Абстрактный
Фон
<р> AP-4 принадлежит к основной спирали -loop-винтового лейцин-молнии подгруппу; он контролирует экспрессию генов мишеней, регулирует рост, развитие и апоптоз клеток и участвует в онкогенеза. Наши предыдущие исследования показали, что АР-4 часто избыточно экспрессируется в рака желудка и может быть связано с плохим прогнозом. Целью данного исследования является изучение ли глушение AP-4 может изменить биологические характеристики клеток рака желудка.
Два конкретных миРНК таргетирование AP-4 были разработаны, синтезированы и трансфицировали в желудочном линий раковых клеток и нормальных клеток слизистой оболочки человека. Выражение АР-4 измеряли в режиме реального времени количественной ПЦР и Вестерн-блоттинга. Пролиферация клеток и химио-чувствительность были обнаружены ССК-8 анализа. Анализ клеточного цикла и апоптозу анализ проводили с помощью проточной цитометрии, и относительное выражение регуляторов клеточного цикла были обнаружены в реальном времени количественной ПЦР и Вестерн-блот, экспрессия факторов, вовлеченных в пути апоптоза были изучены в мРНК, так и на уровне белка.
Результаты
<р> выражение AP-4 был подавлен трансфекции миРНК и эффекты AP-4 нокдаун длилась от 24 до 96 часов. МиРНК-опосредованной глушение AP-4 подавляло клеточную пролиферацию, апоптоз, индуцированный и сенсибилизированных раковых клеток к противоопухолевым препаратам,. Кроме того, уровень экспрессии р21, р53 и каспазы-9 были увеличены, когда был нокдаун АР-4, но экспрессия циклин D1, Bcl-2 и Bcl-X <суб> L ингибируется. Это не вызывает остановку клеточного цикла, когда AP-4 был нокдаун в p53 дефект клетку рака желудка линии Като-III.
Эти результаты продемонстрировали, что ген глушителей АП-4 может эффективно пролиферацию клеток ингибировали, вызвали апоптоз и сенсибилизированные раковые клетки к противоопухолевым препаратам, в пробирке, предполагая, что АР-4 миРНК опосредованного глушителей имеет потенциальную ценность в лечении рака желудка человека
<р> Цитирование:. Лю Х, Чжан Б, Го Y, Лян Q, Ву C, Wu L, и др. (2012) понижающую регуляцию AP-4 подавляет пролиферацию, Индуцирует клеточного цикла и стимулирует апоптоз в клетках человека рак желудка. PLoS ONE 7 (5): e37096. DOI: 10.1371 /journal.pone.0037096
<р> Редактор: Владислав В. Глинский, Университет Миссури-Колумбия, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 4 июня 2011 года; Принято: 18 апреля 2012 года; Опубликовано: 16 мая 2012
<р> Copyright: © 2012 Лю и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> Несмотря на то, что показатели заболеваемости и смертности, связанных с раком желудка постепенно уменьшается в последние годы в большинстве областей [1] мира, [2], рак желудка остается во всем мире бремя болезней, и остается наиболее частой причиной смертельных случаев рака, связанных с небольшим улучшением долгосрочной выживаемости. Наиболее эффективное лечение рака желудка была полностью хирургическое удаление опухолевой ткани с D2 лимфаденэктомии. Кроме адъювантной химиотерапии и лучевой терапии помогли улучшить прогноз. Тем не менее, выживание 5-летний остался очень бедных [1], [3]. Более одного миллиона новых случаев заболевания были диагностированы каждый год, особенно в Восточной Азии, как и в Японии, Корее и Китае. В этих странах, рак желудка остается наиболее распространенной причиной смерти от рака связаны между собой, и точная патогенез остается неизвестной [3].
<Р> транскрипционные факторы являются важными компонентами регуляторные [4]. Они принадлежали к семейству спираль-петля-спираль и играет важную роль в клеточной пролиферации и дифференцировки, определения клеточных клонов, экспрессия внутриклеточного генетической информации, а также другие основные процессы [5]. В качестве члена основная спираль-петля-спираль лейцин-молния (bHLH-LZ) подгруппы bHLH белков [6], активирующего энхансер-связывающий белок 4 (AP-4) был первоначально идентифицирован как клеточного белка, который связан с обезьяньим вирусом 40 (SV40), энхансер и активировали вирусную позднюю транскрипцию генов [7]. АР-4 представляет собой Повсеместно выраженный фактор транскрипции, и может управлять транскрипционных сетей при клеточной дифференцировки путем формирования гомодимеры и связывания с симметричной последовательности ДНК, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 представляет собой лиганд для иммуноглобулина каппа-элементов промотора E-коробки, которые могут быть причастны к иммунодефицитных заболеваний [13], [14]. Кроме того, в отличие от других белков чЛГ, AP-4 содержит два дополнительных мотива димеризации белка, состоящие из лейцин повторяют элементы LR1 и LR2. Следовательно, АР-4 представляет собой специфическую трехстороннюю структуру димеризации, предполагая, что АР-4 может взаимодействовать с широким разнообразием факторов транскрипции [8], [14]. AP-4 регулирует экспрессию некоторых генов [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Например, он активирует транскрипцию гена hMTIIA и участвует в регуляции экспрессии человеческого Проэнкефалиновый [22], и он может играть определенную роль в экспрессии семейства генов панкреатической экзокринной [23]. В последнее время избыточная экспрессия AP-4 сообщили в раке ободочной и прямой кишки, рак молочной железы и простаты [9], [18], [24].
<Р> РНК-интерференции (RNAi) представляет собой процесс последовательности конкретной должности -transcriptional ген глушителей инициированный двухцепочечной РНК [25], что может привести к молчанию специфического клеточного гена и обеспечивают мощный обратной генетики подход к анализу функций генов как в лабораторных условиях, так и в естественных условиях [26]. В настоящее время наиболее широко используются молекулы нуклеиновых кислот на основе последовательности конкретных генов глушителей были небольшие интерферирующие РНК [27], названный миРНК, который состоит из симметричных дуплексов 19-21 пар оснований [28]. Метод миРНК может ингибировать экспрессию гена-мишени при специфичности, эффективности и выносливости [29].
<Р> Ранее сообщалось, что АР-4 был избыточно экспрессируется при раке желудка, и что оно может быть связано с плохим прогнозом [30]. В настоящем исследовании мы также исследовали функцию AP-4 в желудка человека раковых клеток с РНК-интерференции.
Конкретные миРНК ориентации на экспрессию AP-4 в клетках рака желудка человека и нормальных клеток слизистой оболочки
<р> Чтобы оценить эффект киРНК-опосредованного молчания экспрессии гена АР-4, контроль миРНК и АР-4 специфических siРНК, трансфицировали в клетки в течение 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч. Эффективность понижающий регуляции экспрессии гена АР-4 была обнаружена в реальном времени количественной ПЦР и вестерн-блоттинга. Как показано на рисунке 1, AP-4 конкретных миРНК может эффективно ингибировать транскрипцию генов и трансляции. Уровни мРНК и белок АП-4 были снижены с АП-4 миРНК трансфекции группу, но не в контроле миРНК (рисунок 1). SiРНК, индуцированное подавление экспрессии АП-4 может быть обнаружен в течение 24 часов после трансфекции. Тем не менее, степень ингибирования уменьшилось через 72 часа после трансфекции. Наиболее эффективный момент времени было между 48 ч до 72 ч в супрессии экспрессии AP-4. Относительные уровни транскриптов мРНК значительно уменьшилось почти на 90% в миРНК-1 группе, и 95% в миРНК-2 группы. Был статистическая значимость между миРНК группой и контрольной группой.
Сайленсинг экспрессии индуцированного остановки клеточного цикла АР-4 и модулирует экспрессию р53, р21 и циклин D1
<р> эффект АП-4 на прогрессии клеточного цикла была исследована , Клетки рака желудка человека были трансфицированы 20 управления миРНК нМ и АР-4 специфических миРНК в течение 48 ч, соответственно, с последующим пропидиума йодида окрашивания и проточной цитометрии анализа клеточного цикла. В то время как клетки, трансфецированные с контрольными миРНК прогрессировали через различные фазы клеточного цикла, клеток, трансфицированных AP-4 конкретных миРНК отображаются значительно более высокую частоту клеток в фазах G0 /G1 (SGC7901 /миРНК-1: 68,81%; SGC7901 /миРНК-2: 68,97%; АГС /миРНК-1: 61,92%; АГС /миРНК-2: 63,67%), и более низкая частота клеток в S-фазе (SGC7901 /миРНК-1: 29,57%; SGC7901 /миРНК-2: 29,84%; АГС /миРНК-1: 24,36%; АГС /миРНК-2: 22,91%). Процент клеток в фазах G0 /G1 в клетке, трансфицированных АР-4 миРНК была значительно выше, чем у фиктивных клеток (SGC7901: 54,65%; АГС: 48,44%) (р ≪ 0,05) или контроль миРНК (SGC7901 /управление миРНК: 52,18%; AGS /контроль миРНК: 50,38%) (рисунок 3). Таким образом, трансфекция с AP-4-специфических киРНК индуцированных клеток циклин арест на фазах G0 /G1.
<Р> AP-4 специфических миРНК индуцированных блок клеточного цикла был исследован путем наблюдения эффектов лечения AP-4 конкретных миРНК на относительном выражении регуляторов клеточного цикла: опухолевого супрессора р53 зависимой циклин ингибитор киназы р21, и G (1) -фазы специфические циклин D1, которые были критическими регуляторами клеточного цикла и пролиферации. Через сорок восемь часов после трансфекции, желудочные раковые клетки человека собирали для ПЦР в реальном времени и анализа иммуноблоттинга. Трансфекция с AP-4 специфических миРНК может повышающего регулировать экспрессию p53 и p21 белка. Модулирующее действие AP-4 миРНК была выше, чем у контрольной миРНК (рисунок 4) (р &л; 0,01). Как и следовало ожидать, циклин D1 был вниз регулируется по сравнению с контрольной группой миРНК и имитационной группы (рисунок 4) (р &л; 0,01). Эти данные дополнительно подтверждают гипотезу, что глушение экспрессию AP-4 изменили экспрессию других регуляторов клеточного езда на велосипеде, индуцированное клеточного цикла и ингибирует пролиферацию клеток рака желудка человека
Обнаружение апоптоза и факторов, участвующих в апоптоз путь выражение Обсуждение Кроме того, глушение АП-4, индуцированный арест клеточного цикла в фазах G0 /G1, анализ потенциального механизмов, лежащих в основе эффектов АР-4 глушителей на ингибирование пролиферации клеток желудка человека характеризовались экспрессией регуляторов цикла связанных клеток. Мы обнаружили, что вниз регуляции экспрессии AP-4 ингибирует экспрессию циклина D1, но вверх регулирует экспрессию р53 и р21. P53 и P21 высказано предположение, чтобы быть отрицательным регулятором клеточного цикла и пролиферации [46], [47], с другой стороны, циклин D1, способствует прогрессии через G <югу> 1-S-фазе клеточного цикла [48 ]. Понижающей регуляции экспрессии AP-4, р21 и р53 тем временем может сделать остановку клеточного цикла вызвал нокдаун AP-4 исчезновения. Эти результаты согласуются с моделью, в которой AP-4 индуцирует остановку клеточного цикла, регулируя экспрессию регуляторов клеточного цикла, такие как р53, р21 и циклин D1. Линия клеток и клеточная культура Статистический анализ Выражение признательности
<р> Для количественной оценки влияния АП-4 специфических киРНК на апоптоз в раковых клетках желудка человека, аннексина-V и PI окрашивания анализы были использованы в сочетании с проточной цитометрии. Клетки окрашивали аннексина V-FITC /PI и закрытого типа в нижнем правом (LR) и верхний правый (UR) квадранта. Клетки в LR и UR считались ранней апоптическая (аннексина + /PI -) и поздний апоптическая (аннексина + /PI +) соответственно. Клетки в LL (внизу слева) и UL (вверху слева) квадранта считались живыми и некротические соответственно. Была выражена Степень апоптоза как сумма процентных величин в LR и UR квадранта. Апоптические ставки были показаны на рисунке 5. Обработанные клетки с AP-4 миРНК показал более апоптотических клеток (SGC7901 /миРНК-1: 14,0%; SGC7901 /миРНК-2: 11,5%; AGS /миРНК-1: 20,1%; AGS /миРНК-2: 23,6%), чем отрицательные (SGC7901 /управления миРНК: 5,5%; AGS /контроль миРНК: 6,7%) (р &л; 0,05) и заготовки (SGC7901: 4,2%; АГС: 4,9%) (р &л; 0,05) , Эти результаты показали, что АР-4 специфических siРНК, были способны индуцировать апоптоз в этих клетках.
<Р> Кроме того, мы исследовали экспрессию факторов, вовлеченных в пути апоптоза с ПЦР в реальном времени на уровне мРНК, таких как Bcl-2 , Bcl-х <югу> L, каспазы-9, каспазы-8 и Вах. Он показал, что нокдаун АР-4 может повышающего регулировать экспрессию Baspase-9 клеток рака желудка человека, а модулирующее действие АП-4 киРНК было больше, чем у контрольной миРНК (рисунок 6) (р &л; 0,01). Выражение Bcl-2 и Bcl-х <югу> L были снижены по сравнению с контролем миРНК или притворной группы (рисунок 6) (р &л; 0,01). Эти данные также подтверждается, что глушение экспрессии AP-4 приводило к апоптозу клеток рака желудка человека. Тем не менее, экспрессия каспазы-8 и Вах были различными в разных клеточных линиях после трансфекции. Через сорок восемь часов после трансфекции, каспазы-8 и Вах были более экспрессии в клетках AGS. В SGC7901 клетках экспрессия Bax увеличилась, но экспрессия каспазы-8 увеличилось лишь в миРНК-1 группы. В миРНК-2 группы, экспрессия каспазы-8 не было статистически значимым пострадавших (Рисунок 6).
AP-4 глушителей может регулировать клеточный цикл и апоптоз клеток в обоих р53-зависимых и независимых манеры
<р> для того, чтобы проверить, был ли повышающая регуляция р53 в AP 4-нокдаун клеток рака желудка решающее значение для роли остановки клеточного цикла, клеток Като-III, своего рода p53 дефектов желудка линии раковых клеток использовали для оценки зависимости AP -4 нокдаун эффект на р53. Мы обнаружили, что нокдаун AP-4 в AGS с p53 дикого типа или SGC7901 с мутантным р53 может вызвать остановку клеточного цикла, но это явление не наблюдалось в клетках Като-III (рисунок 7), процент клеток в G0 /G1 фазы 57,82% (миРНК-1), 59,05% (миРНК-2), 59,59% (контроль миРНК) и 59,06% (макет). Те показали, что нокдаун AP-4 может быть, регулирует клеточный цикл посредством p53-p21 пути. Апоптоз популяция была также обнаружена в клетках Като-III с аннексина V-FITC и PI окрашивания. Результаты показали, что скорость Апоптоз клеток Като-III, трансфицированных АР-4 миРНК (миРНК-1: 7,9%; миРНК-2: 9,2%) был выше, чем в контрольной группе миРНК (3,3%) (р ≪ 0,05) и напускной клетки (3,5%) (р ≪ 0,05), но в меньшей степени, чем это было на АГС (р &л; 0,05) и SGC7901 клеток (р &л; 0,05), что указывает на глушителей AP-4 может индуцировать апоптоз в желудочном раковых клеток через как p53-зависимые и независимые-манеры.
<р> Джин является одним из основных и очень консервативными процесс. Транскрипция, первый шаг в экспрессии генов, осуществляется структурно законсервированы ДНК зависимой РНК-полимеразы, что приводит к синтезу молекулы РНК из ДНК-матрицы [31]. Транскрипционные факторы, форма инициации транскрипции РНК-комплекс с polymeras II, участвуют в процессе инициации транскрипции для регуляции экспрессии генов. Они могут играть важную роль в трансформации, онкогенеза, опухолевой прогрессии и метастазирования путем регуляции транскрипции и, следовательно, экспрессии гена [32], [33], [34]. фактор транскрипции AP-4, принадлежащие к быстро растущей группе чЛГ белков [8] участвует в дифференциации и пролиферации клеток [35], [36], [37], [38], [39], влияет на события клеточного цикла и апоптоз, регулирует и контролирует некоторую экспрессию генов [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. В последнее время, было сообщено, что АР-4 повышающей регуляции в карциномы толстой кишки, рака молочной железы и рака предстательной железы [9], [18], [24]. Кроме того, AP-4 положительное выражение указали плохой прогноз при значении более степени, статус узла или размера в ER + рак молочной железы, а также возможную связь с химио- чувствительности [40]. В нашем ранее исследовании мы обнаружили, что экспрессия AP-4 избыточно экспрессируется и совместно связаны с плохим прогнозом [30]. Это может быть молекулярный маркер для диагностики и прогнозирования рака желудка. В данном исследовании,. Мы разработали два АР-4 специфических миРНК ингибировать экспрессию гена АР-4 в клеток рака желудка человека. Они были хорошо развиты и трансфицировали в клетки, чтобы привести к нокдауна экспрессии гена AP-4. Мы обнаружили, что наиболее сильнодействующий момент времени в подавлении экспрессии АП-4 в клеток рака желудка было 48 ч и 72 ч после трансфекции. Таким образом, мы выбрали первое, чтобы в дальнейшем провести соответствующую экспертизу.
<Р> Ранее было показано, что фактор транскрипции AP-4, в отличие от других белков чЛГ, содержал два различных элемента лейцин повтора, который также прямой димеризации и позволяют селективное образование комплекса вездесущего AP-4 белка [8], [41].
<р> AP-4 может играть важную роль в модуляции клеточных функций посредством регуляции генов, участвующих в вирусной производства [7], [16 ], [22], [42], [43], рост клеток и выживание [9], [17], [23], [44], иммунный ответ [14], [41], [45], и ангиогенез [21]. Питер Юнг и др обнаружили, что AP-4 может кодировать с-Мус-индуцируемый репрессор для ингибирования экспрессии p21 [9], и, предположительно, играет важную роль в опосредовании пролиферативную активность с-Мус [10]. Кроме того, AP-4 влияние на чувствительность к апоптозу путем регуляции экспрессии каспазы-9 [17]. В этом исследовании мы обнаружили, что понижающая регуляция ПД-4 ингибирует пролиферацию клеток рака желудка человека в лабораторных условиях. Отношение ингибирования пролиферации АП-4 специфических киРНК была значительно ниже, чем у клеток, трансфецированных с контрольной миРНК или макетом группы.
<Р> Химиотерапия является одной важной стратегией при лечении рака желудка, но часто не удается из-за устойчивость к противоопухолевым препаратам. Было сообщено, что AP-4 положительное выражение было возможно, связано с химио- чувствительности [40]. Далее мы исследовали роль AP-4 в регуляции химио- чувствительности раковых клетках желудка человека и обнаружили, что ингибирование AP-4 может значительно повысить чувствительность этих клеток к ДОПОГ, 5-ФУ или лечения цис-plantinum, предполагая что ингибирование AP-4 может оказать благотворное влияние на химио- чувствительности.
<Р> Апоптоз, или запрограммированная гибель клеток, известно принять участие в различных биологических процессах, двумя основными путями, апоптотических митохондриальной (внутренней) пути и рецептора смерти (примесного) затрагивающего пути [49]. Мы обнаружили, что глушение выражение AP-4 апоптоз клеток стало началом в нашем эксперименте, который показал, что AP-4 подавляется апоптоз клеток рака желудка человека.
<Р> В нашем эксперименте увеличение уровней каспазы-9 и понижающую регуляцию из Bcl-2 и Bcl-X <суб> L были обнаружены в раковых клетках желудка человека, указывая, что нокдаун АР-4, активированных как внутренний и внешний пути к апоптоз раковых клеток. [49], [50]
<р> Таким образом, данные показывают, что RNAi-опосредованной понижающей регуляции фактора транскрипции AP-4 эффективно ингибирует пролиферацию клеток, показали остановку клеточного цикла, вызвали апоптоз и усиливается химио- чувствительность из клеток рака желудка человека с пониженной экспрессии циклина D1, Bcl-2 и Bcl-X <суб> L и активированный р21, р53 и экспрессии каспазы-9, которые предложили АР-4 может быть онкогенов играет важную роль в онкогенеза , Хотя точный механизм этой роли необходимо провести дальнейшее расследование, АР-4specific-миРНК может быть потенциальных значений в качестве новых терапевтических агентов для лечения рака желудка человека.
Материалы и методы
<р> желудка человека линии раковых клеток АГС с p53 дикого типа, SGC7901 с мутантным р53 (полученного из университета города Ухань) и Като-III с p53 геном удаления (Zhiyan Bio Technology Co, Шанхай) культивировали в DMEM, среда или среда RPMI1640 (Invitrogen), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen), пенициллином (100 ед /мл) и стрептомицина (100 мкг /мл). Клетки выдерживали при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <суб> 2.
Удельное миРНК и трансфекция
<р> последовательности кДНК гена АР-4 была приготовлена из Genbank ( NM_003223) и нацеливающие последовательности из двух 21-нуклеотидных различных киРНК были разработаны и синтезированы химическим путем (Qiagen, Германия). Нуклеотидные последовательности были следующими: миРНК-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(смысловой) и 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (антисмысловой). миРНК-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(смысловой) и 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (антисмысловой). Allstars отрицательный контроль миРНК (Qiagen, Германия) использовали в качестве зашифрованным контроля миРНК. Клетки высевают в 6-луночные планшеты и миРНК трансфицировали в культуре клеток с Липофектамином 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя.
в режиме реального времени количественный ПЦР
<р> Общая Выделение РНК проводили используя RNAiso Plus (Takara, Japan) в соответствии с протоколом производителя. КДНК из общей РНК синтезировали с использованием набора реагентов PrimeScript® RT (Takara, Japan). Экспрессии мРНК оценивали с помощью ПЦР в реальном времени на качестве ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Сингапур) с Fast SYBR Green PCR реагентами. GAPDH, был применен в качестве внутреннего контроля. Концентрации реагентов доводили до достижения конечного объема 20 мкл, содержащем 2 мкл обратной транскрипции продукт 10 мкл быстрого SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), и 0,5 мкл 10 мкМ вперед и обратного праймеров. Реакцию проводили 45 циклов амплификации 95 ° С в течение 3 с и 60 ° С в течение 30 с. Следующие праймеры (Табл.1). ПЦР-праймеры были разработаны Primer 5.0 и поиск Blast, чтобы проверить специфичность. Последовательности праймеров приведены используемые в таблицах 1. Результаты были рассчитаны с использованием 2 -ΔΔCt метод.
Вестерн-блот
<р> Белки экстрагировали набора для экстракции белка (Beyotime, Китай) по к направлению. Белок разбавляли до 3 мкг /мкл и разделяли с помощью 10% SDS-PAGE, переносили на поливинилиденфторид (ПВДФ) мембраны (Millipore, США), а затем блокировали в 5% обезжиренном сухом молоке в TBST в течение 1 часа при комнатной температуре. Иммуноблотинга проводили с использованием анти-AP-4-антитела (Sigma-Aldrich, Шанхай, разведение 1:1000), анти-р21-антитела (Sigma-Aldrich, Шанхай, разведение 1:1000), анти-р53-антитела (Abcam, Великобритания, разбавление 1:500) и анти-циклин D1 антитела (Abcam, Великобритания, разбавление 1:500) в течение ночи при температуре 4 ° С. После того, как трижды промывали TBST, мембрану инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена вторичных антител (разведение 1:2000, Boster, Китай) в течение 1 часа при комнатной температуре. Результаты визуализировали с помощью системы промокательной обнаружения ECL Plus Western в соответствии с инструкциями изготовителя. Анти-β-актина (разведение 1:1000, Boster, Китай) антитело выступал в качестве внутреннего контроля.
Измерение пролиферации клеток
<р> Влияние глушителей AP-4 на пролиферацию клеток рака желудка после 48 часов трансфекции измеряли с помощью Cell счетную Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, Китай), в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. В кратком изложении, рака желудка клетки культивировали в 96-луночных планшетах и трансфицировали 20 нМ управления миРНК, AP-4 специфических киРНК. Через 48 ч 10 мкл ССК-8 реагента добавляли в каждую лунку, после 1 часа инкубации при 37 ° С, измеренное поглощение при 450 нм. Относительные уровни пролиферации клеток в каждой группе клеток рассчитывали по следующей формуле: R = (A2-A1) /A2 × 100% и P = A1 /A2 × 100%, в которой R является относительно ингибировани и Р был относительно коэффициент пролиферации роста клеток; A1was среднее значение поглощения трансфицированных клеток; и А2 было среднее значение поглощения нетрансфецированной контрольных клеток без какого-либо медикаментозного лечения. Все эксперименты были проведены с 5 скважин на эксперимент и повторяют по меньшей мере три раза.
клеточного цикла анализа
<р> Клетки собирали через 48 часов после трансфекции и фиксировали в 70% охлажденного на льду этанола в течение ночи, промывают с 1 × PBS и окрашивали пропидийиодидом (PI) (50 мкг /мл) в 1 × PBS с добавлением РНКазы (50 мкг /мл) в течение 30 минут. Испытания проводились в трех экземплярах для каждого образца, а также анализ проводили с помощью проточной цитометрии (FACS CantoII, BD Bioscience, США) в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
тест химио- чувствительности в пробирке
<р> Как было описано ранее, ССК-8 анализ использовали для оценки эффекта химио- чувствительности клеток рака желудка к противоопухолевым препаратам,. Короче говоря, через шесть часов после трансфекции среду удаляли и заменяли свежей средой, содержащей различные концентрации лекарственного средства против опухоли (ADR, 5-ФУ или цис-платина) и инкубировали в течение 48 часов. Относительно ингибирующей скорость роста клеток рассчитывали по формуле, перечисленных выше.
Апоптоз анализ с помощью аннексина V-FITC и пропидийиодидом (PI) окрашивание
<р> Для оценки скорости апоптоза клеток, апоптоз количественно с помощью аннексина-V-FITC и пропидиума йодистого двойного окрашивания с использованием аннексина-V /FITC комплект (Antgene, Китай). Клетки были собраны в соответствии с инструкциями изготовителя через 48 часов после трансфекции, промывали холодным PBS и суспендировали в буфере для связывания, а затем клетки инкубировали 30 минут в темноте при 4 ° C с аннексина V-FITC и PI в фосфатном буфере и анализировали на проточном цитометре (FACS CantoII, BD Bioscience, США) в течение 1 ч после окрашивания.
<р> Все данные были показаны как среднее ± стандартное отклонение. Разница между группами анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и Student-Newman-Keuls (SNK) -q испытание с использованием SPSS 12.0 для программного обеспечения Windows. Статистическая значимость была определена как * р &ЛТ; 0,05 и ** р &лт;. 0.01
<р> Мы благодарим Wu Ke, Ши Лян, Дэн Мэйчжоу, Ли Ханг и Ли Вэй для их экспертной технической помощи .
Новая модель трансплантации микробиома влагалища
Гигиена полости рта и тяжесть COVID-19 - связь
Алкоголь повреждает микробиом во рту
Исследования говорят о собачьей инфекции SARS-CoV-2,
Почему вы должны включать в свой рацион натуральные источники клетчатки
Бактерии кишечника укрепляют мышцы у пожилых людей
Пищевые реакции регулируются микробиомом кишечника,
находит новое исследование Исследование, опубликованное на этой неделе, показывает, что взаимодействие бактерий в нашем кишечнике (микробиом кишечника) с пищей, которую мы едим, заметно различается ме
Растительные диеты улучшают здоровье сердца за счет микробиома кишечника
Новое исследование, опубликованное в феврале 2020 г. Журнал Американского колледжа кардиологии сообщает, что сокращение потребления продуктов животного происхождения и диеты на основе растений могут
Препарат для похудания Wegovy одобрен FDA
Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило инъекцию Wegovy (семаглутид) (2,4 мг один раз в неделю) в качестве лечения хронического контроля веса