PLOS ONE: nedreglering av AP-4 hämmar proliferation inducerar cellcykelstopp och främjar apoptos i Human Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Bakgrund

AP-4 tillhör den grundläggande helix -loop-helix leucin-blixtlås grupp; den kontrollerar mål genuttryck reglerar tillväxt, utveckling och cell apoptos och har varit inblandad i tumörbildning. Våra tidigare studier tyder på att AP-4 ofta var överuttryckt i magcancer och kan associeras med dålig prognos. Syftet med denna studie är att undersöka om tysta AP-4 kan förändra biologiska egenskaper gastric cancerceller.

Metoder

Två specifika siRNA inriktning AP-4 konstruerades, syntetiseras och transfekterades i gastric cancercellinjer och humana normala slemhinneceller. AP-4 expression mättes med realtids kvantitativ PCR och Western blot. Cellproliferation och kemo-känsligheten detekterades genom CCK-8-analysen. Cellcykel analys och apoptos-analys utfördes genom flödescytometern, och relativa uttryck av cellcykelregulatorer detekterades genom realtids-kvantitativ PCR och Western blot, uttryck av de faktorer som är inblandade i apoptos vägen undersöktes i mRNA och proteinnivå.

Resultat

uttrycket av AP-4 tystades av siRNA transfektion och effekterna av AP-4 knockdown varade 24 till 96 timmar. SiRNA-medierad tysta AP-4 undertryckte cellulär proliferation, apoptos och sensibiliserade cancerceller för att läkemedel mot cancer. Dessutom har uttrycksnivån för p21, p53 och kaspas-9 ökar när AP-4 knockdown, men uttrycket av cyklin D1, Bcl-2 och BcI-x _{L inhiberades. Det inte inducera cellcykelstopp när AP-4 knockdown i p53 defekt magcancer cellinje Kato-III.}

Slutsatser

Dessa resultat visat att genen tysta AP-4 kan effektivt hämmade cellproliferation, utlöst apoptos och sensibiliserade cancerceller för anticancerläkemedel in vitro, vilket tyder på att AP-4 siRNA förmedlad ljuddämpning har ett potentiellt värde vid behandling av human magcancer

Citation:. Liu X, Zhang B, Guo Y, Liang Q, Wu C, Wu L, et al. (2012) nedreglering av AP-4 hämmar proliferation inducerar cellcykelstopp och främjar apoptos i Human Gastric cancerceller. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10.1371 /journal.pone.0037096

Redaktör: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA

Mottagna: 4 juni 2011. Accepteras: 18 april 2012, Publicerad: 16 maj 2012 |

Copyright: © 2012 Liu et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Även om förekomsten och dödligheten i samband med magcancer har gradvis minskat under de senaste åren i de flesta områden i världen [1], [2], förblir magcancer ett globalt hälsoproblem, och är fortfarande den vanligaste orsaken av cancerrelaterade dödsfall med liten förbättring av långsiktig överlevnad. Den mest effektiva behandlingen av magcancer var helt kirurgiskt avlägsnande av neoplastisk vävnad med D2 lymfkörtlar. Dessutom adjuvant kemoterapi och strålbehandling har hjälpt för att förbättra prognosen. Trots detta förblev 5-års överlevnad mycket dålig [1], [3]. Mer än en miljon nya fall diagnostiseras varje år, särskilt i östra Asien, som Japan, Korea och Kina. I dessa länder fortfarande magcancer den vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall och den exakta patogenesen förblir okänd [3].

transkriptionsfaktorer viktiga regleringskomponenter [4]. De hörde till helix-loop-helix familjen och spelade en viktig roll vid cellproliferation och differentiering, cellhärstamning bestämning, expression av intracellulär genetisk information, och andra väsentliga processer [5]. Som medlem i den grundläggande helix-loop-helix leucin-blixtlås (bHLH-LZ) undergrupp av bHLH proteiner [6], aktivera förstärkare bindande protein 4 (AP-4) identifierades ursprungligen som ett cellulärt protein som är bundet till simianvirus 40 (SV40) förstärkare och aktiverad den virala sena gentranskription [7]. AP-4 är en ubiquitously uttryckt transkriptionsfaktor och kan styra transkriptions nätverk under celldifferentiering genom att bilda homodimerer och bindning till den symmetriska DNA-sekvensen, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 är en ligand för immunoglobulin-kappa-promotor E-box-element, som kan vara involverade att immunbristsjukdomar [13], [14]. Dessutom, till skillnad från andra HLH-proteiner, AP-4 innehåller två ytterligare proteindimeriseringsmotiv som består av leucin upprepningselement LR1 och LR2. Hence, presenterar AP-4 en specifik tripartite dimeriseringsstruktur, vilket antyder att AP-4 kan interagera med ett stort antal olika transkriptionsfaktorer [8], [14]. AP-4 reglerar uttrycket av vissa gener [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Till exempel, aktiverar den transkriptionen av hMTIIA genen och deltar i regleringen av mänsklig proenkephalin uttryck [22], och det kan spela en roll i uttrycket av den pankreatiska exokrina genfamiljen [23]. Nyligen var överuttryck av AP-4 redovisas i kolorektal cancer, bröstcancer och prostatacancer [9], [18], [24].

RNA-interferens (RNAi) är en process för sekvensspecifik post -transcriptional geners uttryck initieras av dubbelsträngat RNA [25], vilket kan leda till tysta av specifik cellulär gen och ger en kraftfull omvänd genetik tillvägagångssätt för att analysera genfunktioner både in vitro och in vivo [26]. För närvarande de mest använda nukleinsyra-baserade sekvensspecifika gen tysta molekyler var små störande RNA [27], som heter siRNA, som består av symmetriska duplex av 19-21 baspar [28]. SiRNA-metoden kunde inhibera målgenuttryck med specificitet, effektivitet och uthållighet [29].

Vi rapporterade tidigare att AP-4 överuttrycktes i gastric cancer och att den kan vara associerad med den dålig prognos [30]. I den aktuella studien undersökte vi ytterligare AP-4 funktion i human magsäckscancer cell med RNA-interferens.

Resultat

Specifik siRNA inriktade på AP-4 uttryck i humana gastric cancerceller och mänskliga normal slemhinna celler

för att utvärdera effekten av siRNA-medierad tystnad AP-4 genuttryck kontroll siRNA och AP-4 specifika siRNA transfekterades in i cellerna i 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar och 96 h. Effektiviteten i nedreglera uttryck av AP-4-genen detekterades genom realtids-kvantitativ PCR och Western blot. Såsom visas i figur 1, kan AP-4 specifika siRNA effektivt inhibera den gen transkription och translation. MRNA och proteinnivåer av AP-4 minskade med AP-4 siRNA transfektion gruppen men inte i kontroll siRNA (Figur 1). Den siRNA inducerad suppression av AP-4 expression kunde detekteras i 24 timmar efter transfektion. Minskade emellertid inhiberingen förhållandet 72 timmar efter transfektion. Den mest effektiva tidpunkt var mellan 48 h till 72 h i undertrycka uttryck av AP-4. De relativa nivåerna av mRNA-transkript minskade betydligt med nästan 90% i siRNA-en grupp, och 95% i siRNA-2 grupp. Det fanns statistisk signifikans mellan siRNA grupp och kontrollgruppen.

nedreglering av AP-4 uttryck hämmade celltillväxt och sensibiliserade humana gastriska cancerceller att läkemedel mot cancer

För att undersöka effekten av AP-4 specifika siRNA på cellproliferation och kemo-känsligheten hos cancerceller, 20 nM av AP-4 specifika siRNA eller kontroll siRNA transfekterades och cellproliferations bestämdes genom CCK-8-analysen 48 timmar efter transfektion. Vi fann att knockdown AP-4 kan hämma tillväxten av magcancer cellinjer SGC7901 och AGS (Figur 2), men inte i normal slemhinna cellinje GES-1 jämfört med kontroll siRNA transfektion i 48 timmar (Figur 2). Dessa resultat indikerade att AP-4 siRNA dämpas cellproliferationen av gastriska cancerceller in vitro. Vidare undersökte vi rollen av AP-4 i regleringen av kemo-känsligheten hos humana gastriska cancerceller. Vi jämförde läkemedelskänslighet AP-4 siRNA med den för kontroll siRNA eller sken celler och funnit att de relativa hämnings andelen AP-4 specifika siRNA var betydligt högre än för kontroll siRNA eller mock-celler (p < 0,0001) (Figur 2 ). Dessutom, AP-4 siRNA förbättrade avsevärt känsligheten hos celler till ADR, 5-FU eller cis-plantinum behandling vid två olika sätt doser (Figur 2), dessa föreslog att nedreglering av AP-4 kan ha en gynnsam effekt på känslighet kemoterapi.

tysta AP-4 expression inducerad cellcykelstopp och modulerad expression av p53, p21 och cyklin D1

effekten av AP-4 på cellcykelns förlopp undersöktes . Humana gastriska cancerceller transfekterades med 20 nM kontroll siRNA, och AP-4 specifika siRNA för 48 h, respektive, följt av propidiumjodid-färgning och flödescytometri analys av cellcykeln. Medan celler transfekterade med kontroll siRNA utvecklats genom olika faser av cellcykeln, celler transfekterade med AP-4 specifika siRNA visade signifikant högre frekvens av celler vid G0 /G1 faser (SGC7901 /siRNA-1: 68,81%; SGC7901 /siRNA-2: 68,97%; AGS /siRNA-1: 61,92%; AGS /siRNA-2: 63,67%) och en lägre frekvens av celler vid S-fasen (SGC7901 /siRNA-1: 29,57%; SGC7901 /siRNA-2: 29,84%; AGS /siRNA-1: 24,36%; AGS /siRNA-2: 22,91%). Den procentuella andelen celler vid G0 /G1 faser i cellen transfekterad med AP-4 siRNA var signifikant högre än den för de mock-celler (SGC7901: 54,65%; AGS: 48,44%) (p < 0,05) eller kontrollera siRNA (SGC7901 /kontroll siRNA: 52,18%; AGS /kontroll siRNA: 50,38%) (Figur 3). Därför transfektion med AP-4-specifika siRNA inducerad cell cyklin gripandet vid G0 /G1 faser.

AP-4 specifika siRNA inducerad cellcykelblocket undersöktes vidare genom att observera effekterna av AP-4 specifika siRNA behandling på den relativa expressionen av cellcykelregulatorer: den tumörsuppressorgen p53, den cyklinberoende kinashämmaren p21, och G (1) -fas specifik cyklin D1, som var kritiska kontrollen av cellcykeln och proliferation. Fyrtioåtta timmar efter transfektion, var humana gastriska cancerceller samlas in för realtids-PCR och immunoblotting-analys. Transfektion med AP-4 specifika siRNA kunde uppreglera expressionen av p53 och p21-protein. Den modulerande effekten av AP-4 siRNA var större än den för kontroll siRNA (Figur 4) (p < 0,01). Som väntat, cyklin D1 var nedreglerad jämfört med kontroll siRNA-grupp och mock-gruppen (figur 4) (p < 0,01). Dessa data stöds vidare hypotesen att tysta uttrycket av AP-4 förändrat uttryck av andra cellcykelregulatorer, inducerad cellcykelstopp och hämmade proliferation av humana gastriska cancerceller

Upptäckt av apoptos och de faktorer som deltar i apoptosvägen

för att kvantifiera effekten av AP-4 specifika siRNA på apoptos i humana gastriska cancerceller har annexin-V och PI färgning analyser används i samband med flödescytometri. Cellerna färgades med Annexin V-FITC /PI och gated i nedre högra (LR) och den övre högra (UR) kvadranter. Celler i LR och UR ansågs vara tidiga apoptotiska (Annexin ^{+ /PI -) och sen apoptotiska (Annexin + /PI +) respektive. Celler i LL (nere till vänster) och UL (uppe till vänster) kvadranter ansågs vara levande och nekrotiska respektive. Omfattningen av apoptos uttrycktes som summan av procenttalen i LR och UR kvadranter. De apoptotiska priser var visade i figur 5. Behandlade celler med AP-4 siRNA visade mer apoptotiska celler (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) än den negativa (SGC7901 /kontroll siRNA: 5,5%; AGS /kontroll siRNA: 6,7%) (p < 0,05) och blindlösningen (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p < 0,05) . Dessa resultat visade att AP-4 specifika siRNA kunde inducera apoptos i dessa celler.}

Dessutom undersökte vi uttrycket av faktorer som apoptos väg med realtids-PCR i mRNA-nivån, såsom Bcl-2 , Bcl-x _{L, kaspas-9, kaspas-8 och Bax. Den visade att knockdown AP-4 kunde uppreglera uttrycket av Baspase-9 i humana gastriska cancerceller, och den modulerande effekten av AP-4 siRNA var större än den för kontroll siRNA (figur 6) (p < 0,01). Expressionen av Bcl-2 och Bcl-x L minskade jämfört med kontrollen siRNA eller mock-gruppen (figur 6) (p < 0,01). Dessa data stöds vidare att tysta AP-4 uttryck ledde till apoptos i humana gastriska cancerceller. Emellertid uttrycket av kaspas-8 och Bax var olika i olika cellinjer efter transfektion. Fyrtioåtta timmar efter transfektion, kaspas-8 och Bax var över uttryck i AGS-celler. I SGC7901 celler, ett uttryck för Bax ökat, men uttrycket av kaspas-8 ökade endast i siRNA-en grupp. I siRNA-2 grupp, kaspas-8 uttryck var inte signifikant påverkade (Figur 6).}

AP-4 tysta kan reglera cellcykeln och cell apoptos i både p53-beroende och oberoende-sätt

för att kontrollera om uppreglering av p53 i AP-4 knockdown gastric cancerceller var avgörande för rollen av cellcykelstopp, Kato-III-celler, en typ av p53 defekt magcancer cellinje användes för att utvärdera beroendet av AP -4 knockdown effekt på p53. Vi fann att knockdown av AP-4 i AGS med vild-typ p53 eller SGC7901 med mutant p53 kan inducera cellcykelstopp, men detta fenomen observerades inte i Kato-III-celler (Figur 7), den procentuella andelen av celler vid G0 /G1 faser var 57,82% (siRNA-1), 59,05% (siRNA-2), 59,59% (kontroll siRNA) och 59,06% (mock). De indikerade att knockdown AP-4 kanske reglera cellcykeln med hjälp av p53-p21-vägen. Apoptos befolkning detekterades också i Kato-III-celler med Annexin V-FITC och PI färgning. Resultaten visade att apoptos graden av Kato-III-celler transfekterade med AP-4 siRNA (siRNA-1: 7,9%, siRNA-2: 9,2%) var högre än kontroll siRNA (3,3%) (p < 0,05) och mock celler (3,5%) (p < 0,05), men i mindre utsträckning än vad den gjorde på AGS (p < 0,05) och SGC7901 celler (p < 0,05), vilket tyder på att tysta AP-4 kan inducera apoptos i gastric cancerceller genom både p53-beroende och oberoende-sätt.

Diskussion

Gene expression är en grundläggande och mycket konserverad process. Transkription, det första steget i genuttryck, utförs genom att strukturellt konserverade DNA-beroende RNA-polymeraser, vilket resulterar i syntesen av en RNA-molekyl från en DNA-mall [31]. Transkriptionsfaktorer, formen transkriptionsinitiering komplex med RNA-polymeras II, delta i processen för transkriptionsinitiering för att reglera genuttryck. De kan spela en viktig roll i omvandlingen, tumörbildning, tumörprogression och metastas genom att reglera transkription och därför genuttryck [32], [33], [34]. Transkriptionsfaktor AP-4, som tillhör den snabbt växande gruppen av HLH-proteiner [8] är involverad i differentiering och cellproliferation [35], [36], [37], [38], [39], påverkar cellcykelhändelser och apoptos, reglerar och kontrollerar några genuttryck [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Nyligen har det rapporterats att AP-4 var uppreglerat i kolonkarcinom, bröstcancer och prostatacancer [9], [18], [24]. Dessutom, AP-4 positivt uttryck indikerade en dålig prognos med betydelse över klass, nodstatus eller storlek i ER + bröstcancer, och ett möjligt samband med cellgifter känslighet [40]. I vår tidigare studie, har vi funnit att uttrycket av AP-4 överuttrycktes och det samarrelaterade med en dålig prognos [30]. Det kan vara en molekylär markör för diagnos och prognos av magcancer. I den nuvarande undersökningen,. Vi har utformat två AP-4 specifika siRNA att hämma uttrycket av AP-4-genen i humana gastriska cancerceller. De var väl etablerade och transfekterades in i celler för att resultera i knock-down av AP-4 genuttryck. Vi fann att den mest potenta tidpunkt vid suppression av AP-4 expression i gastriska cancerceller var 48 h och 72 h efter transfektion. Sålunda valde vi den förra för att ytterligare utföra relaterad undersökning.

Tidigare har det visats att transkriptionsfaktorn AP-4, till skillnad från andra HLH-proteiner, innehöll två distinkta leucin upprepningselement som också direkt dimerisering och tillåta selektiv komplexbildning av allestädes närvarande AP-4 protein [8], [41].

AP-4 kan spela en viktig roll i modulering av cellulära funktioner via reglering av gener som är involverade i viral produktion [7], [16 ], [22], [42], [43], celltillväxt och överlevnad [9], [17], [23], [44], immunsvar [14], [41], [45], och angiogenes [21]. Peter Jung, et al fann att AP-4 skulle kunna koda för en c-MYC-inducerbar repressor att inhibera p21 uttryck [9], och antagligen spelat en viktig roll vid mediering av proliferativ aktivitet hos c-MYC [10]. Dessutom, AP-4 påverkas känsligheten för apoptos genom att reglera uttrycket av kaspas-9 [17]. I denna studie fann vi att nedreglering av AP-4 hämmade proliferation av humana gastric cancerceller in vitro. Spridningen inhibition förhållandet mellan AP-4 specifika siRNA var betydligt lägre än för de celler som transfekterats med kontroll siRNA eller falsk grupp.

Cytostatika är en viktig strategi vid behandling av magcancer, men det ofta misslyckas på grund av motståndet mot anticancerläkemedel. Det rapporterades att AP-4 positiva uttryck möjligen i samband med cellgifter känslighet [40]. Vi undersökte nästa roll AP-4 i regleringen av cellgifter känslighet av mänskliga gastric cancerceller och fann att hämning av AP-4 skulle avsevärt förbättra känsligheten hos dessa celler till ADR, 5-FU eller cis-plantinum behandling, vilket tyder på att hämning av AP-4 kan ha en gynnsam effekt på cellgifter känslighet.

Dessutom tysta AP-4, inducerade cellcykelstopp vid G0 /G1 faser, analys av en potentiell mekanismerna bakom effekterna av AP-4 tysta på hämning av humant magcancer celltillväxt präglades av uttrycket av cellcykelrelaterade tillsynsmyndigheter. Vi fann att nedreglering av AP-4 expression inhiberade uttryck av cykhn-D 1, men uppreglerade expressionen av p53 och p21. p53 och p21 har hypoteser för att vara en negativ regulator av cellcykeln och proliferation [46], [47], å andra sidan, cyklin D1 främjas progression genom G _{1-S-fasen av cellcykeln [48 ]. Nedreglerade expression av AP-4, p21 och p53 i tiden kunde göra cellcykelstopp orsakade knockdown av AP-4 försvinnande. Dessa resultat överensstämmer med en modell där AP-4 inducerar cellcykelstopp genom att reglera uttrycket av cellcykelregulatorer, såsom p53, p21 och cyklin D1.}

Apoptos, eller programmerad celldöd, är känd att delta i olika biologiska processer genom två huvudsakliga apoptotiska vägar, den mitokondriella (inre) vägen och dödsreceptor (yttre) vägen [49]. Vi fann att tysta AP-4 uttryck triggad cell apoptos i vårt experiment, som visade att AP-4 undertryckte apoptos i humana gastriska cancerceller.

I vårt experiment, ökande nivåer av kaspas-9 och nedreglering av Bcl-2 och Bcl-x _{L detekterades i humana gastriska cancerceller, vilket tyder på att knockdown av AP-4 aktiverade både inre och yttre vägar för att apoptos i cancerceller. [49], [50]}

Sammanfattningsvis visar data visar att RNAi-medierad nedreglering av transkriptionsfaktor AP-4 inhiberade effektivt den cellproliferation, indikerade cellcykelstopp, utlöst apoptos och förstärkt kemo-känslighet mänskliga gastric cancerceller med minskad expression av cyklin D1, Bcl-2 och BcI-x _{L och aktiverat p21, p53 och kaspas-9 uttryck, som föreslog AP-4 kan vara en onkogen spelar en viktig roll i tumörbildning . Även om den exakta mekanismen för denna roll behöver utredas ytterligare, kan AP-4specific-siRNA vara potentiella värden som nya läkemedel för humant magcancer.}

Material och metoder

Cellinje och cellodling

mänskliga gastric cancercellinjer AGS med vild-typ p53, SGC7901 med mutant p53 (erhållen från Wuhan University) och Kato-III med p53 genom deletion (Zhiyan Bio Technology Co, Shanghai) odlades i DMEM-medium eller RPMI1640-medium (Invitrogen) innehållande med 10% fetalt bovint serum (Invitrogen), penicillin (100 U /ml) och streptomycin (100 | ig /ml). Celler upprätthölls vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO _2.

Specifik siRNA och transfektion

cDNA-sekvensen för AP-4-genen erhölls från Genbank ( NM_003223) och målsökningssekvenser av två 21-nukleotid olika siRNA utformades och kemiskt syntetiserade (Qiagen Tyskland). Nukleotidsekvenserna var som följer: siRNA-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(sens) och 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (antisens). siRNA-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(sens) och 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (antisens). Allstars negativ kontroll siRNA (Qiagen Tyskland) användes som en kodad siRNA kontroll. Celler ströks ut i 6-brunnars plattor och de siRNA transfekterades in i odlingsceller med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i enlighet med tillverkarens instruktioner.

realtid kvantitativ PCR

Total RNA-extraktion utfördes med användning RNAiso Plus (Takara, Japan) i enlighet med tillverkarens protokoll. CDNA från totalt RNA syntetiserades med användning PrimeScript® RT-reagens Kit (Takara, Japan). MRNA expression utvärderades genom realtids-PCR på en ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapore) med Fast SYBR Green PCR-reagens. GAPDH användes som den interna kontrollen. Koncentrationerna av de reagens justerades för att nå en slutlig volym av 20 | il, innehållande 2 mikroliter omvänt-transkriberade produkten, 10 pl av Snabb SYBR® Grön Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), och 0,5 | il av 10 | iM framåt och omvända primrar. Reaktionen utfördes med 45 amplifieringscykler vid 95 ° C under 3 s och 60 ° C under 30 s. Följande primrar utformades (Table.1). PCR-primers utformades av Primer 5,0 och Blast sökning för att kontrollera specificitet. Primersekvenser som används listas i tabellerna 1. Resultaten beräknades genom att använda två ^{-ΔΔCt metod.}

Western blot

Protein extraherades med proteinextraktion kit (Beyotime, Kina) enligt med riktningen. Proteinet späddes till 3 mikrogram /l och separerades med 10% SDS-PAGE, överfördes till polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, USA), och sedan blockerades i 5% fettfri torrmjölk i TBST under 1 timme vid rumstemperatur. Immunblotting utfördes med användning av anti-AP-4-antikropp (Sigma-Aldrich, Shanghai, utspädning 1:1000), anti-p21-antikropp (Sigma-Aldrich, Shanghai, utspädning 1:1000), anti-p53-antikropp (Abcam, UK, utspädning 1:500) och anti-cyklin D1-antikropp (Abcam, UK, utspädning 1:500) över natten vid 4 ° C. Efter tre gånger sköljdes med TBST, inkuberades membranet med pepparrotsperoxidas-konjugerat sekundära antikroppar (utspädning 1:2000, Boster, Kina) i 1 timme vid rumstemperatur. Utfallet visualiserades genom ECL Plus Western blotting detektionssystem i enlighet med tillverkarens instruktioner. Anti-β-aktin (utspädning 1:1000, Boster, Kina) agerade antikropp som intern kontroll.

Mätning av celltillväxt

Effekterna av tysta AP-4 på magcancer celltillväxt efter 48 timmar av transfektion mättes genom cellräkning Sats-8 (CCK-8) (Beyotime, Kina), enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat, gastriska cancerceller odlades i 96-brunnars plattor och transfekterades med 20 nM av kontroll siRNA, AP-4 specifika siRNA. Efter 48 timmar tillsattes 10 | il av CCK-8-reagens sattes till varje brunn, efter 1 timmes inkubation vid 37 ° C, varvid absorbansen mäts vid 450 nm. De relativa nivåerna av cell-proliferation i varje grupp av celler beräknades enligt följande formel: R = (A2-A1) /A2 × 100% och P = A1 /A2 × 100% i vilken R var relativt hämningsgrad och P var relativt spridningsförhållande av celltillväxt; A1was medelabsorbansen värde av transfekterade celler; och A2 var Medelabsorbansvärdet för otransfekterade kontrollceller utan någon läkemedelsbehandling. Alla experiment gjordes med 5 brunnar per experiment och upprepades minst tre gånger.

Cellcykel Assay

Celler skördades 48 timmar efter transfektion och fixerades i 70% iskall etanol över natt, tvättades med 1 x PBS, och färgades med propidiumjodid (PI) (50 | j, g /ml) i 1 x PBS kompletterad med RNas (50 fig /ml) under 30 minuter. Tester utfördes i tre exemplar för varje prov, och analyser utfördes av flödescytometer (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) i enlighet med tillverkarens anvisningar.

Chemo-känslighetstest in vitro

såsom beskrivits tidigare, var CCK-8-analysen används för att bedöma effekten av den kemo-känsligheten hos gastriska cancerceller för anticancerläkemedel. I korthet, sex timmar efter transfektion avlägsnades mediet och ersattes med färskt medium som innehåller varierande koncentrationer av anti-tumörläkemedel (ADR, 5-FU eller cis-platina) och inkuberades under 48 timmar. Relativt hämningsgrad av celltillväxt beräknades enligt formeln som anges ovan.

Apoptos analys genom Annexin V-FITC och propidiumjodid (PI) färgning

För att bedöma graden av cellapoptos, apoptos kvantifierades genom annexin-V-FITC och propidiumjodid dubbel färgning med hjälp av en annexin-V /FITC kit (Antgene, Kina). Celler uppsamlades i enlighet med tillverkarens instruktioner 48 timmar efter transfektion, tvättades med kall PBS, och suspenderades i bindningsbuffert och sedan inkuberades cellerna i 30 minuter i mörker vid 4 ° C med Annexin V-FITC och PI i fosfatbuffert och analyseras på flödescytometern (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) inom en timme efter färgning.

Statistisk analys

Alla data visades som medelvärde ± SD. Skillnaden mellan grupper analyserades med envägs ANOVA och Student-Newman-Keuls (SNK) -q test med en SPSS 12.0 för Windows-program. Statistisk signifikans definierades som * p < 0,05 och ** p. ≪ 0,01

Tack till

Vi tackar Wu Ke, Shi Liang Deng Meizhou, Li Hang och Li Wei för sin expert tekniskt bistånd .

• PLOS ONE: långsiktiga resultat och prognostiska faktorer för magcancer Patienter med mikroskopisk Peritoneal karcinomatos
• PLOS ONE: riskbedömning för magcancer orsakas av Helicobacter pylori Använda CagA sekvensmarkörer