanice za 24 sata, 48 sati, 72 sata i 96 h. Djelotvornost u podreguliranjem ekspresije AP-4 gena je otkriven u stvarnom vremenu kvantitativnog PCR i Western blot. Kao što je prikazano na slici 1, AP-4 specifična siRNA mogao učinkovito inhibira transkripciju gena i translacije. MRNA i proteina razine AP-4 je smanjen sa AP-4 siRNA transfekcije grupu, ali ne i u kontroli siRNA (slika 1). Inducirani potiskivanje siRNA of AP-4 ekspresije može detektirati i 24 sata nakon transfekcije. Međutim, odnos inhibicija manja od 72 sata nakon transfekcije. Najučinkovitiji vremenska točka bila između 48 h do 72 hu potisnuti izražavanja AP-4. Relativne razine mRNA transkripata značajno smanjena za skoro 90% u siRNA-1 skupinu, a 95% u siRNA-2 grupa. Postoji statistička značajnost između siRNA grupe i kontrolne grupe. Pregled

Podreguliranje AP-4 ekspresije inhibiraju staničnu proliferaciju i senzibilizirani humanog želučanog stanica raka na citostatike

ispitivanja učinka AP-4 specifična siRNA na proliferaciju stanica i kemoterapije osjetljivosti stanica raka, 20 nM od AP-4 specifična siRNA ili za kontrolu siRNA su transfektirane i proliferacija stanica je određena CCK-8 testu 48 sati nakon transfekcije. Otkrili smo da je obaranje AP-4 mogu inhibirati proliferaciju želučani staničnim linijama karcinoma SGC7901 i AGS (slika 2), ali ne u normalnoj sluznici staničnoj liniji GES-1 u usporedbi s kontrolnom siRNA transfekciju u 48 sati (Slika 2). Ovi rezultati ukazuju da AP-4 siRNA prigušuje staničnu proliferaciju stanica raka želučanog in vitro. Nadalje, istražili smo ulogu AP-4 u regulaciji kemoterapije osjetljivosti stanica raka želuca. usporedili smo osjetljivost lijeka AP-4 iRNK s onima kontrolne siRNA ili lažno stanica i otkrili da relativna stopa inhibicije AP-4 specifičnih iRNK bila je značajno viša od one u kontrolnoj siRNA ili lažno stanica (p < 0,0001) (Slika 2 ). Osim toga, AP-4 siRNA znatno poboljšana osjetljivost stanica ADR-a, 5-FU ili cis-plantinum tretmana na dvije drugačije doze (slika 2), te je predložio da se na regulaciju AP-4 mogu imati blagotvoran učinak u osjetljivost kemoterapijom. pregled

odsutnost AP-4 ekspresije inducirane staničnog ciklusa i modulira ekspresiju p53, p21 i ciklina D1

učinak AP-4 na progresiju staničnog ciklusa je istraživana , Ljudske želučane stanice raka su transfektirane s 20 nM kontrolnom siRNA, i AP-4 specifična siRNA za 48 sati, nakon čega slijede propidijevim jodidom i protočno citometrijska analiza staničnog ciklusa. Dok stanice transficirane s kontrolnim siRNA napredovala kroz različite faze staničnog ciklusa, stanice su transfektirane s AP-4 specifičnih iRNK pokazali značajno veću učestalost stanica na G0 /G1 fazi (SGC7901 /siRNA-1: 68.81%; SGC7901 /siRNA-2: 68.97%; AGS /siRNA-1: 61,92%; AGS /siRNA-2: 63.67%) i manja učestalost stanica u S-fazi (SGC7901 /siRNA-1: 29.57%; SGC7901 /siRNA-2: 29.84%; AGS /siRNA-1: 24.36%; AGS /siRNA-2: 22.91%). Postotak stanica u G0 /G1 fazi u stanici transficirana AP-4 iRNK bila je značajno veća od one lažno stanica (SGC7901: 54.65%; AGS: 48.44%) (p < 0.05) ili kontrolu siRNA (SGC7901 /kontrolu siRNA: 52,18%; AGS /kontrola siRNA: 50.38%) (Slika 3). Dakle, transfekcija s AP-4-specifičnih iRNK induciraju staničnu ciklin pritvoru u G0 /G1 faze. Pregled

AP-4 specifične siRNA izazvanog staničnog ciklusa blokirati otvore se dodatno istražiti promatrajući učinke AP-4 specifične siRNA liječenje o relativnoj ekspresiju regulatora staničnog ciklusa: supresorskog gena p53 tumor, inhibitora kinaze p21 ovisan o ciklinu, a G (1) runde specifična ciklina D1, koji su kritični regulatori staničnog ciklusa i proliferacije. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, stanice ljudskog raka želuca su skupljene real-time PCR i imunobloting analize. Transfekciju AP-4 specifičnih iRNK može se reguliraju ekspresiju p53 i p21 proteina. Modulatorski učinak AP-4 iRNK bila veća od one kontrolne siRNA (Slika 4) (p < 0.01). Kao što se očekivalo, ciklin D1 je regulirati na dolje u odnosu na kontrolu siRNA grupu i maketa skupinu (slika 4) (p < 0,01). Ovi podaci dodatno podupire hipotezu da utišavanje ekspresije AP-4 mijenjati ekspresiju drugih stanični ciklus regulatora, izazvanog staničnog ciklusa i inhibiraju proliferaciju ljudskih stanica raka želuca pregled

Detekcija apoptoze i čimbenike koji su uključeni u apoptoza put pregled

za kvantificiranje učinka AP-4 specifičnih iRNK na apoptozu u stanicama raka želuca, Annexin-V i PI bojanja testovi su korišteni u kombinaciji sa tekućom citometrijom. Stanice su obojeni Aneksin V-FITC /PI i usmjernika u donjem desnom (ZK) i Gore desno (UR) kvadranta. Stanice u LR i UR se smatralo da su rani apoptoze (Aneksin ^{+ /PI -) i kasno apoptoze (Aneksin + /PI +) respektivno. Stanice u LL (dolje lijevo) i UL (gore lijevo) kvadranta su smatrali da je živ i nekrotične respektivno. Opseg apoptoze izražava se kao zbroj postotaka u zk i UR kvadranta. Apoptoze stope su pokazali na slici 5. tretiranih stanica sa AP-4 iRNK pokazao više apoptotične stanice (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) od negativnih (SGC7901 /kontrolne siRNA: 5.5%; AGS /kontrola siRNA: 6,7%) (p < 0.05) i prazna (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p < 0.05) , Ovi rezultati pokazuju da je AP-4 specifična siRNA mogli da inducira apoptozu u navedenim stanicama. Pregled}

Nadalje, ispitali smo ekspresiju faktora uključenih u apoptoznu puta u realnom vremenu PCR u razini mRNA, poput Bcl-2, , Bcl-x _{L, kaspaze-9, kaspaze-8 i Bax. Pokazalo se da obaranje AP-4 mogu se reguliraju ekspresiju Baspase-9 na stanice ljudskog raka želuca, te Modulatorski učinak AP-4 iRNK bila veća od one kontrolne siRNA (slika 6), (p < 0.01). Ekspresija bcl-2, a Bcl-X L je smanjena u usporedbi s kontrolom siRNA ili mock skupine (Slika 6), (p < 0.01). Ovi podaci nadalje podržava da odsutnost AP-4 ekspresije dovela na apoptozu u stanicama raka želuca. Međutim, ekspresija kaspazu-8 i Bax su različiti u različitim staničnim linijama nakon transfekcije. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, kaspaze-8 i Bax su preko ekspresije u AGS stanicama. U SGC7901 stanicama, ekspresija Bax povećao, ali je ekspresija kaspaze-8 povećava samo u siRNA-1 grupu. U siRNA-2 skupine kaspaze-8 ekspresije nije bila značajna zahvaćeni (Slika 6). Pregled}

AP-4 utišavanje može regulirati stanični ciklus i stanične apoptoze i u p53 ovisan i neovisan ponašanje pregled

za potvrdu da je up-regulacija p53 u AP-4 obaranje stanica raka želuca bila je ključna za ulogu staničnog ciklusa, Kato-III stanice, vrsta p53 mana želučanog raka stanične linije koristi za procjenu ovisnost AP -4 obaranje učinak na p53. Otkrili smo da obaranje AP-4 u AGS s divljim tipom p53 ili SGC7901 s mutiranim p53 moglo poticajno staničnog ciklusa, ali ovaj fenomen nije zabilježen u Kato-III stanice (slika 7), postotak stanica u G0 /G1 faze su 57.82% (siRNA-1), 59.05% (siRNA-2), 59.59% (kontrola siRNA) i 59.06% (tobožnji). Oni pokazuju da obaranje AP-4 možda reguliraju stanični ciklus pomoću p53-p21 puta. Apoptoza populacija također je otkrivena u Kato III-stanica s Annexin V-FITC i PI bojanja. Rezultati su pokazali da je stopa apoptozu Kato-III stanice transfektirane s AP-4 iRNK (siRNA-1: 7,9%; siRNA 2: 9.2%) je bio više od kontrole siRNA (3,3%) (p < 0.05) i mock stanice (3,5%) (p < 0,05), ali u manjoj mjeri nego što je to učinio na AGS (p < 0,05) i SGC7901 stanica (p < 0,05), što znači da utišavanje AP-4 mogu inducirati apoptozu u želučanih stanica raka kroz i p53 ovisne i neovisne-maniri. pregled

Rasprava pregled

ekspresija gena je osnovni i visoko konzervirani proces. Transkripcije, prvi korak u ekspresiji gena, izvodi se strukturno konzervirana DNA ovisne RNA polimeraze, što rezultira u sintezi molekula RNA iz DNA kalupa [31]. Transkripcijski faktori, oblik transkripcija inicijacija kompleks s RNA polymeras II, sudjelovati u procesu inicijacije transkripcije za regulaciju ekspresije gena. Mogu igrati važnu ulogu u transformaciji, tumorogeneze, napredovanja tumora i metastaza pomoću regulacije transkripcije i time gensku ekspresiju [32], [33], [34]. Transkripcijski faktor AP-4, koji spadaju u brzo rastućoj skupini hLH proteina [8] je uključena u diferencijaciju i staničnu proliferaciju [35], [36], [37], [38], [39], utječe staničnog ciklusa događaja i apoptoza, regulira i kontrolira neke genske ekspresije [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Nedavno je objavljeno da AP-4 je doreguliran u karcinoma debelog crijeva, raka dojke i raka prostate [9], [18], [24]. Osim toga, AP-4 pozitivni izraz ukazuje na lošu prognozu sa značenjem preko razred, status čvor ili veličini u ER + rak dojke, i moguću povezanost s kemoterapije osjetljivosti [40]. U našem je prethodno proučiti, utvrdili smo da je ekspresija AP-4 je pojačana ekspresija i to ko povezanih s lošom prognozom [30]. To može biti molekularni marker za dijagnozu i prognozu karcinoma želuca. U ovom istraživanju ,. dizajniran smo dva AP-4 specifične siRNA da inhibiraju ekspresiju gena AP-4 u ljudskim stanicama raka želuca. Oni su dobro uspostavljen i preseli u stanice što rezultira knock-down izražavanja AP-4 gena. otkrili smo da najpotentnijom vremenska točka u suzbijanju izraz AP-4 u želučanim stanicama karcinoma je 48 h i 72 h nakon transfekcije. Dakle, odabrali smo bivši i dalje obavljati srodne ispit. Pregled

Prije toga, pokazalo se da je faktor transkripcije AP-4, za razliku od drugih hLH proteina, sadrži dva različita leucin ponoviti elemente koji također izravna dimerizacija i dopustiti selektivni kompleksa sveprisutne AP-4 proteina [8], [41]. pregled

AP-4 mogu igrati važnu ulogu u modulaciji staničnih funkcija pomoću regulacije gena uključenih u virusnu proizvodnji [7], [16 ], [22], [42], [43], stanični rast i preživljavanje [9], [17], [23], [44], imunološki odgovor [14], [41], [45] i angiogeneza [21]. Peter Jung, et al otkrili da AP-4 mogu kodirati c-myc indukcijske represor inhibira ekspresiju p21 [9], a vjerojatno je igrao važnu ulogu u posredovanju proliferativne aktivnosti c-myc [10]. Osim toga, AP-4 utjecao na osjetljivost na apoptozu regulira ekspresiju kaspaze-9 [17]. U ovom istraživanju, otkrili smo da se regulacija AP-4 inhibiraju proliferaciju ljudskih stanica raka želuca in vitro. Omjer inhibicije proliferacije AP-4 specifičnih iRNK je bila znatno niža nego u stanicama koje su transfektirane s kontrolnom siRNA ili oponašanje skupinom. Pregled

Kemoterapija je jedan važan strategija u liječenju karcinoma želuca, ali često ne uspijeva zbog otpornost na antitumorskih lijekova. To je izvijestio da je AP-4 pozitivni izraz možda bio povezan s kemoterapije osjetljivosti [40]. Potom smo istražili ulogu AP-4 u regulaciji kemoterapije osjetljivosti ljudskih stanica raka želuca i otkrili da inhibicija AP-4 mogu značajno poboljšati osjetljivost tih stanica ADR-a, 5-FU ili cis-plantinum liječenja, što upućuje na da inhibicija AP-4 mogu imati blagotvoran učinak na kemoterapije osjetljivosti. pregled

Osim toga, utišavanje AP-4, izazvanog staničnog ciklusa u G0 /G1 faza, analiza potencijalnih mehanizme učinke AP-4 utišavanje na inhibiciju ljudske želučane proliferacije stanica karcinoma karakterizira ekspresije regulatora staničnog ciklusa vezane. Otkrili smo da je down-regulacije AP-4 ekspresije inhibira ekspresiju ciklina D1, ali regulira prema gore ekspresiju p53 i p21. p53 i p21 je hipoteza da se negativni regulator staničnog ciklusa i proliferacije [46], [47], s druge strane, ciklin D1 promovira progresiju G _{1 S fazi staničnog ciklusa [48 ]. Podregulirani ekspresija AP-4, p21 i p53 u međuvremenu mogao napraviti staničnog ciklusa uzrokuje obaranje AP-4 nestanka. Ovi rezultati su u skladu s modelom u kojem AP-4 uzrokuje staničnog ciklusa regulira ekspresiju regulatora staničnog ciklusa, kao što su p53, p21 i ciklina D1. Pregled}

Apoptoza ili programirana stanična smrt, je poznata da sudjeluju u raznim biološkim procesima dva glavna apoptoze, mitohondrijske (unutarnje) puteva i smrtne receptora (vanjsko) stazi [49]. našli smo da utišavanje ekspresije AP-4 potaknuto staničnoj apoptozi u našem eksperimentu, koja pokazuje da se AP-4 potiskuje apoptozu u ljudskim stanicama raka želuca. pregled

U našem eksperimentu povećanje razine kaspaza-9 i podregulacijskom Bcl-2 i Bcl-x L su nađeni u ljudskim stanicama raka želuca, što ukazuje da obaranje AP-4 aktiviranih i unutarnju i vanjsku stazu na apoptozu u stanicama raka. [49], [50] pregled

Ukratko, podaci pokazuju da RNAi posredovanog down-regulaciju faktora transkripcije AP-4 učinkovito inhibirati proliferaciju stanica naznačeno staničnog ciklusa, pokreću apoptozu i poboljšanu kemijsku osjetljivost humanih stanica s smanjenom ekspresijom ciklina D1, Bcl-2 i Bcl-x _{L i aktivnog p21, p53 i Caspase-9, za koju predložene AP-4 mogu biti onkogeni igraju važnu ulogu u nastanku tumora raka želuca , Iako točan mehanizam ove uloge treba dodatno istražiti, AP-4specific-siRNA mogu biti potencijalne vrijednosti kao nova terapeutska sredstva za ljudsku raka želuca. Pregled}

materijali i postupci

Stanična linija i stanična kultura pregled

ljudskog želuca staničnim linijama karcinoma AGS s divljim tipom p53, SGC7901 s mutiranim p53 (dobiven iz Wuhan University) i Kato-III sa p53 genoma brisanja (Zhiyan Bio Technology Co, Šangaj) uzgojene su u DMEM medij ili medij RPMI1640 (Invitrogen) koji je sadržavao 10% fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen), penicilinom (100 u /ml) i streptomicina (100 ug /ml). Stanice su održavane na 37 ° C u vlažnoj atmosferi 5% CO _{2. Pregled}

Specifično siRNA i transfekciju pregled

cDNA sekvenca gena AP-4 dobiven je iz Genbank ( NM_003223), a sekvence koje ciljaju dva 21-nukleotid različitih iRNK dizajnirani su i kemijski sintetizirane (Qiagen Njemačka). Nukleotidnih sekvenci bili su kako slijedi: siRNA-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(smislena), i 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (antisense). siRNA-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(smislena), i 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (antisense). Allstars negativna kontrola siRNA (Qiagen Germany) se koristi kao kodiranim siRNA kontrolom. Stanice su nasađene u ploče sa 6 jažica, a siRNA su transfecirani u stanice kulture s lipofektaminom 2000 (Invitrogen), u skladu s uputama proizvođača. Pregled

stvarnom vremenu kvantitativni PCR pregled

Ukupna RNA ekstrahiranje izvršeno pomoću RNAiso Plus (Takara, Japan) u skladu s uputama proizvođača. CDNA iz ukupne RNA, sintetizirani su primjenom RT PrimeScript® reagens pribora (Takara, Japan). Ekspresija mRNA procijenjena u realnom vremenu PCR na ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapur) uz brzo SYBR Green PCR reagensima. GAPDH je primijenjen kao unutarnje kontrole. Koncentracije reagensa bile su podešene da se postigne konačni volumen od 20 uL, koji sadrži 2 ul reverzno transkribiran produkt, 10 ul Fast Green SYBR® glavne smjese (Applied Biosystems, Foster City, CA), i 0.5 ul 10 uM naprijed i reverzne početnice. Reakcija se izvodi 45 ciklusa umnožavanja 95 ° C u trajanju od 3 s i 60 ° C tijekom 30 s. Sljedeći primeri su dizajnirani (Table.1). PCR primeri su dizajnirani od strane Primer 5.0 i Blast potrazi za provjeru specifičnost. Sekvencijama koriste navedeni su u tablicama 1. rezultati su izračunati pomoću 2 ^{-ΔΔCt metodu. Pregled}

Western blot pregled

Protein je ekstrahirana ekstrakciju proteina kit (Beyotime Kina) prema na smjer. Protein je bio razrijeđen do 3 ug /ul, a odvojen je od 10% SDS-PAGE, preneseni na polivinilidenfluorid (PVDF) membranu (Millipore, USA), a zatim blokirana je u 5% bezmasnim mlijekom u prahu u TBST 1 sat na sobnoj temperaturi. Imunobloting je provedena upotrebom anti-AP-4 antitijela (Sigma-Aldrich, Shanghai, razrjeđivanje 1:1000), anti-p21 antitijelo (Sigma-Aldrich, Shanghai, razrjeđivanje 1:1000), anti-p53 antitijelo (Abcam, UK, razrjeđivanje 1:500) i anti-ciklin D1 antitijela (Abcam, Velika Britanija, razrjeđivanje 1:500) preko noći na 4 ° C. Nakon tri puta isprana s TBST, membrana se inkubira s hren peroksidaza-konjugiranog sekundarna protutijela (razrjeđenje 1:2000, Boster, Kina) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ishod je vizualizirana sustav upijanjem detekcije ECL Plus Western prema uputama proizvođača. Anti-β-aktin (razrjeđivanje 1:1000, Boster Kina) antitijela djelovao kao unutarnje kontrole. Pregled

Mjerenje stanične proliferacije pregled

Utjecaj utišavanje AP-4 na proliferaciju stanica raka želuca nakon 48 sati transfekcije je mjerena brojanjem stanica Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, Kina), u skladu s uputama proizvođača. Ukratko, želučanih stanice raka su kultivirane u 96-jažica i transfektirane sa 20 nM kontrolne siRNA, AP-4 specifičnih iRNK. Nakon 48 sati, 10 ul CCK-8 reagensa je dodan u svaku jažicu, nakon 1 sata inkubacije na 37 ° C, Absorbcija mjerena na 450 nm. Relativna razina stanične proliferacije u svakoj skupini stanica izračunat je prema sljedećoj formuli: R = (A2-A1) /A2 x 100%, a P = A1 /A2 x 100%, u kojoj R je bila relativno inhibicijska brzina, a P je bila relativno proliferacija omjer rasta stanica; A1was Srednja vrijednost apsorbancije transfektiranih stanica; i A2 je srednja vrijednost apsorbancije od onih na kontrolnim stanicama bez ikakvog tretmana. Svi eksperimenti obavljeni su s 5 jažica po eksperimentu i ponovljeni najmanje tri puta. Pregled

staničnog ciklusa Test pregled

Stanice se prikupe 48 sati nakon transfekcije i fiksirane u 70% etanolu ledeno hladnom preko noći, ispere sa 1 × PBS, i obojene s propidij jodida (PI) (50 ug /ml) u 1 × PBS dopunjen s RNase (50 ug /ml) tijekom 30 minuta. Ispitivanja su provedena u tri primjerka za svaki uzorak i analize provedene su protočnom citometru (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) u skladu sa smjernicama proizvođača. Pregled

Test Chemo-osjetljivosti in vitro pregled

kao što je prethodno opisano, CCK-8 test je korišten za procjenu učinka kemoterapije osjetljivosti želuca stanica raka na citostatike. Ukratko, šest sati nakon transfekcije, medij je uklonjen i zamijenjen sa svježim medijem koji sadrži različite koncentracije antitumorskim lijekom (ADR, 5-FU ili cisplatina) i inkubirane 48 sati. Relativno inhibitorni stopa rasta stanica izračunat je prema formuli gore navedene. Pregled

Test apoptoze by Aneksina V-FITC i propidiumjodidom (PI) bojenje pregled

Da bi se procijenio stopu stanične apoptoze, apoptoza se kvantificira aneksin-V-FITC i propidij jodida dvostrukim bojanjem pomoću Aneksin-V /FITC kit (Antgene, Kina). Stanice su sakupljene u skladu s uputama proizvođača, 48 sati nakon transfekcije, ispere hladnim PBS, i suspendira u puferu za vezivanje, i stanice su inkubirane 30 minuta u mraku pri 4 ° C s Annexin V-FITC i PI u fosfatnom puferu i analizirani na protočnom citometru (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) u roku od 1 sat nakon bojenja. pregled

Statistička analiza pregled

Svi podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. Razlika među skupinama analizirane su jednosmjernom ANOVA i Student-Newman-Keuls (SNK) -Q testa pomoću SPSS 12.0 for Windows softver. Statistička značajnost je definiran kao * p < 0,05 i ** p. ≪ 0,01 pregled

Izvori pregled

Hvala Wu Ke Shi Liang, Deng Meizhou, Li objesiti i Li Wei za njihovu stručnu tehničku pomoć . pregled

• PLoS ONE: dugoročne rezultate i prognostički čimbenici želučane pacijenata oboljelih od raka mikroskopom peritonealnoj karcinomatoza
• PLoS ONE: Procjena ugroženosti rak želuca uzrokuje bakterija Helicobacter pylori Korištenje CagA sekvencu markera