PLOS ONE: Down-règlement de l'AP-4 inhibe la prolifération, induit un arrêt du cycle cellulaire et favorise l'apoptose dans le cancer gastrique humain Cells

Résumé

Contexte

AP-4 appartient à l'hélice de base -loop hélice leucine zipper sous-groupe; il contrôle l'expression du gène cible, régule la croissance, le développement et l'apoptose des cellules et a été impliquée dans la tumorigenèse. Nos études antérieures ont indiqué que AP-4 a été fréquemment surexprimé dans les cancers de l'estomac et peut être associée au mauvais pronostic. Le but de cette étude est d'examiner si le silençage de l'AP-4 peut modifier les caractéristiques biologiques des cellules de cancer gastrique.

Méthodes

Deux ARNsi spécifiques ciblant AP-4 ont été conçus, synthétisés et transfectées dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et les cellules de la muqueuse normale humaine. AP-4 expression a été mesurée avec PCR en temps réel quantitative et Western blot. la prolifération cellulaire et la chimio-sensibilité ont été détectées par dosage CCK-8. analyse du cycle cellulaire et l'analyse de l'apoptose ont été réalisées par le cytomètre de flux et de l'expression relative des régulateurs du cycle cellulaire ont été détectés en temps réel par PCR quantitative et Western blot, l'expression des facteurs impliqués dans la voie de l'apoptose ont été examinés dans l'ARNm et des protéines.

Résultats

l'expression de l'AP-4 a été réduit au silence par la transfection des ARNsi et les effets de l'AP-4 knockdown a duré 24 à 96 heures. Le silençage médié par ARNi de l'AP-4 a supprimé la prolifération cellulaire, l'apoptose induite par les cellules cancéreuses et sensibilisées aux médicaments anticancéreux. En outre, le niveau de p21, p53 et l'expression de la caspase-9 a été augmentée lorsque l'AP-4 a été knockdown, mais l'expression de la cycline D1, Bcl-2 et Bcl-x _{L a été inhibée. Il n'a pas provoqué arrêt du cycle cellulaire quand AP-4 a été knockdown à défaut de p53 lignée cellulaire de cancer gastrique Kato-III.}

Ces résultats Conclusions montré que l'inactivation de gène de l'AP-4 peuvent efficacement la prolifération cellulaire inhibée, déclenché l'apoptose et les cellules cancéreuses sensibilisées aux médicaments anticancéreux in vitro, ce qui suggère que le silençage AP-4 siRNA médiation a une valeur potentielle dans le traitement du cancer gastrique humain

Citation:. Liu X, Zhang B, Guo Y, Liang Q, Wu C, Wu L, et al. (2012) vers le bas-règlement de l'AP-4 inhibe la prolifération, induit un arrêt du cycle cellulaire et favorise l'apoptose dans les cellules de cancer gastrique humain. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10.1371 /journal.pone.0037096

Editeur: Vladislav V. Glinskii, Université de Missouri-Columbia, États-Unis d'Amérique

reçues: 4 Juin 2011; Accepté le 18 Avril 2012; Publié: 16 mai 2012 |

Droit d'auteur: © 2012 Liu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Bien que les taux d'incidence et de mortalité associés au cancer gastrique ont progressivement diminué ces dernières années dans la plupart des régions du monde [1], [2], le cancer gastrique reste un problème de santé dans le monde entier, et reste la cause la plus commune du cancer décès liés avec peu d'amélioration de la survie à long terme. Le traitement le plus efficace du cancer de l'estomac a été complètement l'élimination chirurgicale du tissu néoplasique avec D2 lymphadénectomie. En outre la chimiothérapie et la radiothérapie adjuvante ont aidé à améliorer le pronostic. Malgré cela, la survie à 5 ans est restée très faible [1], [3]. Plus d'un million de nouveaux cas ont été diagnostiqués chaque année, en particulier en Asie de l'Est, comme le Japon, la Corée et la Chine. Dans ces pays, le cancer gastrique reste la cause la plus fréquente de décès liés au cancer, et la pathogenèse précise demeure inconnue [3].

Les facteurs de transcription sont des éléments régulateurs importants [4]. Ils appartiennent à la famille hélice-boucle-hélice et ont joué un rôle important dans la prolifération et la différenciation cellulaire, la détermination de la lignée cellulaire, l'expression de l'information génétique intracellulaire, et d'autres processus essentiels [5]. En tant que membre du sous-groupe de base hélice-boucle-hélice de leucine fermeture à glissière (bHLH-LZ) des protéines bHLH [6], l'activation renforçateur protéine de liaison 4 (AP-4) a été initialement identifiée comme étant une protéine cellulaire qui se lie au virus simien 40 (SV40), un amplificateur et une activation de la transcription des gènes tardifs viraux [7]. AP-4 est un facteur de transcription exprimé de manière ubiquitaire et peut contrôler les réseaux de transcription lors de la différenciation cellulaire par la formation d'homodimères et de se lier à la séquence d'ADN symétrique, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 est un ligand pour le promoteur d'immunoglobuline kappa éléments E-box, qui peut être impliqué pour les maladies d'immunodéficience [13], [14]. En outre, contrairement à d'autres protéines HLH, l'AP-4 contient deux motifs de dimérisation de protéine supplémentaires constituées par des éléments répétitifs leucine LR1 et LR2. Par conséquent, l'AP-4 présente une structure tripartite spécifique de dimérisation, ce qui indique que AP-4 peut interagir avec une grande variété de facteurs de transcription [8], [14]. AP-4 régule l'expression de certains gènes [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Par exemple, il active la transcription du gène hMTIIA et participe à la régulation de l'expression proencéphaline humaine [22], et il peut jouer un rôle dans l'expression de la famille du gène pancréatique exocrine [23]. Récemment, la surexpression de l'AP-4 a été signalé dans le cancer du cancer colorectal, le cancer du sein et de la prostate [9], [18], [24].

L'interférence ARN (ARNi) est un processus de séquence poste spécifique silençage génique -transcriptional initiée par ARN double brin [25], ce qui peut conduire à l'inactivation du gène cellulaire spécifique et fournir une approche puissante de génétique inverse pour analyser les fonctions des gènes à la fois in vitro et in vivo [26]. Actuellement molécules de gènes taire les plus largement utilisés à base d'acide nucléique spécifique de séquence étaient petits ARN interférents [27], siRNA nommés, qui se compose de duplex symétriques de 19-21 paires de bases [28]. La méthode de siRNA pourrait inhiber l'expression du gène cible avec une spécificité, l'efficacité et l'endurance [29].

Nous avons signalé précédemment que l'AP-4 a été surexprimé dans le cancer gastrique et qu'il peut être associé avec le mauvais pronostic [30]. Dans la présente étude, nous avons examiné en outre la fonction AP-4 dans la cellule de cancer gastrique humain avec l'interférence ARN.

siRNA spécifique de

Résultats ciblant l'expression AP-4 dans les cellules cancéreuses gastriques humaines et humaine les cellules de la muqueuse normale

Afin d'évaluer l'effet du silence ARNsi médiation de l'expression de l'AP-4 gène, le siRNA contrôle et AP-4 ARNsi spécifiques ont été transfectés dans les cellules pendant 24 h, 48 h, 72 h et 96 h. L'efficacité de l'expression de la régulation négative du gène de l'AP-4 a été détectée par PCR en temps réel quantitative et Western Blot. Comme on le voit sur la figure 1, l'AP-4 ARNsi spécifiques peuvent inhiber efficacement la transcription des gènes et la traduction. Les niveaux de l'AP-4 ARNm et la protéine ont diminué avec l'AP-4 groupe de transfection de siRNA mais pas dans le siRNA contrôle (figure 1). La suppression induite par ARNsi de l'AP-4 expression n'a pu être détectée dans les 24 heures après la transfection. Cependant, le taux d'inhibition a diminué de 72 heures après la transfection. Le point de temps le plus efficace était de 48 h à 72 h dans l'expression suppress de l'AP-4. Les niveaux relatifs de transcription d'ARNm significativement diminué de près de 90% de l'ARNsi-1 du groupe, et à 95% dans l'ARNsi-2 groupe. Il y avait une signification statistique entre les siRNA et le groupe de contrôle.

Down-régulation de l'AP-4 expression inhibé la prolifération cellulaire et sensibilisé les cellules cancéreuses gastriques humaines aux médicaments anticancéreux

Pour examiner l'effet de AP-4 ARNsi spécifiques sur la prolifération cellulaire et la chimio-sensibilité des cellules cancéreuses, 20 nM de l'AP-4 ARNsi spécifiques ou d'ARNsi de contrôle ont été transfectées et la prolifération cellulaire a été déterminée par la CCK-8 essai 48 heures après la transfection. Nous avons constaté que knock-down AP-4 peut inhiber la prolifération de lignées cellulaires de cancer gastrique SGC7901 AGS (figure 2), mais pas dans la lignée cellulaire de la muqueuse normale GES-1 par rapport à la transfection de contrôle d'ARNsi en 48 heures (figure 2). Ces résultats indiquent que l'AP-4 ARNsi atténue la prolifération cellulaire de cellules de cancer gastrique in vitro. En outre, nous avons étudié le rôle de l'AP-4 dans la régulation de la chimio-sensibilité des cellules cancéreuses gastriques humaines. Nous avons comparé la sensibilité aux médicaments de l'AP-4 siRNA avec celle de siRNA de contrôle ou de cellules simulées et constaté que les taux d'inhibition relative des AP-4 siRNA spécifiques ont été significativement plus élevé que celui de siRNA contrôle ou de cellules simulées (p < 0,0001) (figure 2 ). En outre, AP-4 siRNA amélioré de façon significative la sensibilité des cellules à l'ADR, le 5-FU ou le traitement cis-Plantinum à deux différemment doses (figure 2), ceux-ci suggère que la régulation de l'AP-4 peut avoir un effet bénéfique dans la sensibilité à la chimiothérapie.

silençage de l'expression induite par arrêt du cycle cellulaire AP-4 et modulé l'expression de p53, p21 et la cycline D1

l'effet de l'AP-4 sur la progression du cycle cellulaire a été étudiée . les cellules cancéreuses gastriques humaines ont été transfectées avec 20 nM de siRNA contrôle, et l'AP-4 ARNsi spécifiques pendant 48 h, respectivement, suivies par l'iodure de propidium et l'analyse de cytométrie de flux du cycle cellulaire. Tandis que les cellules transfectées avec l'ARNsi de contrôle progressent à travers les différentes phases du cycle cellulaire, les cellules transfectées avec AP-4 ARNsi spécifique affiché fréquence significativement plus élevée des cellules dans les phases G0 /G1 (SGC7901 /ARNsi-1: 68,81%; SGC7901 /ARNsi-2: 68,97% AGS /ARNsi-1: 61,92%; AGS /ARNsi-2: 63,67%) et une faible fréquence des cellules à la phase S (SGC7901 /ARNsi-1: 29,57%; SGC7901 /ARNsi-2: 29,84%; AGS /siRNA-1: 24,36%; AGS /siRNA-2: 22,91%). Le pourcentage de cellules à phases G0 /G1 dans la cellule transfectées avec AP-4 siRNA était significativement plus élevée que celle des cellules pseudo (SGC7901: 54,65%; AGS: 48,44%) (p < 0,05) ou le contrôle siRNA (SGC7901 /contrôle siRNA: 52,18%; AGS /siRNA contrôle: 50,38%) (figure 3). Par conséquent, la cycline cellulaire arrestation à phases G0 /G1 transfection avec siRNA AP-4 spécifiques induit
.

Le bloc du cycle cellulaire AP-4 siRNA spécifiques induite a été étudiée plus en observant les effets du traitement AP-4 siRNA spécifiques sur l'expression relative des régulateurs du cycle cellulaire: le suppresseur de tumeur p53, la cycline dépendante inhibiteur de la kinase p21, et le G (1), la cycline D1 -phase spécifique, qui sont des régulateurs critiques du cycle cellulaire et la prolifération. Quarante-huit heures après la transfection, les cellules cancéreuses gastriques humaines ont été recueillies pour PCR en temps réel et des analyses d'immuno-empreinte. Transfection avec l'AP-4 ARNsi spécifiques pourrait réguler à la hausse l'expression de p53 et de la protéine p21. L'effet modulateur de l'AP-4 ARNsi était supérieure à celle du siRNA contrôle (figure 4) (p < 0,01). Comme prévu, la cycline D1 a été régulée à la baisse par rapport au groupe témoin de siRNA et le groupe fictif (figure 4) (p < 0,01). Ces données supportées en outre l'hypothèse que l'inhibition de l'expression de l'AP-4 a modifié l'expression d'autres régulateurs du cycle cellulaire, induit un arrêt du cycle cellulaire et ont inhibé la prolifération des cellules cancéreuses gastriques humaines

Détection de l'apoptose et les facteurs impliqués dans la l'apoptose voie

Pour quantifier l'effet de l'AP-4 siRNA spécifiques sur l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques humaines, annexine-V et PI coloration essais ont été utilisés en conjonction avec cytométrie de flux. Les cellules ont été colorées avec l'annexine V-FITC /PI et fermé en bas à droite (LR) et supérieur droit (UR) quadrants. Les cellules dans LR et UR ont été considérés comme début apoptotique (Annexin ^{+ /PI -) et à la fin apoptotique (Annexin + /PI +) respectivement. Les cellules de LL (Lower Left) et UL (en haut à gauche) quadrants étaient considérés comme vivant et nécrotique respectivement. Mesure de l'apoptose a été exprimée comme la somme des pourcentages dans LR et UR quadrants. Les taux apoptotiques ont été montré à la figure 5. Les cellules traitées avec AP-4 siRNA ont montré plus de cellules apoptotiques (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) que le siRNA négatif (SGC7901 /de contrôle: 5,5%; AGS /siRNA contrôle: 6,7%) (p < 0,05) et blanc (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p < 0,05) . Ces résultats montrent que l'AP-4 ARNsi spécifiques étaient capables d'induire l'apoptose dans ces cellules.}

En outre, nous avons examiné l'expression des facteurs impliqués dans la voie de l'apoptose par PCR en temps réel du niveau de l'ARNm, telles que Bcl-2 Bcl-x _{L, caspase-9, caspase-8 et Bax. Elle a montré que knock-down AP-4 pourrait réguler à la hausse l'expression de Baspase-9 dans des cellules de cancer de l'estomac humain et l'effet modulateur de l'AP-4 ARNsi était supérieure à celle du siRNA contrôle (figure 6) (p < 0,01). L'expression de Bcl-2 et Bcl-x L ont diminué par rapport à la siRNA contrôle ou d'un groupe fictif (figure 6) (p < 0,01). Ces données supportées en outre que le silençage de l'AP-4 a conduit à l'expression de l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques humaines. Toutefois, l'expression de la caspase-8 et de Bax étaient différentes dans différentes lignées cellulaires après transfection. Quarante-huit heures après la transfection, la caspase-8 et Bax ont une surexpression dans les cellules AGS. Dans SGC7901 cellules, l'expression de Bax a augmenté, mais l'expression de la caspase-8 a augmenté seulement dans siRNA-1 groupe. Dans siRNA-2 groupe, Caspase-8 expression n'a pas été significative affectée (figure 6).}

AP-4 silençage pourrait réguler le cycle cellulaire et l'apoptose cellulaire dans les deux p53-dépendante et indépendantes-manières

pour vérifier si la régulation positive de p53 dans AP 4 cellules de cancer gastrique knockdown était essentiel pour le rôle de l'arrêt du cycle cellulaire, les cellules Kato-III, une sorte de défaut de p53 lignée cellulaire de cancer gastrique a été utilisé pour évaluer la dépendance des AP effet knockdown -4 sur p53. Nous avons constaté que knockdown de l'AP-4 dans AGS avec p53 de type sauvage ou SGC7901 avec p53 mutant pourrait induire l'arrêt du cycle cellulaire, mais ce phénomène n'a pas été observé dans les cellules Kato-III (figure 7), le pourcentage de cellules à G0 /G1 phases étaient 57,82% (siRNA-1), 59,05% (siRNA-2), 59,59% (siRNA contrôle) et 59,06% (mock). Ceux indiqué que knockdown AP-4 peut réguler le cycle cellulaire par l'intermédiaire de la voie p53-p21. population Apoptose a également été détectée dans les cellules Kato-III avec une coloration Annexin V-FITC et PI. Les résultats ont montré que le taux de cellules Kato-III transfectées avec AP-4 siRNA apoptose (siRNA-1: 7,9%; siARN-2: 9,2%) était plus élevé que le siRNA contrôle (3,3%) (p < 0,05) et maquette des cellules (3,5%) (p < 0,05), mais dans une moindre mesure que l'a fait sur l'AGS (p < 0,05) et SGC7901 cellules (p < 0,05), indiquant que l'inhibition de l'AP-4 pourrait induire l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques par p53-dépendante et indépendantes-manières.

Discussion

L'expression des gènes est un processus fondamental et hautement conservée. La transcription, la première étape de l'expression génique, est effectuée par les ARN polymérases dépendant de l'ADN structurellement conservée, ce qui entraîne la synthèse d'une molécule d'ARN à partir d'une matrice d'ADN [31]. Les facteurs de transcription, complexe d'initiation de la transcription sous forme d'ARN polymeras II, participent au processus d'initiation de transcription pour réguler l'expression des gènes. Elles peuvent jouer un rôle important dans la transformation, la tumorigenèse, la progression tumorale et les métastases en régulant la transcription et par conséquent l'expression génique [32], [33], [34]. Facteur de transcription AP-4 appartenant au groupe en croissance rapide des protéines HLH [8] est impliquée dans la différenciation et de la prolifération cellulaire [35], [36], [37], [38], [39], affecte des événements du cycle cellulaire, et l'apoptose, régule et contrôle une expression génique [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Récemment, il a été rapporté que l'AP-4 a été régulée à la hausse dans le cancer du côlon, le cancer du sein et le cancer de la prostate [9], [18], [24]. En outre, AP-4 expression positive indique un mauvais pronostic avec une signification plus classe, le statut de nœud ou taille ER + cancer du sein, et une association possible avec la chimio-sensibilité [40]. Dans notre étude précédemment, nous avons constaté que l'expression de l'AP-4 a été surexprimé et co-liée à un mauvais pronostic [30]. Il peut être un marqueur moléculaire pour le diagnostic et le pronostic du cancer de l'estomac. Dans cette étude,. Nous avons conçu deux AP-4 ARNsi spécifiques pour inhiber l'expression du gène de l'AP-4 dans les cellules de cancer gastrique humain. Ils ont été bien établies et transfectés dans des cellules pour entraîner knock-down de l'AP-4 l'expression du gène. Nous avons constaté que le point temporel le plus puissant dans la suppression de l'expression de l'AP-4 dans les cellules de cancer de l'estomac sont 48 h et 72 h après la transfection. Ainsi, nous avons choisi le premier pour transporter plus loin l'examen connexe.

Auparavant, il a été montré que le facteur de transcription AP-4, contrairement à d'autres protéines HLH, contenait deux éléments répétés leucine distincts qui ont également la dimérisation directe et permettre à la formation d'un complexe sélectif de ubiquitaire AP-4 protéines [8], [41].

AP-4 pourrait jouer un rôle important dans la modulation des fonctions cellulaires via la régulation des gènes impliqués dans la production virale [7], [16 ], [22], [42], [43], la croissance et la survie cellulaire [9], [17], [23], [44], la réponse immunitaire [14], [41], [45], et l'angiogenèse [21]. Peter Jung et al ont constaté que AP-4 peut coder pour un c-myc inductible répresseur pour inhiber l'expression de p21 [9], et vraisemblablement jouent un rôle important dans la médiation de l'activité proliférative de c-MYC [10]. En outre, l'AP-4 a influencé la sensibilité à l'apoptose par régulation de l'expression de la caspase-9 [17]. Dans cette étude, nous avons constaté que la régulation négative de l'AP-4 a inhibé la prolifération de cellules de cancer gastrique humain in vitro. Le rapport d'inhibition de la prolifération des AP-4 ARNsi spécifique était significativement inférieure à celle des cellules transfectées avec l'ARNsi de contrôle ou d'un groupe fictif.

La chimiothérapie est une stratégie importante dans le traitement du cancer de l'estomac, mais il ne parvient souvent à cause de la résistance aux médicaments anti-cancéreux. Il a été rapporté que l'AP-4 expression positive était peut-être liée à la chimio-sensibilité [40]. Nous avons ensuite étudié le rôle de l'AP-4 dans la régulation de la chimio-sensibilité des cellules cancéreuses gastriques humaines et constaté que l'inhibition de l'AP-4 pourrait améliorer de manière significative la sensibilité de ces cellules à l'ADR, le 5-FU ou le traitement cis-Plantinum, suggérant que l'inhibition de l'AP-4 peut avoir un effet bénéfique dans la chimio-sensibilité.

en outre, le silençage de l'AP-4, induit un arrêt du cycle cellulaire en phase G0 /G1, analyse d'un des mécanismes possibles qui sous-tendent les effets de l'AP-4 silençage sur l'inhibition de la prolifération gastrique des cellules cancéreuses humaines ont été caractérisées par l'expression de régulateurs liés au cycle cellulaire. Nous avons constaté que la régulation négative de l'expression AP-4 a inhibé l'expression de la cycline D1, mais est régulée à la hausse l'expression de p53 et p21. p53 et p21 a été émis l'hypothèse d'un régulateur négatif du cycle cellulaire et la prolifération [46], [47], d'autre part, la cycline D1 favorisé la progression à travers le G _{Phase 1-S du cycle cellulaire [48 ]. expression régulée à la baisse de l'AP-4, p21 et p53, en attendant, pourrait faire l'arrêt du cycle cellulaire causé knockdown de l'AP-4 disparition. Ces résultats sont en accord avec un modèle dans lequel AP-4 induit un arrêt du cycle cellulaire en régulant l'expression des régulateurs du cycle cellulaire, comme p53, p21 et cycline D1.}

apoptose, ou mort cellulaire programmée, est connue de participer à divers processus biologiques par deux grandes voies apoptotiques, la voie (intrinsèque) mitochondrial et le récepteur de mort (extrinsèque) de la voie [49]. Nous avons trouvé que l'inhibition de l'expression de l'AP-4 trigged l'apoptose cellulaire dans notre expérience, ce qui a démontré que l'AP-4 a supprimé l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques humaines.

Dans notre expérience, l'augmentation des niveaux de la caspase-9 et de régulation à la baisse de Bcl-2 et Bcl-x _{L ont été détectées dans les cellules cancéreuses gastriques humaines, ce qui indique que knock-down de l'AP-4 voies à la fois intrinsèques et extrinsèques activés à l'apoptose dans les cellules cancéreuses. [49], [50]}

En résumé, les données démontrent que l'ARNi médiée par la régulation du facteur de transcription AP-4 efficacement inhibé la prolifération des cellules, a indiqué l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose déclenchée et renforcée chimio-sensibilité des cellules de cancer gastrique humain avec la diminution de l'expression de la cycline D1, Bcl-2 et Bcl-x _{l et p21 activée, p53 et caspase-9 expression, ce qui suggère l'AP-4 peut être un oncogène jouant un rôle important dans la tumorigenèse . Bien que le mécanisme précis de ce rôle doit encore être étudiée, l'AP-4specific-ARNsi peut être des valeurs potentielles en tant que nouveaux agents thérapeutiques pour le cancer gastrique humain.}

lignée cellulaire Matériaux et méthodes et de la culture cellulaire

Human gastriques cellules cancéreuses lignes AGS avec p53 de type sauvage, SGC7901 avec p53 mutante (obtenu à partir de l'Université de Wuhan) et Kato-III avec le génome de p53 délétion (Zhiyan Bio Technology Co, Shanghai) ont été cultivées dans milieu RPMI1640 ou du milieu DMEM (Invitrogen) contenant 10% de sérum de veau fœtal (Invitrogen), de la pénicilline (100 U /ml) et de la streptomycine (100 ug /ml). Les cellules ont été maintenues à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO _2.

siRNA et la transfection spécifique

La séquence d'ADNc du gène de l'AP-4 a été obtenue auprès de Genbank ( NM_003223) et les séquences de ciblage de 21 deux nucleotides différents ARNsi ont été conçus et synthétisés chimiquement (Qiagen Allemagne). Les séquences de nucléotides sont les suivantes: ARNsi-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(sens) et 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (anti-sens). ARNsi-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(sens) et 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (anti-sens). Allstars contrôle négatif siRNA (Qiagen Allemagne) ont été utilisés comme un siRNA contrôle brouillé. Les cellules ont été étalées dans des plaques à 6 puits et on les ARNsi ont été transfectés dans des cellules de culture avec de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon les instructions du fabricant.

quantitative en temps réel
PCR

l'extraction totale de l'ARN a été réalisée de plus en utilisant RNAiso (Takara, Japon) selon le protocole du fabricant. Les ADNc à partir d'ARN total ont été synthétisés en utilisant la RT PrimeScript® Kit de réactif (Takara, Japon). L'expression de l'ARNm a été évaluée par PCR en temps réel sur un ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapour) avec SYBR rapide des réactifs PCR vert. GAPDH a été appliqué en tant que contrôle interne. Les concentrations des réactifs ont été ajustés pour atteindre un volume final de 20 ul, contenant 2 pl transcription inverse produit, 10 pl de Fast SYBR Vert Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), et 0,5 pi de 10 uM avant et inverser les amorces. La réaction a été réalisée par 45 cycles d'amplification de 95 ° C pendant 3 s et 60 ° C pendant 30 s. Les amorces suivantes ont été conçues (Tableau.1). Des amorces de PCR ont été conçus par Primer 5.0 et recherche Blast pour vérifier la spécificité. Les séquences des amorces utilisées sont énumérées dans les tableaux 1. Les résultats ont été calculés à l'aide de 2 ^{-ΔΔCt méthode.}

Western blot

La protéine a été extrait avec le kit d'extraction de protéines (Beyotime, Chine) selon à la direction. La protéine a été diluée à 3 pg /pl et a été séparé par 10% de SDS-PAGE, transférés sur le difluorure de polyvinylidène (PVDF), les membranes (Millipore, USA), puis a été bloquée dans du lait en poudre 5% non gras dans du TBST pendant 1 heure à température ambiante. Immunotransfert a été réalisée utilisant des anticorps anti-AP-4 anticorps (Sigma-Aldrich, Shanghai, dilution 1:1000), anticorps anti-p21 (Sigma-Aldrich, Shanghai, dilution 1:1000), anticorps anti-p53 (Abcam, Royaume-Uni, la dilution 1:500) et anti-cycline D1 anticorps (Abcam, Royaume-Uni, la dilution 1:500) pendant une nuit à 4 ° C. Après avoir rincé trois fois avec du TBST, la membrane a été incubée avec la peroxydase de raifort conjuguée à des anticorps secondaires (dilution 1:2000, Boster, Chine) pendant 1 heure à température ambiante. Le résultat a été visualisée par le système de détection par buvardage de Western ECL Plus selon les instructions du fabricant. Anti-β-actine (dilution 1:1000, Boster, Chine) a agi à titre d'anticorps de contrôle interne.

Mesure de la prolifération cellulaire

L'impact de faire taire AP-4 sur la prolifération des cellules du cancer de l'estomac après 48 heures de transfection a été mesurée par comptage cellulaire Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, Chine), selon les instructions du fabricant. En bref, des cellules de cancer de l'estomac ont été cultivées dans des plaques à 96 puits et transfectées avec 20 nM de siRNA contrôle, l'AP-4 ARNsi spécifiques. Au bout de 48 heures, 10 pl de réactif de la CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits, après 1 heure d'incubation à 37 ° C, l'absorbance est mesurée à 450 nm. Les niveaux relatifs de la prolifération cellulaire dans chaque groupe de cellules a été calculé selon la formule suivante: R = (A2-A1) /A2 × 100% et P = A1 /A2 × 100% dans laquelle R est le taux relativement inhibiteur et P était relativement taux de prolifération de la croissance cellulaire; A1was valeur moyenne absorbance des cellules transfectées; et A2 est la valeur moyenne de l'absorbance des cellules témoins non transfectées sans aucun traitement médicamenteux. Toutes les expériences ont été réalisées avec 5 puits par expérience et répétées au moins trois fois.

Cycle cellulaire Assay

Les cellules ont été récoltées 48 heures après la transfection et fixées dans 70% d'éthanol glacé pendant une nuit, on lave avec 1 x PBS et colorées à l'iodure de propidium (PI) (50 pg /ml) dans 1 x PBS additionné de RNase (50 ug /ml) pendant 30 minutes. Des essais ont été effectués en triple pour chaque échantillon, et les analyses ont été effectuées par cytométrie de flux (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) conformément aux directives du fabricant.

Test Chemo-sensibilité in vitro

comme décrit précédemment, la CCK-8 essai a été utilisé pour évaluer les effets de la chimio-sensibilité des cellules de cancer de l'estomac aux médicaments anticancéreux. En bref, six heures après la transfection, le milieu a été éliminé et remplacé par du milieu frais contenant des concentrations variables de médicament anti-tumoral (ADR, le 5-FU ou le cis-platine) et mis à incuber pendant 48 heures. taux relativement inhibitrice de la croissance cellulaire a été calculée selon la formule ci-dessus.

Apoptose dosage par Annexin V-FITC et de l'iodure de propidium (PI), la coloration

Pour évaluer le taux d'apoptose cellulaire, l'apoptose a été quantifiée par l'iodure double coloration annexine-V-FITC et propidium en utilisant un Annexin-V /kit FITC (Antgene, Chine). Les cellules ont été collectées conformément aux instructions du fabricant 48 heures après la transfection, on lave avec du PBS froid et mises en suspension dans un tampon de liaison, puis les cellules ont été incubées 30 minutes dans l'obscurité à 4 ° C avec de l'Annexine V-FITC et PI dans un tampon phosphate et analysé sur la cytométrie de flux (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) en 1 h après coloration.

Analyse statistique

Toutes les données ont été présentés sous forme de moyenne ± écart-type. Différence entre les groupes a été analysée par un ANOVA et Student-Newman-Keuls (SNK) Test -q utilisant un SPSS 12.0 pour le logiciel Windows. La signification statistique a été défini comme * p < 0,05 et ** p <. 0,01

Remerciements

Nous remercions Wu Ke, Shi Liang, Deng Meizhou, Li Suspendre et Li Wei pour leur assistance technique d'experts .

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