PLoS ONE: Down-Regulation von AP-4 hemmt die Proliferation, Induziert Arrest Zellzyklus und fördert die Apoptose in menschlichen Magenkrebs Cells

Abstrakt

Hintergrund

AP-4 gehört zur basischen Helix -loop-Helix Leucin-Reißverschluss-Untergruppe; sie steuert die Zielgenexpression, reguliert das Wachstum, die Entwicklung und die Zellapoptose ist und in der Tumorgenese beteiligt. Unsere bisherigen Studien wiesen darauf hin, dass AP-4 häufig in Magenkrebs überexprimiert und kann mit der schlechten Prognose verbunden werden. Der Zweck dieser Studie ist es zu untersuchen, ob Silencing von AP-4 biologischen Eigenschaften von Magenkrebszellen verändern können.

Methoden

Zwei spezifische siRNAs Targeting AP-4 wurden entworfen, synthetisiert und transfiziert in Magenkrebs-Zelllinien und normalen menschlichen Schleimhautzellen. AP-4-Expression wurde mit Echtzeit quantitative PCR und Western-Blot gemessen. Die Zellproliferation und Chemo-Empfindlichkeit wurden von CCK-8-Test nachgewiesen. Zellzyklus-Test und der Apoptose-Assay wurden cytometer durch die Strömung durchgeführt, und der relativen Expression von Reglern Zellzyklus wurden durch quantitative Echtzeit-PCR und Western-Blot-Expression der Faktoren in der Apoptose-Signalweg untersucht in mRNA und Protein-Ebene beteiligt erkannt.

Ergebnisse

die Expression von AP-4 wurde durch die Transfektion siRNAs Schweigen gebracht und die Auswirkungen der AP-4 Zuschlags dauerte 24 bis 96 Stunden. Die siRNA-vermittelte Silencing von AP-4 unterdrückt die zelluläre Proliferation, Apoptose und sensibilisiert Krebszellen Medikamente gegen Krebs. Darüber hinaus wurden die Expressionsniveaus von p21, p53 und Caspase-9 erhöht, wenn AP-4 wurde Knockdown, aber die Expression von Cyclin D1, Bcl-2 und Bcl-x _{L inhibiert wurde. Es dauerte nicht Zellzyklusarrest induzieren, wenn AP-4 wurde in p53 Defekt Magenkrebs-Zelllinie Kato-III-Knockdown.}

Schlussfolgerungen

Diese Ergebnisse veranschaulicht, dass die Gen-Silencing von AP-4 effizient hemmte die Zellproliferation, Apoptose ausgelöst und sensibilisierten Krebszellen drugs in vitro gegen Krebs, was darauf hindeutet, dass AP-4 siRNAs vermitteltes Silencing ein Potential bei der Behandlung von menschlichen Magenkrebs hat

Citation. Liu X, Zhang B, Guo Y, Q Liang, Wu C, Wu L, et al. (2012) Down-Regulation von AP-4 hemmt die Proliferation, induziert Zellzyklusarrest und fördert die Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10.1371 /journal.pone.0037096

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 4. Juni 2011; Akzeptiert: 18. April 2012; Veröffentlicht am: 16. Mai 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Obwohl die Inzidenz und Sterblichkeit mit Magenkrebs assoziiert allmählich in den letzten Jahren in den meisten Regionen der Welt gesunken sind [1], [2], bleibt Magenkrebs eine weltweite gesundheitliche Belastung und bleibt die häufigste Ursache von Krebs Todesfälle im Zusammenhang mit wenig Verbesserung der langfristigen Überleben. Die effizienteste Behandlung von Magenkrebs war völlig chirurgische Entfernung des Tumorgewebes mit D2 Lymphadenektomie. Neben einer adjuvanten Chemotherapie und Strahlentherapie haben unterstützt Prognose zu verbessern. Trotzdem ist die 5-Jahres-Überleben blieb sehr schlecht [1], [3]. Mehr als eine Million neue Fälle wurden jedes Jahr, vor allem in Ostasien, wie Japan, Korea und China diagnostiziert. In diesen Ländern bleibt Magenkrebs ist die häufigste Ursache von Krebs Todesfälle im Zusammenhang mit, und die genaue Pathogenese ist unbekannt [3].

Transkriptionsfaktoren sind wichtige regulatorische Komponenten [4]. Sie gehörten der Helix-Loop-Helix-Familie und spielte eine wichtige Rolle bei der Zellproliferation und Differenzierung, Zelllinie Bestimmung, die Expression von intrazellulären genetische Information, und andere wichtige Prozesse [5]. Als Mitglied der basischen Helix-Loop-Helix-Leucin-Reißverschluß (bHLH-LZ) Untergruppe von bHLH-Proteine ​​[6], Aktivierung enhancer binding protein 4 (AP-4) wurde ursprünglich als ein Zellprotein identifiziert, die mit dem Simian Virus gebunden 40 (SV40) Enhancer und aktiviert, um die viralen späten Gentranskription [7]. AP-4 ist ein ubiquitär Transkriptionsfaktor exprimiert und Transkriptionsnetzwerke durch Bilden Homodimere und Bindung an die symmetrischen DNA-Sequenz, CAGCTG [7], während der Zelldifferenzierung steuern kann [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 ist ein Ligand für Immunglobulin-kappa-Promotor E-Box-Elemente, die an Immunschwächekrankheiten beteiligt sein kann [13], [14]. Darüber hinaus, im Gegensatz zu anderen HLH-Proteine, AP-4 enthält zwei zusätzliche Proteindimerisierung Motive aus Leucin Wiederholungselemente LR1 und LR2. Daher AP-4 stellt eine spezifische tripartite Dimerisierung Struktur, was darauf hindeutet, dass AP-4 mit einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren interagieren kann [8], [14]. AP-4 reguliert die Expression einiger Gene [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Zum Beispiel aktiviert sie die Transkription von hMTIIA Gen und beteiligt an der Regulation der humanen Proenkephalin expression [22], und es kann eine Rolle in der Expression des exokrinen Pankreas-Genfamilie [23] spielen. Vor kurzem hat die Überexpression von AP-4 wurde in der Darmkrebs, Brustkrebs und Prostatakrebs berichtet [9], [18], [24].

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein Prozess der sequenzspezifischen Post -transcriptional Gen-Silencing durch doppelsträngige RNA initiiert [25], die dem Silencing von spezifischen zellulären Gen und bieten eine leistungsfähige reversen Genetik Ansatz Genfunktionen zu analysieren sowohl in vitro als auch in vivo führen kann [26]. Derzeit sind die am häufigsten verwendeten Nukleinsäure-Basis sequenzspezifische Gen-Silencing-Moleküle waren small interfering RNAs [27], mit dem Namen siRNAs, die von symmetrischen Maisonetten von 19-21 Basenpaaren besteht [28]. Die siRNA-Methode könnte die Zielgenexpression mit einer Spezifität, Effizienz und Ausdauer [29] hemmen.

Wir bereits berichtet, dass AP-4 wurde in Magenkrebs überexprimiert und es kann mit der schlechten Prognose [30] in Verbindung gebracht werden. In der vorliegenden Studie untersuchten wir weiter die AP-4-Funktion in der menschlichen Zelle Magenkrebs mit RNA-Interferenz.

Ergebnisse |

spezifische siRNA die AP-4-Expression in menschlichen Magenkrebszellen und menschlichen Targeting normale Schleimhaut Zellen

Um die Wirkung der siRNA-vermittelte Stille des AP-4-Gen-Expression, die Kontroll-siRNA und AP-4 spezifischen siRNAs in die Zellen für 24 h, 48 h, transfiziert wurden bewerten, 72 h und 96 h. Die Wirksamkeit in Herunterregulieren Expression von AP-4-Gen wurde durch quantitative Echtzeit-PCR und Western Blot nachgewiesen. Wie in 1, 4-AP wirksam die Gentranskription und Translation hemmen könnten spezifischen siRNAs gezeigt. Die mRNA und Proteinmengen von AP-4 wurden mit AP-4 siRNA-Transfektion Gruppe verringert, jedoch nicht in der Kontrolle siRNA (Abbildung 1). Die siRNAs induzierte Unterdrückung der AP-4-Expression konnte in 24 Stunden nach der Transfektion nachgewiesen werden. Jedoch verringerte sich die Inhibierungsverhältnis von 72 Stunden nach der Transfektion. Die effizienteste Zeitpunkt waren zwischen 48 h bis 72 h in Unterdrückungs-Expression von AP-4. Die relativen Mengen an mRNA-Transkripten deutlich um fast 90% in siRNA-1-Gruppe verringerte sich, und 95% in siRNA-2-Gruppe. Es gab eine statistische Signifikanz zwischen siRNAs Gruppe und der Kontrollgruppe.

Down-Regulation der AP-4-Expression hemmte die Zellproliferation und menschlichen Zellen Magenkrebs sensibilisiert Krebsmedikamente

Um die Wirkung von untersuchen AP-4 spezifischen siRNAs auf die Zellproliferation und chemo-Empfindlichkeit der Krebszellen, 20 nM von AP-4 spezifischen siRNAs oder Kontrolle siRNA wurden transfiziert, und die Zellproliferation wurde durch CCK-8-Assay 48 Stunden nach Transfektion bestimmt. Wir fanden, dass Zuschlags AP-4 konnte die Proliferation von Magenkrebs-Zelllinien SGC7901 und AGS (Abbildung 2) hemmen, nicht aber in normalen Schleimhaut-Zelllinie GES-1, wenn sie mit der Kontrolle siRNA-Transfektion in 48 Stunden (Abbildung 2) verglichen. Diese Ergebnisse zeigen, dass AP-4 siRNAs die Zellproliferation von Magenkrebszellen in vitro gedämpft. Außerdem untersuchten wir die Rolle der AP-4 in der Regulation der chemo-Empfindlichkeit von menschlichen Magenkrebszellen. Wir verglichen die Arzneimittelempfindlichkeit von AP-4 siRNAs mit der Kontroll-siRNA oder Mock-Zellen und fanden heraus, dass die relativen Hemmung Raten von AP-4-spezifische siRNAs, die deutlich höher waren als der Kontroll-siRNA oder mock-Zellen (p < 0,0001) (Abbildung 2 ). Darüber hinaus verbesserte siRNAs AP-4 signifikant die Empfindlichkeit der Zellen gegen ADR, 5-FU oder cis-Plantinum Behandlung bei zwei unterschiedlich Dosen (Abbildung 2), diese vorgeschlagen, dass die Herunterregulierung von AP-4 eine günstige Wirkung bei der haben kann Empfindlichkeit der Chemotherapie.

Silencing der AP-4-Expression Zellzyklusarrest induziert und moduliert die Expression von p53, p21 und Cyclin D1

die Wirkung von AP-4 auf die Progression des Zellzyklus untersucht . Menschlichen Magenkrebszellen wurden mit 20 nM Kontrolle siRNA transfiziert, und die AP-4 spezifischen siRNAs für 48 h jeweils durch Propidiumiodid-Färbung folgte und Durchflusszytometrie-Analyse des Zellzyklus. Während mit Kontroll-siRNA transfizierten Zellen durch verschiedene Phasen des Zellzyklus fortgeschritten ist, mit AP-4-spezifische siRNAs transfizierten Zellen zeigten signifikant höhere Frequenz von Zellen an den G0 /G1-Phasen (SGC7901 /siRNA-1: 68,81%; SGC7901 /siRNA-2: 68,97%; AGS /siRNA-1: 61,92%; AGS /siRNA-2: 63,67%) und eine geringere Häufigkeit von Zellen in S-Phase (SGC7901 /siRNA-1: 29,57%; SGC7901 /siRNA-2: 29,84%; AGS /siRNA-1: 24,36%; AGS /siRNA-2: 22,91%). Der Prozentsatz der Zellen in G0 /G1-Phasen in der Zelle mit AP-4 siRNAs transfiziert war signifikant höher als die der Mock-Zellen (SGC7901: 54,65%; AGS: 48,44%) (p < 0,05) oder siRNA (SGC7901 /Steuer steuern siRNA: 52,18%; AGS /Kontroll-siRNA: 50,38%) (Abbildung 3). Daher Transfektion mit AP-4-spezifische siRNAs induzierte Zell Cyclin Verhaftung bei G0 /G1-Phasen.

Die AP-4-spezifische siRNAs induzierten Zellzyklusblock wurde weiter durch die Beobachtung der Auswirkungen der AP-4-spezifische siRNAs Behandlung untersucht auf die relative Expression der Zellzyklusregulatoren: der Tumorsuppressor p53, die Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitor p21 und dem G (1) -Phase spezifische Cyclin D1, die kritische Regulatoren des Zellzyklus und Proliferation waren. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die menschlichen Magenkrebszellen für Echtzeit-PCR und Immunoblotting-Analyse gesammelt. Transfektion mit AP-4 spezifischen siRNAs könnte regulieren die Expression von p53 und p21-Protein. Die modulatorische Wirkung von AP-4 siRNAs war größer als die der Kontroll-siRNA (Abbildung 4) (p < 0,01). Wie erwartet, wurde Cyclin D1 herunterreguliert im Vergleich zu siRNA Gruppe und Mock-Gruppe (Abbildung 4) (p < 0,01) zu steuern. Diese Daten unterstützt ferner die Hypothese, dass die Expression von AP-4 zum Schweigen zu bringen, die Expression von anderen Zellzyklus Regler verändert, induzierten Zellzyklusarrest und inhibiert die Proliferation von menschlichen Magenkrebszellen

Der Nachweis von Apoptose und die Faktoren, die bei die Apoptoseweg

Um den Effekt der AP-4 spezifischen siRNAs auf die Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen, Annexin-V und PI-Färbung Assays wurden in Verbindung mit Durchflusszytometrie verwendet quantifizieren. Die Zellen wurden mit Annexin V-FITC /PI und gated in unten rechts (LR) und oben rechts (UR) Quadranten gefärbt. Die Zellen in LR und UR wurden als früh apoptotischen (Annexin ^{+ /PI -) zu sein und spät apoptotischen (Annexin + /PI +) beziehungsweise. Die Zellen in LL (unten links) und UL (oben links) Quadranten wurden als jeweils am Leben und nekrotischen zu sein. Ausmaß der Apoptose wurde als die Summe der Prozentsätze in LR und UR Quadranten ausgedrückt. Die apoptotischen Raten wurden in Abbildung zeigte 5. Die behandelten Zellen mit AP-4 siRNAs zeigte mehr apoptotische Zellen (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) als die negative (SGC7901 /Kontroll-siRNA: 5,5%; AGS /Kontroll-siRNA: 6,7%) (p < 0,05) und leer (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p < 0,05) . Diese Ergebnisse zeigten, dass AP-4 spezifischen siRNAs der Lage waren, die Apoptose in diesen Zellen zu induzieren.}

Zusätzlich untersuchten wir die Expression von Faktoren in Apoptoseweg mit Echtzeit-PCR in mRNA Ebene beteiligt sind, wie beispielsweise Bcl-2 , Bcl-x _{L, Caspase-9, Caspase-8 und Bax. Es zeigte sich, dass Zuschlags AP-4 konnte die Expression von Baspase-9 in menschlichen Magenkrebszellen hochregulieren und die modulierende Wirkung von AP-4 siRNAs war größer als die der Kontrolle siRNA (6) (p < 0,01). Die Expression von Bcl-2 und Bcl-x L wurden auf die Kontrolle verringert, verglichen siRNA oder mock-Gruppe (6) (p < 0,01). Diese Daten unterstützt ferner, dass das Schweigen der AP-4-Expression führte zur Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen. Jedoch waren die Expression von Caspase-8 und Bax verschieden in verschiedenen Zelllinien nach der Transfektion. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion, Caspase-8 und Bax waren über die Expression in AGS-Zellen. In SGC7901 Zellen erhöhte sich die Expression von Bax, sondern der Ausdruck von Caspase-8 erhöht nur in siRNA-1-Gruppe. In siRNA-2-Gruppe, war Caspase-8-Expression nicht signifikant betroffen (Abbildung 6).}

AP-4-Silencing konnte Zellzyklus und Zell-Apoptose sowohl in der p53-abhängige und unabhängige-Manieren

um zu überprüfen, ob die hoch~~POS=TRUNC von p53 in AP-4 Knockdown Zellen Magenkrebs auf die Rolle der Zellzyklusarrest kritisch war, Kato-III-Zellen, eine Art wurde Magenkrebs-Zelllinie p53 Defekt verwendet, um die Abhängigkeit von AP zu bewerten -4 Zuschlags Wirkung auf p53. Wir fanden, dass Zuschlags von AP-4 in AGS mit Wildtyp-p53 oder SGC7901 mit mutantem p53 könnte Zellzyklusarrest induzieren, aber dieses Phänomen wurde nicht in Kato III Zellen (Figur 7), der Prozentsatz an Zellen in G0 /G1 beobachtet Phasen waren 57,82% (siRNA-1), 59,05% (siRNA-2), 59,59% (Kontroll-siRNA) und 59,06% (mock). Diejenigen angegeben, dass Zuschlags AP-4 vielleicht Zellzyklus mittels p53-p21 Stoffwechselweg regulieren. Apoptosis Bevölkerung wurde auch in Kato-III-Zellen mit Annexin V-FITC und PI-Färbung nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Apoptoserate von Kato-III-Zellen, die mit AP-4 siRNAs (siRNA-1: 7,9%; siRNA-2: 9,2%) höher war als die Kontroll-siRNA (3,3%) (p < 0,05) und Mock Zellen (3,5%) (p < 0,05), aber in einem geringeren Ausmaß, als es auf den AGS hat (p < 0,05) und SGC7901 Zellen (p < 0,05), was darauf hinweist, dass Silencing AP-4 durch Apoptose bei Magenkrebszellen induzieren konnten beide p53-abhängige und unabhängige-Manieren.

Diskussion

Die Genexpression ist eine grundlegende und hochkonservierten Prozess. Transkription, der erste Schritt in der Genexpression wird durch strukturell konservierte DNA-abhängige RNA-Polymerasen durchgeführt, die von einer DNA-Matrize bei der Synthese eines RNA-Moleküls führt [31]. Transkriptionsfaktoren, Form Transkriptionsinitiationskomplex mit RNA polymeras II, in dem Prozess der Transkriptionsinitiations teilnehmen Genexpression zu regulieren. Sie können durch Regulieren der Transkription und daher der Genexpression eine wichtige Rolle bei der Transformation, Tumorentstehung, Tumorprogression und Metastasierung spielen [32], [33], [34]. Der Transkriptionsfaktor AP-4, aus der schnell wachsenden Gruppe von HLH-Proteine ​​[8] bei der Differenzierung und Zellproliferation beteiligt ist [35], [36], [37], [38], [39], beeinflusst Ereignisse des Zellzyklus und Apoptose, regelt und steuert eine Genexpression [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Vor kurzem wurde berichtet, dass AP-4 wurde hochreguliert in Kolonkarzinom, Brustkrebs und Prostatakrebs, [9], [18], [24]. Zusätzlich zeigte AP-4 positiven Ausdruck eine schlechte Prognose mit Bedeutung über Klasse, Knotenstatus oder die Größe in ER + Brustkrebs und einen möglichen Zusammenhang mit Chemo-Empfindlichkeit [40]. In unserem vorher studieren, haben wir, dass die Expression von AP-4 gefunden überexprimiert wurde und es mit einer schlechten Prognose-Co im Zusammenhang mit [30]. Es kann ein molekularer Marker für die Diagnose und Prognose von Magenkrebs. In der vorliegenden Studie,. Wir haben zwei AP-4 spezifischen siRNAs, die Expression des AP-4-Gen in menschlichen Magenkrebszellen zu hemmen. Sie wurden gut etabliert und transfiziert in Zellen in Knock-down von AP-4-Genexpression zu führen. Wir fanden, dass die stärkste Zeitpunkt der AP-4-Expression in Magenkrebszellen bei der Unterdrückung waren 48 h und 72 h nach der Transfektion. So wählten wir die ersteren weiteren verwandten Prüfung durchzuführen.

Bisher hat es, dass die Transkriptionsfaktor AP-4, im Gegensatz zu anderen HLH-Proteine ​​gezeigt wurde, enthielt zwei verschiedene Leucin Wiederholungselemente, die auch direkte Dimerisierung und ermöglichen es dem selektive Komplexbildung des Ubiquitous AP-4-Protein [8], [41].

AP-4 könnte eine wichtige Rolle bei der Modulation der zellulären Funktionen über Regulation von Genen beteiligt sind an der viralen Produktion [7], [16 spielen ], [22], [42], [43], das Zellwachstum und Überleben [9], [17], [23], [44], Immunantwort [14], [41], [45] und der Angiogenese [21]. Peter Jung, et al fanden heraus, dass AP-4 könnte eine c-MYC-induzierbaren Repressor kodieren p21-Expression hemmen [9], und spielte vermutlich eine wichtige Rolle bei der proliferativen Aktivität von c-MYC vermittelnde [10]. Zusätzlich AP-4 beeinflusst die Empfindlichkeit gegenüber Apoptose durch die Expression von Caspase-9 Regulieren [17]. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Herunterregulierung von AP-4 die Proliferation von menschlichen Magenkrebszellen in vitro inhibiert. Die Proliferationshemmung Verhältnis von AP-4-spezifische siRNAs war signifikant niedriger als die der mit Kontroll-siRNA oder Mock Gruppe transfizierten Zellen.

Die Chemotherapie ist eine wichtige Strategie bei der Behandlung von Magenkrebs, aber es funktioniert nicht oft wegen die Resistenz gegen Antikrebs-Arzneimittel. Es wurde berichtet, dass AP-4 positiven Ausdruck möglicherweise mit Chemo-Empfindlichkeit [40] verbunden war. Wir untersuchten als nächstes die Rolle der AP-4 in der Regulation der chemo-Empfindlichkeit von menschlichen Magenkrebszellen und festgestellt, dass die Hemmung der AP-4 konnte die Empfindlichkeit dieser Zellen ADR, 5-FU oder cis-Plantinum Behandlung erheblich verbessern, was darauf hindeutet dass die Hemmung der AP-4 kann eine vorteilhafte Wirkung in chemo-Empfindlichkeit aufweisen.

Zusätzlich silencing of AP-4, induziert Arrest des Zellzyklus in G0 /G1-Phasen, Analyse eines möglichen Mechanismen, die die Auswirkungen von der AP-4-Silencing auf Hemmung der Proliferation menschlicher Magenkrebszellen wurden durch die Expression von Zellzyklus-Regulatoren im Zusammenhang gekennzeichnet. Wir fanden, dass die Herunterregulierung der AP-4-Expression die Expression von Cyclin D1 gesperrt, aber die Expression von p53 und p21 hochreguliert. p53 und p21 ein negativer Regulator des Zellzyklus und die Proliferation zu sein [46], [47], andererseits Cyclin D1 gefördert Progression durch den G _{1-S-Phase des Zellzyklus die Hypothese aufgestellt wurde [48 ]. Unten regulierte Expression von AP-4, p21 und p53 in der Zwischenzeit könnte die Zellzyklusarrest machen verursacht Zuschlags von AP-4 Verschwinden. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit einem Modell, in dem AP-4 durch die Regulation der Expression von Zellzyklusregulatoren, wie p53, p21 und Cyclin D1.}

Apoptosis oder programmierter Zelltod, Zellzyklusarrest induziert, ist bekannt in verschiedenen biologischen Prozesse durch zwei Haupt apoptotischen Wege, die mitochondriale (intrinsische) -Weg und den Todesrezeptor (extrinsische) Weg [49] zu beteiligen. Wir fanden, dass die AP-4-Expression Apoptose in unserem Experiment trigged Zelle zum Schweigen zu bringen, die zeigten, dass AP-4 Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen unterdrückt.

In unserem Experiment zunehmenden Caspase-9 und Herunterregulierung von Bcl-2 und Bcl-x _{L wurden in menschlichen Magenkrebszellen festgestellt, dass sowohl Zuschlags von AP-4 aktiviert intrinsische und extrinsische Wege zur Apoptose in Krebszellen anzeigt. [49], [50]}

Zusammenfassend zeigen die Daten, dass RNAi-vermittelter Herabregulierung von Transkriptionsfaktor AP-4 wirksam die Zellproliferation inhibiert, angegeben Arrest des Zellzyklus, Apoptose ausgelöst und verbesserte chemo Empfindlichkeit von menschlichen Magenkrebszellen mit der verminderten Expression von Cyclin D1, Bcl-2 und Bcl-x _{L und aktivierte p21, p53 und Caspase-9-Expression, die vorgeschlagen AP-4 kann ein Onkogen sein, eine wichtige Rolle in der Tumorgenese spielen . Obwohl der genaue Mechanismus dieser Rolle weiter untersucht werden muss, kann der AP-4specific-siRNAs für den menschlichen Magenkrebs als neuen therapeutischen Mittel der potentiellen Werte sein.}

Materialien und Methoden

Die Zelllinie und Zellkultur

menschlichen Magenkrebszelllinien AGS mit Wildtyp-p53, SGC7901 mit mutiertem p53 (erhalten von Wuhan University) und Kato-III mit p53-Genom-Deletion (Zhiyan Bio Technology Co, Shanghai) wurden in DMEM Medium oder RPMI1640-Medium (Invitrogen) mit 10% fötalem Rinderserum (Invitrogen) enthält, Penicillin (100 U /ml) und Streptomycin (100 ug /ml). Zellen wurden bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _{2 gehalten.}

Specific siRNA und Transfektion

Die cDNA-Sequenz der AP-4-Gens aus der Genbank erhalten ( NM_003223) und die Targeting-Sequenzen von zwei 21-Nukleotid verschiedenen siRNAs wurden entworfen und chemisch synthetisiert (Qiagen Deutschland). Die Nukleotidsequenzen waren wie folgt: siRNA-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(sense) und 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (Antisense). siRNA-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(sense) und 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (Antisense). Allstars negative Kontrolle siRNA (Qiagen Deutschland) wurden als ein gestörtes siRNA Kontrolle verwendet. Die Zellen wurden in 6-Well-Platten plattiert und die siRNAs wurden in Kulturzellen mit Lipofectamin 2000 (Invitrogen) transfiziert gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Real-time quantitative PCR

Die Gesamt-RNA-Extraktion durchgeführt wurde, Verwendung RNAiso plus (Takara, Japan) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die cDNAs aus Gesamt-RNA wurden synthetisiert unter Verwendung von PrimeScript® RT-Reagenz-Kit (Takara, Japan). Die mRNA-Expression wurde durch real-time PCR auf einem ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapur) mit Fast SYBR Green PCR-Reagenzien bewertet. GAPDH wurde als interne Kontrolle angewendet. Die Konzentrationen der Reagenzien wurden auf ein Endvolumen von 20 ul, enthaltend 2 &mgr; l revers transkribiert Produkt wurden 10 ul Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) und 0,5 ul 10 uM vorwärts zu erreichen eingestellt und Reverse-Primer. Die Reaktion wurde für 3 s durch 45 Amplifikationszyklen von 95 ° C und 60 ° C für 30 s. Die folgenden Primer wurden entworfen (Tabelle.1). PCR-Primer wurden durch Primer 5.0 und Blast-Suche entwickelt Spezifität zu überprüfen. Die Primersequenzen verwendet werden, die in den Tabellen 1. Die Ergebnisse unter Verwendung von 2 berechnet wurden ^{-ΔΔCt Methode.}

Western-Blot

Das Protein wurde mit Protein-Extraktions-Kits extrahiert (Beyotime, China) nach zur Richtung. Das Protein wurde auf 3 &mgr; g /&mgr; l verdünnt und durch 10% SDS-PAGE, übertragen auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen (Millipore, USA) abgetrennt und dann in 5% fettfreier Trockenmilch in TBST für 1 Stunde geblockt wurde bei Raumtemperatur. Immunoblotting wurde unter Verwendung von anti-AP-4-Antikörper (Sigma-Aldrich, Shanghai, Verdünnungs 1:1000) durchgeführt, anti-p21-Antikörper (Sigma-Aldrich, Shanghai, Verdünnungs 1:1000), anti-p53-Antikörper (Abcam, UK, Verdünnungs 1:500) und Anti-Cyclin-D1-Antikörper (Abcam, UK, Verdünnungs 1:500) über Nacht bei 4 ° C. Nach dreimal mit TBST gespült wurde die Membran mit Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper (Verdünnung 1:2000, Boster, China) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Ergebnis wurde durch die ECL Plus Western-Blotting-Detektionssystem sichtbar gemacht nach den Anweisungen des Herstellers. Anti-β-Aktin (Verdünnung 1:1000, Boster, China) Antikörper fungierte als interne Kontrolle.

Die Messung der Zellproliferation

Die Auswirkungen der zum Schweigen zu bringen AP-4 auf der Magenkrebs-Zellproliferation nach 48 Stunden der Transfektion wurde durch Zellzählung Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, China) gemessen, entsprechend der Bedienungsanleitung des Herstellers. Kurz gesagt, wurden Magenkrebszellen, kultiviert in 96-Well-Platten und mit 20 nM Kontrolle siRNA, AP-4 spezifischen siRNAs transfiziert. Nach 48 Stunden wurden 10 &mgr; l von CCK-8-Reagens zu jeder Vertiefung zugegeben, nach 1 Stunde Inkubation bei 37 ° C wurde die Extinktion bei 450 nm gemessen. Die relativen Pegel der Zellproliferation in jeder Gruppe von Zellen gemäß der folgenden Formel berechnet: R = (A2-A1) /A2 × 100% und P = A1 /A2 × 100% in der R relativ Hemmungsrate und P war relativ Proliferationsverhältnis von Zellwachstum; A1was Extinktionsmittelwert transfizierten Zellen; und A2 war Extinktionsmittelwert untransfizierten Kontrollzellen ohne medikamentöse Behandlung. Alle Versuche wurden mit 5 Wells pro Experiment durchgeführt und wiederholt mindestens dreimal.

Zellzyklus-Assay

Die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion geerntet und über Nacht in 70% eiskaltem Ethanol fixiert, gewaschen mit 1 × PBS und 30 Minuten lang mit Propidiumiodid (PI) (50 ug /ml) in 1 × PBS, supplementiert mit RNase (50 ug /ml) gefärbt. Die Tests wurden für jede Probe dreifach durchgeführt, und Analysen durch Durchflusszytometer (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt wurden.

Chemo-Sensitivitätstest in vitro

wie zuvor beschrieben, wurde CCK-8 Test zur Beurteilung der Wirkung von chemo Empfindlichkeit von Magenkrebszellen verwendeten Medikamente gegen Krebs. Kurz gesagt, sechs Stunden nach der Transfektion wurde das Medium entfernt und durch frisches Medium ersetzt variierenden Konzentrationen von Anti-Tumor-Medikament (ADR, 5-FU oder cis-Platin) und inkubiert 48 Stunden lang enthält. Relativ Hemmrate des Zellwachstums wurde berechnet nach der Formel oben angegeben.

Apoptosis Assay durch Annexin V-FITC und Propidium-Iodid (PI) Anfärben

, die Rate der Zellapoptose zu bewerten, Apoptose wurde von Annexin-V-FITC und Propidiumiodid Doppelfärbung mit einem Annexin-V /FITC-Kit (Antgene, China) quantifiziert. Zellen wurden nach den Anweisungen des Herstellers gesammelt, 48 Stunden nach der Transfektion, mit kaltem PBS gewaschen und in Bindungspuffer suspendiert, und dann wurden die Zellen 30 Minuten im Dunkeln bei 4 ° C mit Annexin V-FITC und PI in Phosphatpuffer inkubiert und analysiert auf dem Durchflusszytometer (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) innerhalb von 1 h nach der Färbung.

Statistische Analyse

wurden als Mittelwert Alle Daten gezeigt ± SD. Unterschied zwischen den Gruppen wurde von one-way ANOVA und Student-Newman-Keuls (SNK) -q Test mit einem SPSS 12.0 für Windows-Software analysiert. Die statistische Signifikanz wurde als * p <definiert; 0,05 und ** p <. 0,01

Acknowledgments

Wir danken Wu Ke Shi Liang, Deng Meizhou, Li Hang und Li Wei für ihre technische Unterstützung durch Experten .

• PLoS ONE: Langzeitergebnisse und Prognosefaktoren von Magenkrebs-Patienten mit Mikroskopische Peritonealkarzinose
• PLoS ONE: Risikobewertung von Magenkrebs verursacht durch Helicobacter pylori CagA Sequence Markern