PLoS One: leszabályozza AP-4 proliferációját gátolja, sejtciklusleállást és elősegíti az apoptózist az emberi gyomorban Cancer Cells

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

AP-4 tartozik alap helix-loop-helix leucin-cipzár alcsoport; ez szabályozza célgén expresszióját, szabályozza a növekedés, fejlődés és a sejtek apoptózis és szerepet játszik a tumorigenezisben. A korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy az AP-4-ben gyakran túlzott mértékben expresszálódik a gyomor rákos megbetegedések és összefüggésben lehet a rossz prognózist. E tanulmány célja, hogy megvizsgálja, hogy hangtompító AP-4 megváltoztathatja biológiai jellemzői gyomor rákos sejteket. Katalógusa

Módszerek katalógusa

Két konkrét siRNS célzás AP-4 terveztünk, szintetizált, és transzfektált figyelembe gyomorrák sejtvonalakat és normál humán nyálkahártya sejtekben. AP-4 expressziós mértük valós idejű kvantitatív PCR és Western-blottal. Sejt proliferációt és kemo-érzékenység detektáltunk CCK-8 vizsgálatban. Sejtciklus esszé és apoptózis assay végeztük áramlási citométer, és relatív expressziós sejtciklus szabályozóknak detektáltunk valós idejű kvantitatív PCR és Western blot, kifejezése a szerepet játszó tényező apoptózis útvonal vizsgáltuk mRNS és fehérje szinten.

Eredmények

a kifejezés AP-4 elcsendesült a siRNS transzfekció hatásait AP-4 knockdown tartott 24-96 óra. A siRNS-közvetített silencing AP-4 elnyomta a celluláris proliferációt, apoptózist és érzékenyített ráksejtek rákellenes gyógyszerek. Ezen túlmenően, az expressziós szint a p21, p53 és kaszpáz-9 emelkedett, amikor AP-4-et knockdown, de a kifejezés a ciklin D1, a Bcl-2 és Bcl-x _{L gátolt volt. Nem indukált sejtciklus amikor AP-4-et knockdown p53 hibakezelési gyomorrák sejtvonal Kato-III.}

Következtetések

Ezek az eredmények azt szemléltetik, hogy a géncsendesítés AP-4 hatékonyan gátolta a sejtproliferációt, kiváltott apoptózis és érzékenyített ráksejtek rákellenes gyógyszerek in vitro, ami arra utal, hogy az AP-4 siRNS által közvetített hangtompító van egy potenciális értékét a kezelés a humán gyomorrák.

bevezető hivatkozás: Liu X, Zhang B, Guo Y, Liang Q, Wu C, Wu L, et al. (2012) leszabályozza AP-4 proliferációját gátolja, sejtciklusleállást és elősegíti az apoptózist az emberi gyomorban a rákos sejteket. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10,1371 /journal.pone.0037096 katalógusa

Szerkesztő: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: június 4, 2011; Elfogadva: 18. április 2012; Megjelent: május 16, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Liu et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Bár az előfordulási és halálozási arányokkal kapcsolatos gyomorrákos fokozatosan csökkent az elmúlt években a legtöbb területen a világ [1], [2], gyomorrák továbbra világméretű egészségügyi terhet, és továbbra is a leggyakoribb oka a rák okozta halálesetek kis javulás a hosszú távú túlélést. A leghatékonyabb kezelés gyomorrák teljesen műtéti eltávolítása a neoplasztikus szövet D2 lymphadenectomia. Ezen felül adjuváns kemoterápia és a sugárterápia segített javítani a prognózist. Még így is, az 5 éves túlélés is igen szegény [1], [3]. Több mint egymillió új esetet diagnosztizálnak évente, főleg Kelet-Ázsiában, mint például Japán, Korea és Kína. Ezekben az országokban a gyomorrák továbbra is a leggyakoribb oka a rákos megbetegedésekkel kapcsolatos halálesetek, valamint a pontos patogenezise egyelőre ismeretlen. [3] katalógusa

A transzkripciós faktorok fontos szabályozási elemek [4]. Ezek közé tartozott a helix-loop-helix család és fontos szerepet játszott a sejt proliferáció és differenciálódás, sejtvonal meghatározása, kifejezése intracelluláris genetikai információ, és egyéb alapvető eljárások [5]. Tagjaként az alap helix-loop-helix leucin-cipzár (bHLH-LZ) alcsoport, bHLH fehérjék [6], aktiváló enhancer binding protein 4 (AP-4) eredetileg azonosították celluláris protein, amely kötődik a simian vírus 40 (SV40) enhanszer és az aktivált a virális késői gén transzkripcióját [7]. AP-4 egy mindenütt expresszálódik transzkripciós faktor és szabályozhatja transzkripciós hálózatok alatt celluláris differenciálódás képezve homodimereket és kötelező a szimmetrikus DNS-szekvencia, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 egy liganduma immunglobulin kappa promoter E-box elemet, amely érintett lehet, hogy immunhiányos betegségek [13], [14]. Ezen túlmenően, ellentétben más HLH-proteinek, AP-4 tartalmaz két további protein dimerizációs motívumokat tartalmazó leucin ismétlés elemek LR1 és LR2. Ezért, AP-4 bemutatja a specifikus háromoldalú dimerizációs szerkezet, ami arra utal, hogy az AP-4 kölcsönhatásba léphetnek sokféle transzkripciós faktorok [8], [14]. AP-4 expresszióját szabályozza bizonyos gének [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Például, hogy aktiválja a transzkripciót a hMTIIA gén és részt vesz a szabályozás a humán proenkefalin kifejezés [22], és ez szerepet játszhat a kifejezés a hasnyálmirigy exokrin géncsalád [23]. A közelmúltban, a overexpressziója AP-4-ben számoltak be a kolorektális rák, emlőrák és a prosztatarák, [9] [18], [24].

RNS-interferencia (RNSi) egy olyan folyamat, szekvencia specifikus utáni -transcriptional géncsendesítés által kezdeményezett kettős szálú RNS [25], ami oda vezethet, hogy a hangtompító a specifikus celluláris gén, és olyan erőteljes reverz genetikai megközelítés, hogy elemezzék gén funkciók mind in vitro és in vivo [26]. Jelenleg a legszélesebb körben használt nukleinsav-alapú szekvencia-specifikus gén silencing molekulák voltak, kis interferáló RNS-ek [27], elemzi siRNS, amely szimmetrikus duplexek 19-21 bázispár [28]. Az siRNS módszer gátolta génexpresszió pontosan megjelöli, a hatékonyság és az állóképességet. [29] katalógusa

jelentették korábban, hogy AP-4-et túltermelõdik gyomorrák és hogy kapcsolatba hozható a rossz prognózist [30]. A jelen tanulmányban azt vizsgálták tovább, az AP-4 funkciót az emberi gyomor rákos sejt RNS interferencia. Katalógusa

Eredmények katalógusa

specifikus siRNS célzó AP-4 expresszió humán gyomorrák sejtek és az emberi normál nyálkahártya sejtek

hatásának értékelésére az siRNS-közvetített csend az AP-4 gén expressziója, a kontroll siRNS és AP-4 specifikus siRNS-t transzfektáltunk a sejteket 24 órán, 48 óra, 72 óra és 96 órán át. A hatásosságot alulszabályozza expresszióját AP-4 gén detektáltuk valós idejű kvantitatív PCR és Western-blottal. Amint az 1. ábrán látható, az AP-4 specifikus siRNS-ek hatékonyan gátolják a gén transzkripciós és transzlációs. Az mRNS és fehérje szintje az AP-4-et csökkent AP-4 siRNS transzfekció csoport, de nem a kontroll siRNS (1. ábra). A siRNS-ek által indukált szuppresszió Az AP-4 expresszió volt kimutatható 24 órával a transzfekció után. Azonban a gátlási arány csökkent 72 órával a transzfekció után. A leghatékonyabb időpont között volt 48 óra 72 óra elnyomni kifejezése AP-4. A relatív szintjeit mRNS szignifikánsan csökkent közel 90% -ban siRNS-1-csoport, és 95% -ban az siRNS-2-csoport. Nem volt statisztikailag szignifikáns között siRNS-csoport és a kontroll csoport.

down-regulációja AP-4 expresszió gátolta a sejtproliferációt és érzékenyített emberi gyomor rákos sejtek rákellenes gyógyszerek

hatásának vizsgálata AP-4 specifikus siRNS-ek a sejt proliferációra és a kemo-érzékenysége a rákos sejtek, 20 nM AP-4 specifikus siRNS-ek, vagy kontroll siRNS transzfektáltunk, és a sejtproliferáció határoztuk meg a CCK-8 vizsgálatban 48 órával a transzfekció után. Azt találtuk, hogy knockdown AP-4 gátolhatják a proliferációt a gyomor rákos sejtvonalak SGC7901 és AGS (2. ábra), de nem a normális nyálkahártya-sejtvonal GES-1, ha összehasonlítjuk a kontroll siRNS transzfekció 48 órával (2. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az AP-4 siRNS csökkentette a sejtproliferációt gyomorrák-sejtek in vitro. Továbbá megvizsgáltuk a szerepe a AP-4 szabályozásában kemo-érzékenysége az emberi gyomor rákos sejteket. Összehasonlítottuk a hatóanyag érzékenységét AP-4 siRNS-ek, hogy a kontroll siRNS vagy ál-sejtek, és megállapította, hogy a relatív gátlás aránya AP-4 specifikus siRNS-ek szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll siRNS vagy ál-sejtek (p < 0,0001) (2. ábra ). Ezen túlmenően, az AP-4 siRNS szignifikánsan fokozta az érzékenységet a sejtek ADR, 5-FU vagy cisz-plantinum kezelést két, eltérő dózisokban (2. ábra), ezek a javasolt, hogy a down-regulációja AP-4 lehet jótékony hatást a érzékenysége a kemoterápia.

csendesítése az AP-4 expresszió indukált sejtciklus leállásához és modulált kifejeződését a p53, p21 és ciklin D1

a hatás az AP-4 sejtciklus progresszióját vizsgáltuk . Humán gyomorrák sejteket transzfektáltunk 20 nM kontroll siRNS, és az AP-4 specifikus siRNS-ek 48 órán át, illetve, majd propidium-jodid festéssel és áramlási citometriás analízis a sejtciklus. Míg transzfektált sejtek kontroll siRNS haladt keresztül különböző szakaszaiban sejtciklus, transzfektált sejtek AP-4 specifikus siRNS szignifikánsan nagyobb gyakorisággal sejtek G0 /G1 fázis (SGC7901 /siRNS-1: 68,81%; SGC7901 /siRNS-2: 68,97%; AGS /siRNS-1: 61,92%; AGS /siRNS-2: 63,67%) és kisebb gyakorisággal a sejtek az S-fázisban (SGC7901 /siRNS-1: 29.57%; SGC7901 /siRNS-2: 29,84%; AGS /siRNS-1: 24.36%; AGS /siRNS-2: 22,91%). A százalékos sejtek G0 /G1-fázist a transzfektált sejtek AP-4 siRNS szignifikánsan magasabb volt, mint a mock sejtek (SGC7901: 54,65%; AGS: 48,44%) (p < 0,05), vagy kontroll siRNS (SGC7901 /kontroll siRNS: 52,18%; AGS /kontroll siRNS: 50.38%) (3. ábra). Ezért transzfekciót AP-4-specifikus siRNS-ek által indukált sejt ciklin őrizetben G0 /G1 fázisban.

Az AP-4 specifikus siRNS-ek által indukált sejtciklus blokk tovább vizsgáltuk, hogy megfigyeltük a hatását AP-4 specifikus siRNS-kezelés a relatív expresszióját sejtciklus szabályozó hatóságok: a tumor szuppresszor a p53, a ciklin-függő kináz inhibitor p21, és a G (1) fázisú specifikus ciklin D1, melyek kritikus szabályozói a sejtciklus és proliferációját. Negyvennyolc órával a transzfekció, az emberi gyomor rákos sejteket gyűjtöttünk a valós idejű PCR és immunblot analízis. Transzfekció AP-4 specifikus siRNS-ek is fel-expresszióját szabályozzák p53 és p21 fehérjét. A moduláló hatása AP-4 siRNS nagyobb volt, mint a kontroll siRNS (4. ábra) (p < 0,01). Ahogy az várható volt, a ciklin D1-ben alulszabályozott összehasonlítva kontroll siRNS-csoport és mock-csoport (lásd 4. ábra) (p < 0,01). Ezek az adatok is alátámasztják a hipotézist, hogy hangtompító expresszióját AP-4 megváltozott expresszióját más sejtciklus szabályozóknak, indukált sejtciklus leállásához és gátolta a proliferációt a humán gyomorrák sejtek

kimutatása az apoptózis és a részt vevő faktorok az apoptózis útvonal

számszerűsíteni hatását AP-4 specifikus siRNS-ek az apoptózis humán gyomorrák-sejtek, Annexin-V és a PI festés vizsgálatokat együtt használt áramló citometriás vizsgálattal. A sejteket festettük annexin V-FITC /PI és lakóparkok a bal alsó (JA) és jobb felső (JF) negyedre. Sejtek LR és UR tartották korai apoptotikus (Annexin ^{+ /PI -) és késői apoptotikus (Annexin + /PI +) ill. Sejtek LL (bal alsó) és az UL (Upper Left) negyedre tartották életben és nekrotikus volt. Az apoptózis mértékét kifejezett összegeként a százalékok LR és UR negyedre. Az apoptotikus rátákat mutatott 5. ábra kezelt sejtek AP-4 siRNS kimutatta több apoptotikus sejtek (SGC7901 /siRNS-1: 14,0%; SGC7901 /siRNS-2: 11,5%; AGS /siRNS-1: 20,1%; AGS /siRNS-2: 23,6%), mint a negatív (SGC7901 /kontroll siRNS: 5,5%; AGS /kontroll siRNS: 6,7%) (p < 0,05), és az üres (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p < 0,05) . Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az AP-4 specifikus siRNS-ek képesek voltak apoptózist indukálni ezekben a sejtekben.}

Továbbá megvizsgáltuk a kifejezés a részt vevő faktorok apoptózis útvonal valós idejű PCR az mRNS szinten, mint például a Bcl-2 , Bcl-X _{L, a kaszpáz-9, kaszpáz-8 és Bax. Ez azt mutatta, hogy a knockdown AP-4 tudott up-expresszióját szabályozzák Baspase-9 humán gyomorrák sejtek és a moduláló hatása AP-4 siRNS nagyobb volt, mint a kontroll siRNS (6. ábra) (p < 0,01). A kifejezés a Bcl-2 és Bcl-x L csökkentették a kontrollhoz képest siRNS vagy ál-csoport (6. ábra) (p < 0,01). Ezek az adatok is alátámasztják, hogy a hangtompító AP-4 expressziós vezetett apoptózis humán gyomorrák sejtek. Azonban a kifejezés a kaszpáz-8 és Bax eltérő volt a különböző sejtvonalakban a transzfekció után. Negyvennyolc órával a transzfekció után, a kaszpáz-8 és Bax fölött volt expresszió AGS sejtekben. A SGC7901 sejtekben, a kifejezés a Bax nőtt, de a kifejezés a kaszpáz-8 nőtt csak az siRNS-1-csoport. A siRNS-2-csoport, a kaszpáz-8 expresszió nem volt szignifikáns hatás éri (6. ábra).}

AP-4 hangtompító lehetne szabályozni a sejtciklus és apoptózis, mind a p53-függő és független-modor

Annak ellenőrzésére, hogy az up-reguláció p53 AP-4 knockdown gyomorrák sejtek kritikus volt a szerepe a sejtciklus leállást, Kato-III sejtek egyfajta p53 hiba gyomorrák sejtvonalat használtuk, hogy értékelje a függőség AP -4 knockdown hatása p53. Azt találtuk, hogy kiütése AP-4 AGS a vad-típusú p53 vagy SGC7901 mutáns p53 képes indukálni sejtciklus, de ez a jelenség nem volt megfigyelhető Kato III sejtek (7. ábra), a sejtek százalékos arányát a G0 /G1- fázisok 57,82% (siRNS-1), 59,05% (siRNS-2), 59,59% (kontroll siRNS-t), és 59,06% (vak). Azok jelezte, hogy leütés AP-4 talán szabályozzák a sejtciklus révén p53-p21 útvonal. Az apoptózis népesség is kimutatható volt Kato III sejtek Annexin V-FITC és PI-festéssel. Az eredmények azt mutatták, hogy a apoptózis mértéke Kato-III-vel transzfektált sejtek AP-4 siRNS (siRNS-1: 7,9%; siRNS-2: 9,2%) magasabb volt, mint a kontroll siRNS (3,3%) (p < 0,05) és Mock sejteket (3,5%) (p < 0,05), de kisebb mértékben, mint azt tette a AGS (p < 0,05) és SGC7901 sejtek (p < 0,05), jelezve, hogy hangtompító AP-4 képes apoptózist indukálnak gyomorrák sejtek keresztül mind p53-függő és független-modor. katalógusa

Vita katalógusa

a génexpressziós alapvető és erősen konzerválódott folyamat. Transzkripció, az első lépés a génexpresszió, úgy végezzük, hogy szerkezetileg konzervált DNS-függő RNS-polimerázok, amelynek eredményeként a szintézisét egy olyan RNS-molekula egy DNS templát [31]. Transzkripciós faktorok forma transzkripciós iniciációs komplexet RNS polymeras II, részt vesznek a folyamatban transzkripciós iniciációs, hogy szabályozzák a génexpressziót. Ezek fontos szerepet játszanak az átalakulás, tumorigenezis, a tumor progresszióját és metasztázis által transzkripciójának szabályozására, és ezért a génexpressziót [32], [33], [34]. Transzkripciós faktor AP-4 tartozó gyorsan növekvő csoportját HLH-proteinek [8] részt vesz a differenciálódás és a sejtproliferációt, [35], [36], [37], [38], [39], befolyásolja a sejtciklus események és apoptózis, szabályozza és ellenőrzi néhány génexpressziós [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Újabban arról számoltak be, hogy az AP-4-et up-szabályozott vastagbél-karcinóma, emlőrák és a prosztatarák, [9] [18], [24]. Ezen túlmenően, az AP-4 pozitív expresszió jelzett rossz prognózist szignifikancia felett fokozat, csomópont állapot vagy méret ER + emlőrák, és egy lehetséges egyesület kemo-érzékenység [40]. A mi korábban tanulni, azt találtuk, hogy a kifejezés a AP-4-et túlzott mértékben, és ez közösen kapcsolatos a rossz prognózissal [30]. Ez lehet egy molekuláris marker diagnosztizálására és gyomorrák prognózisa. A jelen vizsgálatban ,. Azt tervezték, két AP-4 specifikus siRNS, hogy gátolják az expresszióját az AP-4 gén humán gyomorrák sejtek. Ezeket jól megalapozott és transzfektált sejtekbe eredményez knock-down AP-4 gén expressziója. Azt találtuk, hogy a leghatásosabb időpontban elnyomja az AP-4 expresszió gyomorrák sejteket 48 óra és 72 órával a transzfekció után. Így választottuk a korábbi további elvégzésére kapcsolódó vizsgálatot.

Korábban kimutatták, hogy a transzkripciós faktor AP-4, ellentétben más HLH-proteinek, tartalmazott két különálló leucin ismétlés elemeket, amelyek szintén közvetlen dimerizáció és lehetővé teszi a szelektív komplexképzés mindenütt AP-4 fehérje [8], [41].

AP-4 játszhatnak fontos szerepet modulálásában sejtfunkciók keresztül szabályozásában részt vevő gének virális termelés [7], [16 ], [22], [42], [43], a sejtek növekedését és túlélését [9], [17], [23], [44], az immunválasz [14], [41], [45], és az angiogenezist [21]. Peter Jung és társai találták, hogy az AP-4 lehetne kódolni egy c-myc-indukálható represszor gátolja a p21 expresszióját [9], és feltehetően fontos szerepet játszott közvetítésében a proliferatív aktivitása c-Myc [10]. Ezen túlmenően, az AP-4 befolyásolja az érzékenységet apoptózis által expresszióját szabályozó kaszpáz-9 [17]. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy down-regulációja AP-4 gátolta a proliferációt a humán gyomorrák sejtek in vitro. A proliferáció gátlás aránya AP-4 specifikus siRNS-ek szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a transzfektált sejtek kontroll siRNS vagy ál-csoport.

Kemoterápia az egyik fontos stratégia a kezelés a gyomorrák, de gyakran nem sikerül, mert a az ellenállást a rákellenes gyógyszerek. Azt jelentették, hogy AP-4 pozitív expresszió esetlegesen csatlakoztatott kemo-érzékenység [40]. Mi következő betöltött szerepét vizsgáltuk AP-4 szabályozásában kemo-érzékenysége az emberi gyomor rákos sejteket, és megállapította, hogy a gátlás az AP-4 jelentősen növeli az érzékenységet a ezeknek a sejteknek az ADR, az 5-FU vagy cisz-plantinum kezelés, ami arra utal, hogy gátlása AP-4 lehet jótékony hatást kemo-érzékenység.

Ezen felül, hangtompító AP-4, indukált sejtciklus a G0 /G1-fázisban, elemzés egy potenciális mechanizmusok mögöttes hatásainak az AP-4 hangtompító on gátlása humán gyomorrák sejtek proliferációját jellemezte expressziójának sejtciklus összefüggő szabályozók. Azt találtuk, hogy down-regulációja AP-4 expresszió gátolta a kifejezés a ciklin D1, de fel szabályozott expressziójának a p53 és p21. p53 és p21 feltételezték, hogy egy negatív szabályozója a sejtciklus és proliferációját [46], [47], a másik viszont, a ciklin D1 mozdítani progresszió keresztül a G _{1-S-fázisban a sejtciklus [48 ]. Alulszabályozott expresszióját AP-4, p21 és p53 időközben is, hogy az okozott sejtciklus kiütése AP-4 eltűnését. Ezek az eredmények összhangban vannak az egy modellt, amelyben AP-4 sejtciklusleállást által expresszióját szabályozó sejtciklus szabályozók, mint például a p53, p21 és ciklin D1.}

Az apoptózis, vagy programozott sejthalál, az úgynevezett részt venni a különböző biológiai folyamatok a két fő apoptotikus utak, a mitokondriális (intrinsic) útvonal, és a halál-receptor (extrinsic) út [49]. Azt találtuk, hogy elhallgattassa a AP-4 expresszió trigged apoptózis kísérletünkben, amelyek azt bizonyítják, hogy az AP-4 elfojtott apoptózis humán gyomorrák sejtek. Katalógusa

A mi kísérletünk, növekvő mértékű kaszpáz-9 és leszabályozza a Bcl-2 és Bcl-x _{L detektáltunk humán gyomorrák sejtek, jelezve, hogy kiütése AP-4 aktivált egyaránt intrinsic és extrinsic utak apoptózist ráksejtekben. [49], [50]}

Összefoglalva, az adatok azt mutatják, hogy az RNSi által közvetített down-regulációja transzkripciós faktor AP-4 hatékonyan gátolta a sejtburjánzást, jelzett sejtciklus kiváltott apoptózist és a fokozott kemo-érzékenység az emberi gyomor rákos sejteket a csökkent expressziója ciklin D1, a Bcl-2 és Bcl-x _{L és aktivált p21, p53 és kaszpáz-9 expresszióját, amely azt sugallta AP-4 lehet egy onkogén fontos szerepet játszanak a tumorigenezisben . Bár a pontos mechanizmus ezt a szerepet tovább kell vizsgálni, az AP-4specific-siRNS lehet potenciális értékek új terápiás hatóanyagok emberi gyomorrák. Katalógusa}

Anyagok és módszerek katalógusa

sejtvonal és sejttenyészet

emberi gyomor rákos sejtvonalak AGS a vad-típusú p53, SGC7901 mutáns p53 (nyert Wuhan Egyetem), és Kato-III p53 genom deléció (Zhiyan Bio Technology Co, Shanghai) tenyésztünk DMEM közegben vagy RPMI1640 tápközegben (Invitrogen) tartalmazó, 10% borjúembrió-szérumot (Invitrogen), penicillinnel (100 U /ml) és sztreptomicint (100 ng /ml). A sejteket 37 ° C-on nedvesített atmoszférában, 5% CO _2.

specifikus siRNS és transzfekciós

A cDNS-szekvencia az AP-4-gént úgy kaptuk a GenBank ( NM_003223) és célzási szekvenciák két 21 nukleotid különböző siRNS terveztünk és kémiailag szintetizált (Qiagen Németország). A nukleotid-szekvenciák a következők voltak: az siRNS-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(szensz), és 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (antiszensz). siRNS-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(szensz), és 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (antiszensz). Allstars negatív kontroll siRNS (Qiagen Németország) használtunk egy kódolt siRNS ellenőrzés. A sejteket szélesztettünk 6 lyukú lemezekre, és a siRNS-t transzfektáltunk a kultúra sejtek Lipofectamine 2000 (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint.

Valós idejű kvantitatív PCR

A teljes RNS-extrakciót végeztünk használva RNAiso Plus (Takara, Japán) határoztuk meg a gyártó utasításai szerint. A cDNS-eket teljes RNS alkalmazásával szintetizáltuk PrimeScript® RT reagenskészlet (Takara, Japán). Az mRNS-expresszió értékeltük real-time PCR egy ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapore) mellett gyorsan SYBR Green PCR reagensek. GAPDH alkalmazták, mint a belső ellenőrzés. A koncentrációkat a reagensek állítottuk be, hogy elérjük a végső térfogat 20 jil, amely 2

• PLoS One: hosszú távú eredményeket és prognosztikai tényezői gyomorrákos betegek mikroszkópos peritoneális Carcinomatosis
• PLoS One: Kockázatértékelés Gyomorrák helicobacter pylori által okozott használata CagA Sequence Markers