PLoS ONE: down-regulation di AP-4 inibisce la proliferazione, induce arresto del ciclo cellulare e favorisce l'apoptosi nelle cellule umane cancro gastrico

Astratto

Sfondo

AP-4 appartiene alla elica-ansa-elica leucina cerniera sottogruppo; controlla l'espressione del gene bersaglio, regola la crescita, lo sviluppo e l'apoptosi delle cellule ed è stato implicato nella tumorigenesi. I nostri studi precedenti hanno indicato che AP-4 è stato spesso sovraespresso nei tumori gastrici e può essere associata con la prognosi infausta. Lo scopo di questo studio è quello di verificare se il silenziamento di AP-4 può alterare le caratteristiche biologiche delle cellule di cancro gastrico.

Metodi

Due siRNA specifiche rivolte AP-4 sono stati progettati, sintetizzati e transfettate nelle linee di cellule di cancro gastrico e normali cellule della mucosa umane. AP-4 espressione è stata misurata con real-time PCR quantitativa e Western Blot. La proliferazione cellulare e chemio-sensibilità sono stati rilevati da CCK-8 dosaggio. analisi del ciclo cellulare e saggio apoptosi sono stati eseguiti da citofluorimetro, e l'espressione relativa dei regolatori del ciclo cellulare sono stati rilevati mediante real-time PCR quantitativa e Western Blot, espressione dei fattori coinvolti nella via apoptosi sono stati esaminati in mRNA e il livello di proteine.

Risultati

l'espressione di AP-4 è stato messo a tacere dalla transfezione siRNA e gli effetti di AP-4 atterramento durato 24 a 96 ore. Il silenziamento siRNA-mediata di AP-4 soppresso la proliferazione cellulare, l'apoptosi indotta e le cellule tumorali sensibili ai farmaci antitumorali. Inoltre, il livello di espressione di p21, p53 e caspasi-9 sono stati aumentati quando AP-4 è stato knockdown, ma l'espressione della ciclina D1, Bcl-2 e Bcl-x _{L è stato inibito. Essa non ha indotto arresto del ciclo cellulare quando AP-4 è stato atterramento nel p53 difetto gastrica linea di cellule di cancro Kato-III.}

Conclusioni

Questi risultati illustrato che silenziamento genico di AP-4 possono in modo efficiente inibito la proliferazione delle cellule, attivate l'apoptosi e le cellule tumorali sensibilizzati ai farmaci antitumorali in vitro, suggerendo che il silenziamento AP-4 mediata siRNA ha un valore potenziale nel trattamento del cancro gastrico umano

Visto:. Liu X, Zhang B, Guo Y, Liang Q, Wu C, Wu L, et al. (2012) down-regolazione di AP-4 inibisce la proliferazione, induce arresto del ciclo cellulare e favorisce l'apoptosi nelle cellule umane di cancro gastrico. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10.1371 /journal.pone.0037096

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Stati Uniti d'America

Received: 4 Giugno 2011; Accettato: 18 Aprile 2012; Pubblicato: 16 Maggio 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stata sostenuta dalla National Science Foundation naturale della Cina. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

Anche se i tassi di incidenza e mortalità associata a cancro gastrico hanno gradualmente diminuito negli ultimi anni nella maggior parte delle aree del mondo [1], [2], il cancro gastrico resta un onere di salute in tutto il mondo, e rimane la causa più comune dei decessi per cancro correlati con poca miglioramento della sopravvivenza a lungo termine. Il trattamento più efficace del cancro gastrico è stata la rimozione completamente chirurgica del tessuto neoplastico con linfoadenectomia D2. Inoltre adiuvante chemioterapia e radioterapia hanno assistito a migliorare la prognosi. Anche così, la sopravvivenza a 5 anni è rimasto molto povera [1], [3]. Più di un milione di nuovi casi sono stati diagnosticati ogni anno, soprattutto in Asia orientale, come il Giappone, la Corea e la Cina. In questi paesi, il cancro gastrico resta la causa più comune di morte per cancro correlati, e la patogenesi esatta rimane sconosciuta [3].

I fattori di trascrizione sono componenti importanti di regolazione [4]. Essi appartenevano alla famiglia elica-ansa-elica e ha giocato un ruolo importante nella proliferazione e differenziazione cellulare, la determinazione linea cellulare, espressione dell'informazione genetica intracellulare, e altri processi essenziali [5]. In qualità di membro del elica-ansa-elica leucina-cerniera (bHLH-LZ) sottogruppo di proteine ​​bHLH [6], attivando enhancer binding protein 4 (AP-4) è stato inizialmente identificato come una proteina cellulare che legava al virus delle scimmie 40 (SV40) enhancer e attiva la trascrizione virale tardo gene [7]. AP-4 è un fattore di trascrizione ubiquitaria e può controllare reti trascrizionali durante la differenziazione cellulare formando homodimers e vincolante alla sequenza di DNA simmetrica, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 è un ligando per immunoglobuline kappa promotore E-box elementi, che possono essere implicati a malattie da immunodeficienza [13], [14]. Inoltre, a differenza di altre proteine ​​HLH, AP-4 contiene due motivi ulteriori proteine ​​dimerizzazione costituiti da elementi leucina ripetizione LR1 e LR2. Quindi, AP-4 presenta una specifica struttura tripartita dimerizzazione, suggerendo che AP-4 può interagire con una varietà di fattori di trascrizione [8], [14]. AP-4 regola l'espressione di alcuni geni [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Per esempio, si attiva la trascrizione del gene hMTIIA e partecipa alla regolazione dell'espressione proenkephalin umano [22], e può svolgere un ruolo nell'espressione della famiglia genica esocrina pancreatica [23]. Recentemente, la sovraespressione di AP-4 è stato riportato nel cancro del cancro colorettale, il cancro al seno e alla prostata [9], [18], [24].

RNA interference (RNAi) è un processo di specifica posta sequenza -transcriptional silenziamento genico avviato dal doppio filamento RNA [25], che può portare al silenziamento del gene specifico cellulare e fornire un potente approccio genetica inversa per analizzare funzioni geniche sia in vitro che in vivo [26]. Attualmente le molecole più utilizzate nucleici a base di acido sequenza-specifiche silenziamento genico erano piccoli RNA interferenti [27], siRNA nome, che consiste di due piani simmetrici di 19-21 coppie di basi [28]. Il metodo di siRNA potrebbe inibire l'espressione del gene bersaglio con la specificità, l'efficienza e la resistenza [29].

Abbiamo riportato in precedenza che AP-4 è stato sovraespresso nel cancro gastrico e che può essere associato con i poveri prognosi [30]. Nel presente studio, abbiamo esaminato ulteriormente la funzione AP-4 nella cella cancro gastrico umano con RNA interference.

Risultati

siRNA specifiche rivolte l'espressione AP-4 nelle cellule di cancro gastrico umano e umano normali cellule della mucosa

per valutare l'effetto della siRNA-mediata silenzio della espressione genica AP-4, il controllo siRNA e AP-4 siRNA specifici sono stati trasfettati in cellule per 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. L'efficacia di espressione down-regolazione di AP-4 gene è stato rilevato mediante real-time PCR quantitativa e Western Blot. Come mostrato in figura 1, AP-4 siRNA specifici potrebbero effettivamente inibire la trascrizione genica e traduzione. I livelli di mRNA e di proteine ​​di AP-4 sono stati ridotti con AP-4 siRNA gruppo trasfezione ma non nel controllo siRNA (Figura 1). Il indotta soppressione siRNA di AP-4 espressione potrebbe essere rilevato in 24 ore dopo la trasfezione. Tuttavia, il rapporto inibizione diminuita 72 ore dopo la trasfezione. Il punto di tempo più efficiente erano tra 48 ore a 72 ore in espressione sopprimere di AP-4. I livelli relativi di mRNA trascritti significativamente diminuite di quasi il 90% in siRNA-1 gruppo, e il 95% in siRNA-2 gruppo. C'era una significatività statistica tra il gruppo siRNA e il gruppo di controllo.

down-regulation di AP-4 espressione inibito la proliferazione cellulare e sensibilizzati cellule di cancro gastrico umano di farmaci antitumorali

Per esaminare l'effetto di AP-4 siRNA specifici sulla proliferazione cellulare e chemio-sensibilità delle cellule tumorali, 20 nM di AP-4 siRNA specifici o siRNA di controllo sono state trasfettate e la proliferazione cellulare è stata determinata da CCK-8 dosaggio 48 ore dopo la trasfezione. Abbiamo trovato che knockdown AP-4 potrebbe inibire la proliferazione di linee cellulari di cancro gastrico SGC7901 e AGS (Figura 2), ma non nel normale linea cellulare mucosa GES-1 rispetto alla trasfezione di controllo siRNA in 48 ore (Figura 2). Questi risultati indicano che AP-4 siRNAs attenuati la proliferazione cellulare delle cellule di cancro gastrico in vitro. Inoltre, abbiamo studiato il ruolo della AP-4 nella regolazione della chemio-sensibilità delle cellule di cancro gastrico umano. Abbiamo confrontato la sensibilità ai farmaci di AP-4 siRNA con quella di siRNA controllo o cellule finte e abbiamo trovato che i tassi di inibizione relativi di AP-4 siRNA specifici erano significativamente superiore a quello del controllo siRNA o cellule finti (p < 0,0001) (Figura 2 ). Inoltre, AP-4 siRNAs migliorata notevolmente la sensibilità delle cellule a ADR, 5-FU o il trattamento cis-plantinum a due dosi diverso (Figura 2), questi suggerito che down-regolazione di AP-4 può avere un effetto benefico nella sensibilità della chemioterapia.

silenziamento dell'espressione indotta arresto del ciclo cellulare AP-4 e modulata l'espressione di p53, p21 e ciclina D1

l'effetto di AP-4 sulla progressione del ciclo cellulare è stata studiata . cellule di cancro gastrico umano sono state trasfettate con 20 Controllo nM siRNA, e le siRNA specifici AP-4 per 48 ore, rispettivamente, seguiti da ioduro di propidio colorazione e citometria a flusso analisi del ciclo cellulare. Mentre le cellule trasfettate con siRNA controllo progredito attraverso diverse fasi del ciclo cellulare, le cellule trasfettate con AP-4 siRNA specifici mostrata significativamente più alta frequenza di cellule nelle fasi G0 /G1 (SGC7901 /siRNA-1: 68.81%; SGC7901 /siRNA-2: 68.97%; AGS /siRNA-1: 61.92%; AGS /siRNA-2: 63.67%) e una minore frequenza di cellule in fase S (SGC7901 /siRNA-1: 29.57%; SGC7901 /siRNA-2: 29.84%; AGS /siRNA-1: 24.36%; AGS /siRNA-2: 22.91%). La percentuale di cellule in fase G0 /G1 nella cellula transfettate con AP-4 siRNAs era significativamente più alta di quella delle cellule finti (SGC7901: 54.65%; AGS: 48.44%) (p < 0,05) o controllare siRNA (SGC7901 /controllo siRNA: 52.18%; AGS /controllo siRNA: 50.38%) (Figura 3). Pertanto, trasfezione con siRNA AP-4-specifici indotta arresto ciclina cella fasi G0 /G1.

Il blocco del ciclo cellulare AP-4 siRNA specifici indotta è stato ulteriormente approfondito osservando gli effetti del trattamento AP-4 siRNA specifici sulla relativa espressione di regolatori del ciclo cellulare: il soppressore del tumore p53, la ciclina dipendente chinasi p21, e G (1) specifico -phase ciclina D1, che erano regolatori critici del ciclo cellulare e la proliferazione. Quarantotto ore dopo la trasfezione, le cellule di cancro gastrico umano sono stati raccolti per la real-time PCR e l'analisi immunoblotting. Trasfezione con AP-4 siRNA specifici potrebbe up-regolare l'espressione di p53 e p21 proteine. L'effetto modulatorio di AP-4 siRNAs era maggiore di quella di siRNA di controllo (Figura 4) (p < 0.01). Come previsto, ciclina D1 è stato down-regolato, rispetto al gruppo di controllo siRNA e gruppo finto (Figura 4) (p < 0,01). Questi dati supportati ulteriormente l'ipotesi che tacere l'espressione di AP-4 alterata l'espressione di altri regolatori ciclo cellulare, indotta arresto del ciclo cellulare e inibiscono la proliferazione delle cellule di cancro gastrico umano

Rilevamento di apoptosi e dei fattori coinvolti nella l'apoptosi percorso

Per quantificare l'effetto di AP-4 siRNA specifici apoptosi nelle cellule di cancro gastrico umano, saggi annessina V e PI di colorazione sono stati utilizzati in combinazione con citometria a flusso. Le cellule sono state colorate con Annessina V-FITC /PI e con cancello in basso a destra (LR) e quadranti alto a destra (UR). Le cellule in LR e UR sono stati considerati come apoptosi precoce (Annessina ^{+ /PI -) e la fine apoptotico rispettivamente (Annessina + /PI +). Le cellule in LL (basso a sinistra) e UL (alto a sinistra) i quadranti sono stati considerati rispettivamente vivo e necrotico. Estensione della apoptosi è stata espressa come la somma delle percentuali in LR e UR quadranti. I tassi di apoptosi erano mostrato in Figura 5. cellule trattate con AP-4 siRNA mostrato cellule più apoptotici (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) rispetto al siRNA negativo (SGC7901 /controllo: 5,5%; AGS /controllo siRNA: 6,7%) (p < 0,05) e del bianco (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p < 0,05) . Questi risultati hanno mostrato che AP-4 siRNA specifici sono stati in grado di indurre apoptosi in queste cellule.}

Inoltre, abbiamo esaminato l'espressione di fattori coinvolti nel percorso di apoptosi con real-time PCR a livello di mRNA, come Bcl-2 , Bcl-x _{L, caspasi-9, caspasi-8 e Bax. È emerso che knockdown AP-4 potrebbe up-regolare l'espressione del Baspase-9 in cellule di cancro gastrico umano, e l'effetto modulatorio del AP-4 siRNAs era maggiore di quella di siRNA di controllo (Figura 6) (p < 0.01). L'espressione di Bcl-2 e Bcl-x L sono diminuiti rispetto al controllo siRNA o il gruppo finto (Figura 6) (p < 0,01). Questi dati inoltre sostenuto che il silenziamento di AP-4 espressione ha portato ad apoptosi nelle cellule di cancro gastrico umano. Tuttavia, l'espressione di caspasi-8 e Bax erano diverse in diverse linee cellulari dalla trasfezione. Quarantotto ore dopo la trasfezione, caspasi-8 e Bax sono stati oltre espressione in cellule AGS. In SGC7901 cellule, l'espressione di Bax aumentato, ma l'espressione di caspasi-8 è aumentato solo in siRNA-1 gruppo. In siRNA-2 gruppo, caspasi-8 espressione non è stata significativa colpita (Figura 6).}

AP-4 silenziamento potrebbe regolare il ciclo cellulare e l'apoptosi delle cellule sia in p53-dipendente e indipendente-maniere

per verificare se l'up-regolazione di p53 in AP-4 cellule di cancro gastrico atterramento è stato fondamentale per il ruolo di arresto del ciclo cellulare, le cellule Kato-III, una sorta di p53 difetto linea di cellule di cancro gastrico è stato utilizzato per valutare la dipendenza della AP -4 effetto atterramento su p53. Abbiamo scoperto che atterramento di AP-4 in AGS con wild-type p53 o SGC7901 con p53 mutante potrebbe indurre l'arresto del ciclo cellulare, ma questo fenomeno non è stato osservato in cellule di Kato-III (Figura 7), la percentuale di cellule in G0 /G1 fasi erano 57.82% (siRNA-1), 59.05% (siRNA-2), 59.59% (controllo siRNA) e il 59.06% (finto). Coloro indicato che atterramento AP-4 forse regolano il ciclo cellulare mediante pathway p53-p21. popolazione apoptosi è stata anche rilevata nelle cellule Kato-III con Annessina V-FITC e PI colorazione. I risultati hanno mostrato che il tasso di apoptosi delle cellule Kato-III trasfettate con AP-4 siRNA (siRNA-1: 7.9%; siRNA-2: 9,2%) è stata superiore rispetto al controllo siRNA (3.3%) (p < 0,05) e finto cellule (3,5%) (p < 0,05), ma in misura minore di quanto abbia fatto sui AGS (p < 0,05) e SGC7901 cellule (p < 0,05), che indica che il silenziamento AP-4 potrebbe indurre apoptosi nelle cellule di cancro gastrico attraverso sia p53-dipendente e indipendente-maniere.

Discussione

L'espressione genica è un processo fondamentale e altamente conservato. Trascrizione, il primo passo per l'espressione genica, è eseguita da DNA strutturalmente conservati polimerasi RNA dipendente, che si traduce nella sintesi di una molecola di RNA da uno stampo di DNA [31]. I fattori di trascrizione, complesso di inizio forma di trascrizione con RNA polymeras II, partecipano al processo di trascrizione iniziazione per regolare l'espressione genica. Essi possono svolgere un ruolo importante nella trasformazione, tumorigenesi, progressione tumorale e metastasi regolando la trascrizione e quindi l'espressione genica [32], [33], [34]. fattore di trascrizione AP-4, appartenente alla rapida crescita gruppo di proteine ​​HLH [8] è coinvolta nella differenziazione e proliferazione cellulare [35], [36], [37], [38], [39], affetti eventi del ciclo cellulare e apoptosi, regola e controlla qualche espressione genica [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Recentemente, è stato riportato che AP-4 è stato up-regolata nel carcinoma del colon, cancro al seno e il cancro alla prostata [9], [18], [24]. Inoltre, AP-4 espressione positiva ha indicato una prognosi infausta di significato nel corso di grado, lo stato del nodo o la dimensione del cancro ER + al seno, e una possibile associazione con la chemio-sensibilità [40]. Nel nostro precedente studio, abbiamo scoperto che l'espressione di AP-4 è stato sovraespresso ed è co-correlato ad una prognosi infausta [30]. Può essere un marcatore molecolare per la diagnosi e la prognosi di cancro gastrico. In questo studio,. Abbiamo progettato due siRNA specifici AP-4 per inibire l'espressione del AP-4 gene in cellule di cancro gastrico umano. Essi sono stati ben stabiliti e trasfettati in cellule di provocare knock-down di AP-4 l'espressione genica. Abbiamo trovato che il punto di tempo più potente nel sopprimere l'espressione AP-4 in cellule di cancro gastrico sono stati 48 he 72 h dopo la trasfezione. Così, abbiamo scelto il primo per svolgere ulteriormente fuori esame relativo.

In precedenza, è stato dimostrato che il fattore di trascrizione AP-4, a differenza di altre proteine ​​HLH, conteneva due distinti elementi di leucina ripetizione che anche dimerizzazione diretta e consentire la formazione del complesso selettiva di onnipresente AP-4 proteine ​​[8] [41].

AP-4 potrebbe svolgere un ruolo importante nella modulazione delle funzioni cellulari attraverso la regolazione dei geni coinvolti nella produzione virale [7], [16, ], [22], [42], [43], la crescita cellulare e la sopravvivenza [9], [17], [23], [44], la risposta immunitaria [14], [41], [45], e l'angiogenesi [21]. Peter Jung, et al hanno scoperto che AP-4 potrebbe codificare un c-MYC-inducibile repressore di inibire l'espressione di p21 [9], e presumibilmente svolto un ruolo importante nel mediare l'attività proliferativa di c-MYC [10]. Inoltre, AP-4 influenzato la sensibilità all'apoptosi regolando l'espressione di caspasi-9 [17]. In questo studio, abbiamo scoperto che down-regolazione di AP-4 ha inibito la proliferazione delle cellule di cancro gastrico umano in vitro. Il rapporto inibizione della proliferazione AP-4 siRNA specifici era significativamente inferiore a quella delle cellule trasfettate con siRNA controllo o gruppo di simulazione.

La chemioterapia è una strategia importante nel trattamento del cancro gastrico, ma spesso non riesce a causa di la resistenza ai farmaci antitumorali. E 'stato riferito che la AP-4 espressione positiva è stata possibilmente collegato con la chemio-sensibilità [40]. Abbiamo poi studiato il ruolo di AP-4 nella regolazione della chemio-sensibilità delle cellule tumorali gastriche umane e abbiamo scoperto che l'inibizione della AP-4 potrebbe migliorare in modo significativo la sensibilità di queste cellule di ADR, 5-FU o il trattamento cis-plantinum, suggerendo che l'inibizione di AP-4 può avere un effetto benefico in chemio-sensibilità.

Inoltre, il silenziamento di AP-4, indotta arresto del ciclo cellulare nelle fasi G0 /G1, analisi di un potenziale meccanismi alla base degli effetti il silenziamento AP-4 sulla inibizione della proliferazione delle cellule di cancro gastrico umano sono stati caratterizzati da l'espressione di regolatori del ciclo legati cellulari. Abbiamo scoperto che down-regolazione di AP-4 espressione inibita l'espressione della ciclina D1, ma up-regolata l'espressione di p53 e p21. p53 e p21 è stato ipotizzato essere un regolatore negativo del ciclo cellulare e la proliferazione [46], [47], invece, ciclina D1 promosso progressione attraverso il G _{Fase 1-S del ciclo cellulare [48 ]. espressione down-regolato di AP-4, p21 e p53 nel frattempo potrebbe rendere l'arresto del ciclo cellulare causato atterramento di AP-4 scomparsa. Questi risultati sono in accordo con un modello in cui AP-4 induce arresto del ciclo cellulare regolando l'espressione di regolatori del ciclo cellulare, come p53, p21 e ciclina D1.}

L'apoptosi, o morte cellulare programmata, è noto a partecipare a vari processi biologici da due principali vie di apoptosi, il mitocondriale (intrinseca) percorso e il recettore di morte (estrinseca) percorso [49]. Abbiamo scoperto che il silenziamento dell'espressione AP-4 trigged l'apoptosi delle cellule nel nostro esperimento, che ha dimostrato che AP-4 soppresso apoptosi nelle cellule di cancro gastrico umano.

Nel nostro esperimento, i livelli di caspasi-9 e down-regulation crescente di Bcl-2 e Bcl-x _{L sono stati rilevati nelle cellule di cancro gastrico umano, indicando che atterramento di AP-4 percorsi sia intrinseci ed estrinseci attivati ​​per apoptosi nelle cellule tumorali. [49], [50]}

In sintesi, i dati dimostrano che RNAi mediata down-regolazione del fattore di trascrizione AP-4 inibito efficacemente la proliferazione cellulare, indicato arresto del ciclo cellulare, apoptosi attivato e potenziato chemio-sensibilità di cellule umane di cancro gastrico con la diminuita espressione della ciclina D1, Bcl-2 e Bcl-x _{L e p21 attivato, p53 e caspasi-9 espressione, che ha suggerito AP-4 può essere un oncogene giocare un ruolo importante nella tumorigenesi . Anche se il meccanismo preciso di questo ruolo deve essere ulteriormente indagato, l'AP-4specific-siRNA può essere di valori potenziali come agenti terapeutici per il cancro dello stomaco umano.}

Materiali e Metodi

linea cellulare e coltura cellulare

umani di cellule di cancro gastrico linee AGS con wild-type p53, p53 mutante SGC7901 con (ottenuta presso l'Università di Wuhan) e Kato-III con p53 genoma delezione (Zhiyan Bio Technology Co., Shanghai) sono state coltivate in DMEM medio o RPMI1640 medio (Invitrogen) contenente 10% di siero fetale bovino (Invitrogen), penicillina (100 U /ml) e streptomicina (100 ug /ml). Le cellule sono state mantenute a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO _2.

siRNA specifico e trasfezione

La sequenza di cDNA del gene AP-4 è stato ottenuto da GenBank ( NM_003223) e le sequenze di targeting di due diversi siRNA 21-nucleotide sono stati progettati e sintetizzati chimicamente (Qiagen Germania). Le sequenze nucleotidiche sono state le seguenti: siRNA-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(senso) e 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (antisenso). siRNA-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(senso), e 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (antisenso). Allstars siRNA controllo negativo (Qiagen Germania) sono stati utilizzati come controllo siRNA strapazzate. Le cellule sono state seminate in 6 pozzetti e le siRNA sono state trasfettate in cellule di coltura con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore.

Real-time PCR quantitativa

Totale estrazione di RNA è stata eseguita utilizzando RNAiso più (Takara, Giappone) secondo il protocollo del produttore. I cDNA da RNA totale sono stati sintetizzati utilizzando PrimeScript® RT reagente Kit (Takara, Giappone). L'espressione di mRNA è stata valutata mediante PCR in tempo reale su un ABI StepOne più (Applied Biosystems, Singapore) con Fast reagenti SYBR Green PCR. GAPDH è stato applicato il controllo interno. Le concentrazioni dei reagenti sono stati adeguati per raggiungere un volume finale di 20 ml, contenente 2 ml di prodotto retrotrascritto, 10 ml di veloce SYBR® verde Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), e 0,5 l di 10 micron in avanti e primer inverso. La reazione è stata condotta per 45 cicli di amplificazione di 95 ° C per 3 s e 60 ° C per 30 s. I seguenti primer sono stati progettati (Table.1). primer PCR sono stati progettati da Primer 5.0 e Blast di ricerca per verificare la specificità. sequenze primer utilizzati sono elencati nelle tabelle 1. I risultati sono stati calcolati utilizzando il metodo 2 ^-ΔΔCt.

Western Blot

La proteina è stato estratto con il kit di estrazione di proteine ​​(Beyotime, Cina) secondo alla direzione. La proteina è stata diluita a 3 mg /mL ed è stato separato dal 10% SDS-PAGE, trasferiti al di polivinilidene difluoruro (PVDF) membrane (Millipore, USA), e quindi è bloccato in 5% non grassa latte in polvere in TBST per 1 ora a temperatura ambiente. Immunoblotting è stata effettuata utilizzando anti- AP-4-anticorpi (Sigma-Aldrich, Shanghai, la diluizione 1:1000), anticorpo anti-p21 (Sigma-Aldrich, Shanghai, la diluizione 1:1000), anticorpo anti-p53 (Abcam, Regno Unito, la diluizione 1:500) e anti-ciclina D1 anticorpi (Abcam, Regno Unito, la diluizione 1:500) notte a 4 ° C. Dopo tre volte risciacquati con TBST, la membrana è stata incubata con perossidasi di rafano-anticorpi secondari coniugati (diluizione 1:2000, Boster, Cina) per 1 ora a temperatura ambiente. Il risultato è stato visualizzato dal sistema di rilevazione assorbente ECL più occidentale in base alle istruzioni del produttore. Anti-β-actina (diluizione 1:1000, Boster, Cina) anticorpo ha agito come controllo interno.

Misurazione della proliferazione cellulare

L'impatto di mettere a tacere AP-4 sulla proliferazione delle cellule del cancro gastrico dopo 48 ore di trasfezione è stata misurata da Cell conteggio Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, Cina), in base alle istruzioni del produttore. In breve, cellule di cancro gastrico sono state coltivate in piastre da 96 pozzetti e trasfettate con 20 nM di controllo siRNA, AP-4 siRNA specifici. Dopo 48 ore, 10 ml di CCK-8 reagente è stato aggiunto a ciascun pozzetto, Dopo 1 ora di incubazione a 37 ° C, la densità ottica misurata a 450 nm. I livelli relativi di proliferazione cellulare in ciascun gruppo di cellule è stato calcolato secondo la seguente formula: R = (A2-A1) /A2 × 100% e P = A1 /A2 × 100% in cui R è velocità relativamente inibitoria e P era relativamente rapporto proliferazione di crescita cellulare; A1was valore medio di assorbanza di cellule transfettate; e A2 era valore medio di cellule di controllo untransfected senza alcun trattamento farmacologico. Tutti gli esperimenti sono stati fatti con 5 pozzi per esperimento e ripetute almeno tre volte.

ciclo cellulare Assay

Le cellule sono state raccolte 48 ore dopo la trasfezione e fissati in 70% di etanolo ghiacciato durante la notte, lavati con 1 × PBS, e colorate con ioduro di propidio (PI) (50 mg /ml) in 1 × PBS supplementato con RNAsi (50 mg /ml) per 30 minuti. I test sono stati eseguiti in triplicato per ogni campione, e le analisi sono state eseguite da citofluorimetro (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) in accordo con le linee guida del produttore.

prova Chemo-sensibilità in vitro

Come descritto in precedenza, CCK-8 dosaggio è stato utilizzato per valutare effetto della chemio-sensibilità delle cellule di cancro gastrico ai farmaci antitumorali. In breve, sei ore dopo la trasfezione, il terreno è stato rimosso e sostituito con mezzo fresco contenente varie concentrazioni di farmaco anti-tumorale (ADR, 5-FU o cis-platino) e incubate per 48 ore. tasso relativamente inibitoria della crescita cellulare è stata calcolata secondo la formula di cui sopra.

L'apoptosi test per annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI) colorazione

Per valutare il tasso di apoptosi cellulare, apoptosi è stata quantificata annessina-V-FITC e ioduro di propidio doppia colorazione utilizzando un annessina-V /kit FITC (Antgene, Cina). Le cellule sono state raccolte in base alle istruzioni del produttore 48 ore dopo la trasfezione, lavate con PBS freddo e sospese in tampone di legame, e quindi le cellule sono state incubate 30 minuti al buio a 4 ° C con Annessina V-FITC e PI in tampone fosfato e analizzato il citofluorimetro (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) entro 1 ora dopo la colorazione.

Analisi statistica

Tutti i dati sono stati mostrati come media ± SD. La differenza tra i gruppi è stata analizzata mediante ANOVA e Student-Newman-Keuls (SNK) prova q utilizzando un SPSS 12.0 for Windows. La significatività statistica è stata definita come * p < 0.05 e ** p. < 0,01

Riconoscimenti

Ringraziamo Wu Ke, Shi Liang, Deng Meizhou, Li Hang e Li Wei per la loro assistenza tecnica di esperti .

• PLoS ONE: risultati a lungo termine e fattori prognostici di cancro gastrico I pazienti con microscopica peritoneale Carcinomatosis
• PLoS ONE: valutazione del rischio di cancro gastrico causata da Helicobacter pylori CagA Utilizzando Sequence Markers