PLoS ONE: Down reguliavimas AP-4 slopina proliferaciją, Skatina ląstelių ciklo arešto ir skatina apoptozę žmogaus skrandžio vėžys Cells

Anotacija

Fonas

AP 4 siejamas su pagrindinio spiralės -loop-helix leucinas-užtrauktukas pogrupį; ji kontroliuoja tikslinio geno ekspresiją, reguliuoja augimą, vystymąsi ir ląstelių apoptozę ir buvo susijęs Tumorigenesis. Mūsų ankstesni tyrimai parodė, kad AP 4 buvo dažnai ekspresija skrandžio vėžio ir gali būti susijęs su blogos prognozės. Šio tyrimo tikslas yra patikrinti, ar triukšmo slopinimo AP-4 gali pakeisti biologines savybes skrandžio vėžio ląsteles.

Metodai

Du konkretūs siRNAs Orientavimas AP 4 buvo suprojektuoti, susintetinti ir perkeltų į skrandžio vėžio ląstelių linijų ir normalus žmogaus gleivinės ląstelės. AP 4 išraiška buvo matuojamas realaus laiko kiekybine PGR ir Vakarų dėmė. Ląstelių proliferacija ir Chemoterapija jautrumas buvo aptikta CCK-8 tyrimą. Ląstelės ciklo tyrimas ir apoptozė tyrimas buvo atliekamas srauto citometre, o santykinė išraiška ląstelinio ciklo reguliavimo buvo aptikta realaus laiko kiekybine PGR ir Vakarų dėmė, išraiška dalyvaujančių apoptozė keliu veiksniai buvo nagrinėjami mRNR ir baltymų lygį.

rezultatai

AP-4 išraiška nutilo iki siRNAs transfekciją ir AP-4 triuškinantis poveikis truko nuo 24 iki 96 val. SiRNR tarpininkaujant triukšmo slopinimo AP-4 slopino ląstelių proliferaciją, sukeltas apoptozę ir jautrintus vėžio ląstelių priešvėžinių vaistų. Be to, raiškos lygis p21, p53 ir kaspazės-9 buvo didesnis tada, kai AP-4 buvo triuškinantis, bet nuo ciklino D1 išraiška, Bcl-2 ir Bcl-x _{L buvo slopinamas. Tai nesukėlė ląstelių ciklo areštą, kai AP 4 buvo triuškinantis į p53 defektas skrandžio vėžio ląstelių linijos Kato-III.}

Išvados

Šie rezultatai iliustruoja, kad genai yra nuslopinami AP-4 gali efektyviai slopino ląstelių proliferacija, sukėlė apoptozė ir įjautrintos vėžio ląstelių priešvėžinių vaistų in vitro rodo, kad AP 4 siRNAs tarpininkaujant duslintuvai turi galimą reikšmę žmogaus skrandžio vėžiui gydyti

nurodomoji dalis:. Liu x Zhang B guo Y, Liang Q, Wu C, Wu L, ir kt., (2012) žemyn-reguliavimas AP 4 slopina proliferaciją, Skatina ląstelių ciklo arešto ir skatina apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. PLoS vieną iš 7 (5): e37096. Doi: 10,1371 /journal.pone.0037096

redaktorius: Vladislav V. Glinskii, Misūrio universitetas-Columbia, Jungtinės Amerikos Valstijos,

Įstojo: Birželis 4, 2011 m Priėmė: Balandžio 18, 2012 m Paskelbta: Gegužės 16, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Liu et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Nors sergamumo ir mirtingumo rodikliai, susiję su skrandžio vėžiu palaipsniui sumažėjo pastaraisiais metais daugelyje pasaulio regionų [1], [2], skrandžio vėžys išlieka pasaulinė sveikatos našta, ir išlieka dažniausia vėžio mirčių su mažai gerinti ilgalaikį išlikimą. Efektyviausias gydymas skrandžio vėžio buvo visiškai chirurginis pašalinimas iš neoplastiniu audinio su D2 limfadenektomija. Be to palaikomoji chemoterapija ir radioterapija padėjo pagerinti prognozę. Nepaisant to, 5 metų išgyvenamumas buvo labai prastas [1], [3]. Daugiau nei vienas milijonas naujų atvejų buvo diagnozuota kiekvienais metais, ypač Rytų Azijoje, pavyzdžiui, Japonijoje, Korėjoje ir Kinijos. Šiose šalyse, skrandžio vėžys išlieka dažniausia vėžio mirčių, o tiksliau patogenezė lieka nežinoma [3].

Transkripcijos veiksniai yra svarbūs reguliavimo komponentai [4]. Jie priklausė Helix-kilpa-spiralės šeimos ir suvaidino svarbų vaidmenį ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją, ląstelių linijos nustatymo, saviraiškos intraceliulinės genetinės informacijos, ir kiti esminiai procesai [5]. Kaip pagrindinio Helix-kilpa-Helix leucinas-užtrauktukas (bHLH-LZ) pogrupio bHLH baltymų [6] nariui, įjungiant stipriklis privalomą baltymų 4 (AP-4) iš pradžių buvo nustatyta, kad mobiliojo baltymo, prijungto prie beždžionių virusas 40 (SV40) stipriklis ir aktyvuota virusinę vėlai genų transkripciją [7]. AP-4 yra ubiquitously išreikštas transkripcijos faktorius, ir gali kontroliuoti transkripcijos tinklus per korinio diferenciacijos formuojant homodimerami ir jungimosi prie simetrinio DNR sekos, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP 4 yra ligandas imunoglobulino-kapa promotoriaus El dėžutė elementų, kuris gali būti susijęs su imunodeficito ligomis [13], [14]. Be to, skirtingai nuo kitų žLH baltymų, AP 4 yra du papildomus baltymų Dimeryzacja motyvai, kurią sudaro leucinas pakartoti elementai LR1 ir LR2. Taigi, AP 4 pristato specialią trišalę Dimeryzacja struktūrą, o tai rodo, kad AP 4 gali sąveikauti su įvairių transkripcijos veiksnių [8], [14]. AP-4 reguliuoja kai kurių genų [9] išraiška, [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Pavyzdžiui, suaktyvina hMTIIA geno transkripciją ir dalyvauja žmogaus proenkephalin išraiška [22] Reglamentas, ir ji gali suvaidinti vaidmenį kasos egzokrininė genų šeimos [23] išraiška. Pastaruoju metu AP-4 raiška buvo pranešta gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio, krūties vėžio ir prostatos vėžio [9], [18], [24].

RNR interferencijos (RNRi) yra sekos konkretaus įrašo procesas inicijavo dvigrandę RNR [25], -transcriptional genų slopinimo, kuris gali sukelti specifinių ląstelių genai yra nuslopinami ir suteikti galingą atvirkštinės genetikos požiūriu analizuoti genų funkcijas tiek in vitro ir in vivo [26]. Šiuo metu plačiausiai naudojamas nukleorūgščių pagrindu specifinės sekos genų slopinimo molekulės buvo mažas trukdančių RNR [27], pavadinta siRNAs, kurį sudaro simetriškos per du aukštus apie 19-21 bazinių porų [28]. SiRNR metodas gali slopinti tikslinio geno ekspresiją su specifiškumo, efektyvumo ir ištvermės [29].

anksčiau pranešė, kad AP 4 buvo ekspresija skrandžio vėžiu ir kad ji gali būti susijęs su blogos prognozės [30]. Šioje studijoje, mes toliau nagrinėjo AP 4 funkciją žmogaus skrandžio vėžio ląstelių su RNR trukdžių.

Rezultatai

Specifinis siRNR orientacija AP-4 išraišką žmogaus skrandžio vėžio ląstelės ir žmogaus normalus gleivinės ląstelės

Jei įvertinti siRNA tarpininkaujant tyla AP-4 genų ekspresiją, kontrolės siRNR ir AP 4 konkretūs siRNAs buvo transfekuota į ląsteles 24 h, 48 h poveikį, 72 val ir 96 val. Į apačią reguliavimo išraiška AP 4 geno veiksmingumas buvo aptikta realaus laiko kiekybine PGR ir Vakarų dėmė. Kaip parodyta 1 paveiksle, AP 4 konkretūs siRNAs galėtų efektyviai slopina genų transkripciją ir vertimą. MRNR ir baltymų lygiai AP-4 buvo mažėjo AP 4 siRNA transfekciją grupės, bet ne į kontrolės siRNA (1 paveikslas). SiRNAs sukeltas slopinimas AP-4 išraiškos galėtų būti aptikta per 24 valandas po transfekciją. Tačiau slopinimo koeficientas sumažėjo 72 valandas po transfekciją. Efektyviausias laikas taškas buvo tarp 48 h iki 72 h slopinti išraiška AP-4. Santykiniai lygiai mRNR dalimi, transkriptų žymiai sumažėjo beveik 90% per siRNR-1 grupei, ir 95% į siRNR-2 grupės informacija. Nebuvo statistinis reikšmingumas tarp siRNAs grupės ir kontrolinės grupės.

Down reguliavimo AP-4 išraiškos slopino ląstelių proliferaciją ir įjautrintos žmogaus skrandžio vėžio ląsteles priešvėžinių vaistų

Jei išnagrinėti poveikį AP-4 konkrečios siRNAs dėl ląstelių proliferaciją ir chemotaksio jautrumą vėžinių ląstelių, 20 nM AP "-4 konkrečios siRNAs arba kontrolės siRNR buvo transfekuota ir ląstelių proliferacijos buvo nustatomas pagal CCK-8 tyrimą 48 valandas po to, kai transfekciją. Mes nustatėme, kad triuškinantis AP 4 gali slopinti skrandžio vėžio ląstelių linijų SGC7901 ir AGS (2 paveikslas) platinimu, bet ne įprastu gleivinės ląstelių linijos GES-1, lyginant su kontroline siRNA transfekciją per 48 valandas (2 paveikslas). Šie rezultatai parodė, kad AP 4 siRNAs susilpnintas ląstelių proliferaciją skrandžio vėžio ląsteles in vitro. Be to, mes tyrė AP-4 vaidmenį Chemoterapija jautrumo žmogaus skrandžio vėžio ląstelių reglamentavimo. Mes palyginti su narkotikų jautrumą AP-4 siRNAs su ta kontrolės siRNA ar juoktis ląstelių ir nustatė, kad santykiniai slopinimo normos AP-4 konkrečiais siRNAs buvo gerokai didesnis nei kontrolinės siRNA ar juoktis ląstelių (p < 0,0001) (2 pav ). Be to, AP 4 siRNAs gerokai padidinti ląstelių ADR, 5-FU arba cis-plantinum gydymo jautrumą dviejų skirtingų dozių (2 paveikslas), tai rodo, kad žemyn reguliavimo AP 4 gali turėti teigiamą poveikį į jautrumas chemoterapija.

Triukšmo slopinimo AP-4 išraiška sukelta ląstelių ciklo suėmimo ir moduliuojama su p53, p21 ir ciklino D1
išraišką

tirta AP-4 poveikį ląstelių ciklo progresavimo , Žmogaus skrandžio vėžio ląstelės buvo transfekuota su 20 nM kontrolės siRNA, ir AP-4 konkrečios siRNAs 48 h, atitinkamai, o po to propidiumo jodido dažymo ir tėkmės citometrijos analize ląstelės ciklo. Nors ląstelės transfektuotose kontrolės siRNA progresavo per įvairius etapus ląstelės ciklo, ląstelių transfektuotose AP-4 konkrečiais siRNAs rodomas žymiai didesnį dažnį ląstelių tuo G0 /G1 etapų (SGC7901 /siRNR-1: 68,81%; SGC7901 /siRNR-2: 68.97%; AGS /siRNR-1: 61,92%; AGS /siRNR-2: 63,67%) ir mažesnis dažnis ląstelių ne S fazę (SGC7901 /siRNR-1: 29,57%; SGC7901 /siRNR-2: 29,84%; AGS /siRNR-1: 24,36%; AGS /siRNR-2: 22,91%). Ląstelių procentas G0 /G1 etapais ląstelėje transfekuota AP 4 siRNAs buvo gerokai didesnis nei juoktis ląstelių (SGC7901: 54,65%; MAA: 48.44%) (p < 0,05) arba kontroliuoti siRNA (SGC7901 /valdymo siRNR: 52,18%; AGS /kontrolė siRNR: 50.38%) (3 pav.) Todėl transfekcija su AP 4-konkrečiais siRNAs sukelta ląstelių ciklino suėmimą tuo G0 /G1 fazės.

AP 4 konkretūs siRNAs sukeltas ląstelės ciklo blokas buvo toliau tiriamas stebint AP-4 konkretūs siRNAs gydymo poveikį nuo santykinio išraiška ląstelinio ciklo reguliavimo: naviko slopinamojo p53, kad ciklino priklauso kinazės inhibitorius p21, ir G (1) -phase konkrečių ciklino D1, kuris kritiškai reguliatoriai ląstelės ciklo ir platinimu. Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekcijq žmogaus skrandžio vėžio ląstelės buvo renkami realaus laiko PGR ir imunoblotas analizė. Transfekcijq su AP 4 konkrečiais siRNAs gali iki-reguliuoti p53 ir p21 baltymo ekspresiją. Moduliuojančius poveikis AP-4 siRNAs buvo didesnis nei kontrolės siRNA (4 paveikslas) (p < 0,01). Kaip ir tikėtasi, cikloniniai D1 buvo žemyn reguliuojama palyginti su kontroline siRNA grupę ir juoktis grupę (4 paveikslas) (p < 0,01). Šie duomenys toliau palaikė hipotezę, kad triukšmo slopinimo į AP-4 išraišką pakeitė kitų ląstelių dviračių reguliavimo išraišką, sukeltas ląstelės ciklo areštas ir slopino žmogaus skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją

aptikimas apoptozės ir veiksnius; apoptozę kelias

Jei kiekybiškai AP 4 konkrečiais siRNAs poveikį apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląsteles, aneksino-V PI dažymo tyrimai buvo naudojamas kartu su tėkmės citometrijos metodą. Ląstelės buvo tamsintas su aneksinu-FITC /PI ir įkrautų į apatiniame dešiniajame (LR) ir viršutiniame dešiniajame (UR) ketvirčiai. buvo laikomi ląstelės LR ir UR būti anksti aprotoninis (aneksinas ^{+ /PI -) ir vėlyvas aprotoninis (aneksinas + /PI +), atitinkamai. Ląstelės LL (Žemutinė kairėje) ir UL (viršutinis kairysis) kvadrantai buvo laikomas gyvas ir nekrozės atitinkamai. Kiek apoptozės buvo išreikštas suma iš viso iš LR ir UR ketvirčiai procentais. Apoptozės normos buvo parodė 5 pav paveiktų ląstelių su AP-4 siRNAs parodė daugiau Apoptozinės ląstelės (SGC7901 /siRNR-1: 14,0%; SGC7901 /siRNR-2: 11.5%; AGS /siRNR-1: 20,1%; AGS /siRNR-2: 23,6%), nei neigiamas (SGC7901 /kontrolės siRNA: 5,5%; AGS /kontrolė siRNR: 6,7%) (p < 0,05) ir tuščias (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p < 0,05) , Šie rezultatai parodė, kad AP 4 konkretūs siRNAs galėjo sukelti apoptozę šių ląstelių.}

Be to, mes išnagrinėjo dalyvaujančių apoptozė keliu su realaus laiko PGR iRNR lygio veiksnių, tokių kaip BCL-2 raiška Bcl-x _{L, kaspazės-9, kaspazės-8 ir Bax. Ji parodė, kad parbloškimo AP-4 gali iki-reguliuoti Baspase-9 raišką žmogaus skrandžio vėžio ląstelių, ir moduliuojančius poveikis AP-4 siRNAs buvo didesnis nei kontrolės siRNA (6 paveikslas) (p < 0,01). Iš BCL-2 ir BCL-X L išraiška sumažėjo lyginant su kontrole siRNA ar juoktis grupės (6 paveikslas) (p < 0,01). Šie duomenys toliau palaikoma, kad AP-4 išraiškos triukšmo slopinimo buvo apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Tačiau kaspazės-8 ir Bax išraiška yra skirtingi skirtingų ląstelių linijų po transfekciją. Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekciją, kaspazės-8 ir Bax buvo per išraiška AGS ląsteles. Į SGC7901 ląstelių, iš Bax išraiška padidėjo, bet kaspazės-8 išraiška padidėjo tik į siRNR-1 grupei. Be siRNA-2 grupės, kaspazės-8 išraiška nebuvo reikšmingas paveikta (6 paveikslas).}

AP-4 slopinimo gali reguliuoti ląstelių ciklą ir ląstelių apoptozę tiek p53 priklausoma ir nepriklausoma-manieros

Jei norite patikrinti, ar up-reguliavimas p53 AP-4 triuškinantis skrandžio vėžio ląstelių kritiškai į ląstelės ciklo arešto, Kato-III ląstelių, iš p53 defektų skrandžio vėžio ląstelių linijos rūšies vaidmuo buvo naudojama įvertinti AP priklausomybę -4 nokdaunas poveikis p53. Mes nustatėme, kad AP 4 triuškinantis į AGS su laukinio tipo p53 ar SGC7901 su mutantas p53 gali indukuoti ląstelių ciklo suėmimą, tačiau šis reiškinys nebuvo pastebėta Kato-III ląstelių (7 paveikslas), ląstelių procentas G0 /G1 etapus turėjo 57.82% (siRNR-1), 59.05% (siRNR-2), 59.59% (kontrolė siRNA) ir 59.06% (natūralaus modelio). Tie, nurodė, kad triuškinantis AP 4 gal reguliuoti ląstelių ciklą naudojant P53-P21 keliu. Apoptozė gyventojų taip pat buvo aptikta Kato-III ląstelių su aneksinu-FITC ir PI dažymo. Rezultatai parodė, kad apoptozės greičiui Kato-III ląstelių, transfekuotų su AP-4 siRNAs (siRNR-1: 7,9%; siRNR-2: 9,2%) buvo didesnis nei kontrolės siRNA (3,3%) (p < 0,05) ir maketas ląstelės (3,5%) (p < 0,05), bet mažesniu mastu nei tai buvo padaryta AGS (p < 0,05) ir SGC7901 ląstelių (p < 0,05), nurodant, kad triukšmo slopinimo AP-4 gali sukelti apoptozę skrandžio vėžio ląstelių per tiek p53 priklausoma ir nepriklausoma-manieros.

Diskusijos

Genų ekspresija yra esminis ir labai konservatyvių procesas. Transkribavimas, pirmas žingsnis genų ekspresiją, atlieka struktūriškai užkonservuoti DNR priklausoma RNR polimerazės, o dėl į RNR molekulės sintezei iš DNR šabloną [31]. Transkripcijos veiksniai, formos transkripcija inicijavimas kompleksas su RNR polymeras II, dalyvauti transkripcijos pradžios procesą reguliuoti genų ekspresiją. Jie gali vaidinti svarbų vaidmenį pertvarkant, Tumorigenesis, naviko progresavimo ir metastazių reguliuojant transkripciją ir todėl genų ekspresiją [32], [33], [34]. Transkripcijos faktorius AP 4, priklausanti sparčiai auganti įmonių grupė žLH baltymų [8] dalyvauja diferenciacijos ir ląstelių proliferacijos [35], [36], [37], [38], [39], veikia ląstelių ciklo įvykius ir apoptozė, reguliuoja ir kontroliuoja tam tikrą genų ekspresiją [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Neseniai, ji buvo pranešė, kad AP-4 buvo iki-reguliuojamas gaubtinės žarnos karcinomos, krūties vėžio ir prostatos vėžio [9], [18], [24]. Be to, AP 4 teigiamas išraiška nurodė prastą prognozę su reikšmingumo per klasę, mazgo statuso arba dydžio ER + krūties vėžio ir galimo asociacijos Chemoterapija jautrumo [40]. Mūsų anksčiau mokytis, mes nustatėme, kad AP-4 išraiška buvo ekspresija ir ji bendrai susijusių su blogos prognozės [30]. Ji gali būti molekulinis žymuo diagnozės ir prognozės skrandžio vėžio. Šioje studijoje ,. Mes sukūrėme dvi AP 4 konkrečius siRNAs slopina AP-4 geno žmogaus skrandžio vėžio ląstelių išraiška. Jie buvo gerai žinomi ir perkeltų į ląsteles sukelti Griaunamąjį AP-4 genų ekspresiją. Mes nustatėme, kad labiausiai stiprus laikas taškas slopina AP-4 išraišką skrandžio vėžio ląstelės buvo 48 val ir 72 val po transfekciją. Taigi, mes pasirinkome buvęs toliau vykdyti atitinkamą egzaminą.

Anksčiau ji buvo įrodyta, kad transkripcijos faktorius AP-4, skirtingai nuo kitų žLH baltymų, esančios dvi skirtingas leucino pakartoti elementus, taip pat tiesioginis dimerizacija ir leisti selektyvus kompleksas formavimas visur AP 4 baltymų [8] [41].

AP 4 galėtų atlikti svarbų vaidmenį moduliavimo ląstelių funkcijas per reguliavimo genų, dalyvaujančių virusinės gamybos [7], [16, ], [22], [42], [43], ląstelių augimas ir išgyvenimo [9], [17], [23], [44], imuninis atsakas [14], [41], [45], ir angiogenezę [21]. Petras Jungas et al nustatė, kad AP 4 gali koduoti c-Myc-indukuojamą represorių slopinti P21 išraišką [9], ir turbūt suvaidino svarbų vaidmenį tarpininkavimo dauginimosi veiklą c-MYC [10]. Be to, AP-4 įtakos jautrumą apoptozės, reguliuojant kaspazės-9 [17] išraiška. Šiame tyrime mes nustatėme, kad žemyn reguliavimas AP-4 slopino žmogaus skrandžio vėžio ląsteles in vitro platinimu. Platinimas slopinimo santykis AP-4 konkrečiais siRNAs buvo gerokai mažesnis nei ląstelių transfektuotose valdymo siRNA ar juoktis grupei.

Chemoterapija yra vienas svarbus strategija skrandžio vėžiui gydyti, tačiau jis dažnai nepavyksta, nes atsparumas priešvėžinių vaistų. Buvo pranešta, kad AP 4 teigiamas išraiška buvo galbūt susijęs su Chemoterapija jautrumo [40]. Mes kitą tyrė AP-4 vaidmenį chemotaksio jautrumą žmogaus skrandžio vėžio ląstelių reguliavimo ir nustatė, kad AP-4 slopinimo gali žymiai padidinti šių ląstelių į ADR, 5-FU arba cis-plantinum gydymo jautrumą, tai rodo, kad AP-4 slopinimo gali turėti teigiamą poveikį Chemoterapija jautrumą.

Be to, triukšmo slopinimo AP-4, sukeltas ląstelės ciklo suėmimas ne G0 /G1 etapų analizė potencialus mechanizmų grindžiantis poveikį AP-4 slopinimo slopinimu žmogaus skrandžio vėžys ląstelių proliferacijos buvo būdinga tai, kad ląstelės ciklo susijusių reguliavimo išraiška. Mes nustatėme, kad žemyn reguliavimo AP 4 išraiškos slopino ciklino D1 išraišką, bet iki-sureguliavo p53 ir p21 išraiška. p53 ir p21 buvo hipotezę, kad būtų neigiamas reguliatorius ląstelių ciklo ir proliferacijos [46], [47], kita vertus, nuo ciklino D1 skatinamas progresavimą per G _{1-S etapo ląstelės ciklo [48 ]. Žemyn reguliuojama išraiška AP-4, p21 ir p53 tuo tarpu gali padaryti ląstelės ciklo arešto sukėlė triuškinantis AP-4 išnykimą. Šie rezultatai sutampa su modeliu, kuriame AP 4 indukuoja ląstelės ciklo suėmimą reguliuojant ląstelių ciklo reguliavimo, pavyzdžiui, p53, p21 ir ciklino D1 išraiška.}

apoptozę arba programuojamą ląstelių mirtį, yra žinoma dalyvauti įvairių biologinių procesų dviem pagrindiniais apoptozinių kelius, mitochondrijų (vidinės) kelio ir mirties receptorių (išorinė) rūšyse [49]. Mes nustatėme, kad triukšmo slopinimo AP-4 išraišką trigged ląstelių apoptozę mūsų eksperimentas, kuris parodė, kad AP 4 slopino apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląsteles.

Mūsų eksperimentas, didinant lygius kaspazės-9 ir žemyn reglamento iš BCL-2 ir BCL-x _{L buvo aptikta žmogaus skrandžio vėžio ląsteles, nurodant, kad AP 4 aktyvintos tiek esminių ir neesminių kelius triuškinantis į apoptozę vėžinių ląstelių. [49], [50]}

Apibendrinant, duomenys rodo, kad RNRi tarpininkaujant žemyn reguliavimo transkripcijos faktorius AP-4 efektyviai slopino ląstelių proliferaciją, nurodė, ląstelės ciklo arešto, sukėlė apoptozę ir sustiprintas Chemoterapija jautrumą žmogaus skrandžio vėžio ląstelių su sumažėjo išraiška ciklino D1, BCL-2 ir BCL-x _{L ir aktyvuota p21, p53 ir kaspazės-9 raiškos, kuris pasiūlė AP 4 gali būti onkogeno vaidina svarbų vaidmenį Tumorigenesis , Nors tikslus mechanizmas šį vaidmenį, turi būti toliau tiriamas, AP-4specific-siRNAs gali būti potencialių reikšmių kaip naujus terapinių agentų, reglamentuojančio žmonėms skirtus skrandžio vėžio.}

Medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linija ir ląstelių kultūra

Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas, AGS su laukinio tipo p53, SGC7901 su mutantas p53 (gauta iš Wuhan universiteto) ir Kato-III su p53 genomo ištrynimą (Zhiyan Bio Technology Co., Šanchajus) buvo auginamos DMEM vidutinio arba RPMI1640 terpė (Invitrogen), kurių sudėtyje yra su 10% vaisiaus galvijų serumo (Invitrogen), penicilinui (100 V /ml) ir streptomicino (100 mikrogramų /ml). Ląstelės buvo palaikoma 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje 5% CO _2.

Specifinis siRNA ir transfekcijos

kDNR seka AP-4 geno buvo gautas iš GENBANK ( NM_003223) ir skirtos sekas dviem 21-nukleotidų skirtingų siRNAs buvo sukurta ir chemiškai susintetinti (Qiagen Vokietija). Nukleotidų sekos buvo taip: siRNR-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(pojūtis), ir 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (Priešprasminis). siRNR-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(pojūtis), ir 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (Priešprasminis). Allstars neigiamos kontrolės siRNA (Qiagen Vokietija) buvo naudojami kaip plakta siRNA kontrolę. Ląstelės buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse ir siRNAs buvo pernešta į kultūros ląstelių su Lipofectamine 2000 (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas.

Realaus laiko kiekybine PGR

Viso RNR gavyba buvo atliktas naudojant RNAiso Plus (TAKARA, Japonija) pagal gamintojo protokolą. Į kDNR iš viso RNR buvo susintetinti naudojant PrimeScript® RT reagento komplektas (TAKARA, Japonija). MRNR ekspresijos buvo įvertintas realaus laiko PGR apie ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapūras) su greitu SYBR Žalioji PGR reagentus. GAPDH buvo taikomas vidaus kontrolės. Reagentų koncentracija buvo pakoreguotos, kad būtų pasiektas galutinis tirpalo tūris būtų 20 ml, su 2 mikrol atvirkštinio transkripcija produktą, 10 įxL Greitas SYBR® Žaliosios Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija), ir 0,5 įxL 10 mkm priekį ir atvirkštinės pradmenis. Reakcija buvo atlikti 45 amplifikaoijos ciklus 95 ° C temperatūroje 3 s ir 60 ° C temperatūroje 30 s. Šie gruntai buvo sukurta (Table.1). PGR pradmenys buvo sukurti Primer 5.0 ir sprogimo paieškoje patikrinti specifiką. Gruntas sekas, yra išvardyti lentelėse 1. Rezultatai buvo skaičiuojami naudojant 2 ^{-ΔΔCt metodą.}

Vakarų dėmė

Baltymai ekstrahuojamas baltymų išskyrimo rinkinys (Beyotime, Kinija) pagal į kryptimi. Baltymas buvo praskiestas iki 3 mikrogramų /mikrol, ir buvo atskirta 10% SDS-PAGE, perkelti į polivinilideno difluoridą (PVDF) membranomis (Millipore, JAV), ir tada buvo užblokuotas 5% ne-riebalų miltelių pieno TBST 1 valandą kambario temperatūroje. Imunoblotas buvo atliekama naudojant anti-AP-4 antikūnas (Sigma-Aldrich, Šanchajus, skiedimas 1:1000), anti-P21 antikūnas (Sigma-Aldrich, Šanchajus, skiedimas 1:1000), anti-P53 antikūnas (Abcam, Jungtinė Karalystė, skiedimas 1:500) ir anti-ciklino D1 antikūnas (Abcam, Jungtinė Karalystė, skiedimas 1:500) per naktį 4 ° C temperatūroje. Po to, kai tris kartus skalaujamas TBST, membrana buvo inkubuojami su krienų peroksidazės-konjuguoto antriniai antikūnai (skiedimo 1:2000, Boster, Kinijos) 1 valandą kambario temperatūroje. Rezultatas buvo regimos ECL Plius Imunoblotingo aptikimo sistema pagal gamintojo instrukcijas. Anti-β-aktino (skiedimo 1:1000, Boster, Kinija) antikūnų veikė kaip vidaus kontrolės.

Matavimas ląstelių proliferaciją

nutildyti poveikis AP 4 dėl skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją po 48 valandų transfekciją buvo matuojamas Mobilusis Skaičiavimo KIT-8 (CCK-8) (Beyotime, Kinija), pagal gamintojo nurodymus. Trumpai, skrandžio vėžio ląstelės buvo auginamos 96-duobučių lėkštelėse ir transfekuota su 20 nM kontrolės siRNA, AP-4 konkrečiais siRNAs. Po 48 valandų, 10 mikrol, CCK-8 reagentu buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį, po to, kai 1 valandą inkubacijos 37 ° C, ir optinio tankio, išmatuoto esant 450 nm bangos ilgiui. Santykiniai lygiai ląstelių proliferacijos kiekvienoje ląstelių grupės buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę: R = (A2-A1) /A2 × 100% ir P = A1 /A2 × 100%, kuriame R buvo palyginti slopinantis norma ir P buvo palyginti platinimu santykis ląstelių augimą; A1was reiškia absorbcijos vertę perkeltų ląstelių; ir A2 buvo vidutinis sugeriamumo vertė untransfected kontrolinių ląstelių be jokių narkotikų gydymo. Visi eksperimentai buvo atlikti su 5 šulinių per eksperimentą ir kartojamas mažiausiai tris kartus.

Mobilusis ciklas Analizės

Ląstelės buvo nuimta 48 valandas po transfekciją ir nustatytas 70% ledinio etanolio naktį, plauti 1 × PBS ir tamsintas su propidiumo jodido (PI) (50 mikrogramai /ml) 1 × PBS papildyta RNaze (50 mikrogramų /ml) 30 min. Bandymai buvo atliekami tris kartus, kiekvieno mėginio ir analizė buvo atliekama srauto citometro (FACS CantoII, BD biologijos mokslų, JAV) pagal gamintojo rekomendacijas.

chemo jautrumo bandymas in vitro

kaip aprašyta anksčiau, CCK-8 tyrimas buvo naudojamas įvertinti efektą chemotaksio jautrumą skrandžio vėžio ląstelių į antivėžiniai. Trumpai tariant, šešias valandas po to, kai transfekciją, vidutinės buvo pašalintas ir pakeistas su šviežia terpę, turinčią įvairių koncentracijų anti-naviko narkotikų (ADR, 5-FU arba cis-platinos) ir inkubuojama 48 valandas. Santykinai slopinantis norma ląstelių augimą buvo apskaičiuojamas pagal pirmiau nurodytą formulę.

Apoptozę tyrimas pagal aneksino V-FITC ir propidiumo jodido (PI) dažymo

Jei įvertinti ląstelių apoptozės norma, apoptozė buvo įvertintas aneksinas-V-FITC ir propidiumo jodido dvigubo dažymo, naudojant aneksinas-V /FITC komplektas (Antgene, Kinija). Ląstelės buvo surinkti pagal gamintojo instrukcijas praėjus 48 valandoms po transfekciją, nuplauti šaltu PBS, ir suspenduotos privalomas buferio, ir tada ląstelės buvo inkubuojamos 30 minučių tamsoje, esant 4 ° C temperatūroje, turintis ir prie aneksino V-FITC ir PI fosfatinis buferis, ir analizuojami srauto citometro (FACS CantoII, BD biologijos mokslų, JAV) per 1 valandą po dažymo.

Statistinė analizė

Visi duomenys buvo parodyta, kaip vidurkis ± SD. Skirtumas tarp grupių buvo analizuojami vieną pusę ANOVA ir studentą Newman-Keuls (SNK) -Q bandymo naudojant SPSS 12.0 for Windows programinę įrangą. Statistinis reikšmingumas buvo apibrėžtas kaip * p < 0,05 ir ** P <. 0,01

Padėka

Mes dėkojame Wu Ke, Shi Liang Dan Meizhou, Li Hang Li Wei savo ekspertų techninę pagalbą .

• PLoS ONE: ilgalaikių rezultatų ir prognostiniai veiksniai skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, Mikroskopinis peritoninės karcinomatoze
• PLoS ONE: Rizikos vertinimas Skrandžio vėžys, sukeltas Helicobacter pylori Naudojant CagA seka Žymekliai