PLOS ONE: calpaïne /SHP-1 Interaction par Honokiol Mouillage péritonéale Diffusion de cancer gastrique dans nu /nu Mice

Résumé

Contexte

Honokiol, un poids produit naturel petit poids moléculaire, a été précédemment rapporté pour activer l'apoptose et inhiber la tumorigenèse gastrique. Que honokiol inhibe l'angiogenèse et la métastase des cellules de cancer gastrique reste inconnue.

Nous avons testé les effets de honokiol sur l'activité angiogénique et la diffusion péritonéale en utilisant in vivo, ex
Méthodologie /Principaux résultats vivo
et in vitro
systèmes de dosage. Les réponses de signalisation dans les cellules cancéreuses gastriques humaines, des cellules endothéliales vasculaires ombilicales humaines (HUVEC) et des tumeurs isolées ont été détectées et analysées. Dans un modèle murin de tumeur gastrique, une xénogreffe, de l'honokiol inhibée de manière significative la dissémination peritoneale détectée par la technique TEP /CT. Honokiol aussi efficacement atténué l'angiogenèse détectée par poussin essai sur la membrane chorio, fiche test de matrigel de la souris, le rat aortique cellulaire anneau endothéliale test de germination, et endothéliales essai de formation de tube de cellule. En outre, l'honokiol améliorée efficacement transducteur de signal et activateur de la transcription (STAT-3) déphosphorylation et inhibé STAT-3 activité de liaison à l'ADN dans les cellules cancéreuses gastriques humaines et des cellules HUVEC, qui a été corrélée avec la régulation positive de l'expression de l'activité et de la protéine d'homologie Src 2 (SH2) de la tyrosine phosphatase-1 contenant (SHP-1). inhibiteur de calpaïne-II et siRNA transfection inversée de manière significative la SHP-1 induite par l'activité honokiol. La diminution de STAT-3 phosphorylation et l'augmentation de SHP-1 expression ont également été présentés dans des tumeurs métastatiques péritonéale isolées. Honokiol était également capable d'inhiber la production de VEGF, qui pourrait être renversée par SHP-1 siRNA transfection.

Conclusions /Importance

Honokiol augmente l'expression et l'activité de SPH-1 qui désactive en outre la voie de STAT3. Ces résultats suggèrent également que honokiol est un roman et puissant inhibiteur de l'angiogenèse et la diffusion péritonéale des cellules de cancer gastrique, fournissant un soutien pour le potentiel d'application de honokiol dans le traitement du cancer gastrique

Citation:. Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et al. (2012) calpaïne /SHP-1 Interaction par Honokiol Mouillage péritonéale Diffusion de cancer gastrique dans nu /nu
souris. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10.1371 /journal.pone.0043711

Editeur: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Allemagne

Reçu le 17 Janvier 2012; Accepté le 24 Juillet 2012; Publié le 24 Août, 2012 |

Droit d'auteur: © Liu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par des subventions de recherche de l'Hôpital Taichung Veterans General, Taiwan (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) et le Conseil national des sciences de Taiwan (NSC99-2320-B-005-003-MY3). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

La majorité des patients (-60%) avec un cancer gastrique sont diagnostiqués avec la maladie à un stade avancé. Le cancer gastrique est la deuxième cause la plus fréquente de mortalité par cancer mondiale dans les pays développés et présente une maladie métastatique au moment du diagnostic [1]. Chirurgie et combinaison chimiothérapies pour cancer gastrique ont été montré pour conférer seulement des avantages de survie modestes dans les cas avancés, et près de 50% des patients meurent encore après récidive [2], [3]. Une forme majeure de récidive est la diffusion péritonéale. la croissance du cancer et les métastases péritonéales sont dépendantes de l'angiogenèse, un procédé qui implique plusieurs facteurs angiogéniques, y compris facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur de croissance basique des fibroblastes, la prostaglandine E2, de l'interleukine-8, une chimiokine (CXC motif) ligand 1, et la famille des métalloprotéinases matricielles [4] - [6]. Plusieurs signaux moléculaires, tels que le transducteur de signal et activateur de la transcription 3 (STAT-3), facteur nucléaire Eb, Akt, les protéines kinases activées par un mitogène, la cyclooxygénase-2, la lipoxygénase, la synthase inductible de l'oxyde nitrique, facteur de nécrose tumorale et d'autres , ont également été révélés être impliqués dans la progression tumorale et l'angiogénèse [7] - [9]. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement, de la progression et les métastases du cancer gastrique restent encore à préciser.

La kinase Janus activé (Jak) /voie de signalisation STAT joue un rôle important dans la régulation de la croissance cellulaire, l'angiogenèse, la différenciation, la migration et les métastases [10]. l'activation constitutive des voies de STAT, en particulier STAT-3 est associée à une grande variété d'affections malignes humaines. STAT-3 persistante phosphorylation a été observée dans divers cancers humains, tels que des tumeurs solides de l'estomac, du côlon, du foie, de la prostate, du sein, du poumon, de la tête et du cou ainsi que des tumeurs malignes du sang [8], [10]. étude antérieure a montré que la phosphorylation de STAT-3 et VEGF expression de la protéine est augmentée dans le tissu du cancer gastrique humain, qui à son tour élever le phénotype angiogénique et contribuer au développement du cancer de l'estomac et de la progression [11]. D'autre part, certaines phosphatases sont connus pour être des suppresseurs de tumeurs et peuvent jouer un rôle important dans l'inhibition ou le contrôle de la croissance du cancer [12] - [15]. des protéines tyrosine phosphatases (PTP), y compris SH2 domain-containing tyrosine phosphatase (SHP) -1 et SHP-2, sont capables de réguler négativement la signalisation STAT par la déphosphorylation de la tyrosine de plusieurs composants dans les voies de signalisation connexes [13] - [15] . L'activation continue de STAT-3 dans les tumeurs peut être facilitée au moins en partie par la perte de fonction de ces phosphatases. Calpaïne II a été montré à jouer un rôle dans le réticulum endoplasmique (RE) de stress régulé tumorigenèse, qui est impliqué dans le mécanisme de la tumorigenèse gastrique honokiol inhibé [16]. En outre, l'étude précédente a également indiqué que SHP-1 est un substrat endogène pour calpaïne après l'activation plaquettaire induite par A23187 [17]. Par conséquent, un calpaïne /STAT-3 SHP-1-réglementée et la voie du VEGF peut être impliqué dans l'angiogenèse, la croissance et la diffusion péritonéale des cellules de cancer gastrique.

Honokiol, un poids produit naturel petit-moléculaire, est un composé biphénolique actif majeur de Magnolia officinalis
, qui est connu pour améliorer l'infection microbienne, l'inflammation et les troubles gastro-intestinaux dans les systèmes médicinaux traditionnels asiatiques [18]. Notre étude précédente a démontré que l'honokiol inhibe la tumorigenèse gastrique par l'activation de la 15-lipoxygénase-1 et l'inhibition conséquente du récepteur-a et de la COX-2-dépendants des signaux de peroxisome proliferator-activated [19]. Honokiol a été montré pour induire un stress ER et de déclencher la calpaïne II induite par la protéine régulée par le glucose, 94 le clivage et l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques humaines [16]. Il a été démontré que l'expression de VEGF pourrait être sensibles à des conditions de privation de nutriments, ce qui cause un stress ER [20], [21]. En outre, l'activateur du stress ER tunicamycine a été trouvée pour empêcher nettement le développement des micro-vaisseaux, ce qui suggère que cette contrainte ER inducteur peut avoir un rôle potentiel dans le traitement d'une tumeur du sein [21]. Les effets de honokiol sur ER stress corrélé angiogenèse et la métastase de tumeur gastrique sont encore peu claires. Ici, nous avons supposé que l'honokiol inhibe l'angiogenèse et la dissémination peritoneale de cellules de cancer de l'estomac à travers un /SHP-1-régulé STAT-3 et le VEGF voie de calpaïne. Les résultats ont montré que l'angiogenèse honokiol nettement inhibée et la diffusion péritonéale des cellules de cancer gastrique par une calpaïne /SHP-1 interaction activé STAT-3 déphosphorylation et VEGF voie régulation vers le bas.

Honokiol

Résultats bloqué péritonéale Métastases du cancer gastrique in vivo

le cancer est souvent caractérisée par l'absorption accrue de [ ^{18F] fluoro-2-désoxy-D-glucose (FDG), et [ 18F] FDG /PET peut servir de mesure de substitution de l'efficacité thérapeutique. La possibilité fonctionnelle de l'imagerie du petit animal à l'aide d'un scanner TEP /CT clinique avec FDG a été évaluée. On a étudié quatre groupes de souris pour des expériences de métastases péritonéales. Une déclaration /image de la situation de métastases a été montré à la figure 1. Nous avons utilisé [ 18F] FDG-PET /CT pour détecter les métastases péritonéales chez les souris inoculées avec des cellules humaines gastriques cancéreuses (MKN45 ou SCM-1) avec ou sans traitement honokiol. Comme on le voit sur la figure 2, la projection d'intensité maximale a été générée à partir de souris représentatifs typiques. La métastase péritonéale a été marquée chez les souris de contrôle (panneau de gauche), et il a effectivement été renversé par le traitement honokiol (panneau de droite). Ces images montrent clairement que non invasive [ 18F] absorptions FDG dans les tumeurs métastatiques péritonéale de souris témoins étaient beaucoup plus élevés que ceux des souris honokiol traitées. La quantification de l'intensité est représentée sur la figure 3A. l'injection intrapéritonéale de l'honokiol (5 mg /kg, deux fois /semaine) a significativement réduit les comptages de radioactivité estimées et les valeurs spécifiques d'absorption (SUV) déterminée par TEP /CT chez les souris inoculées avec des cellules de cancer de l'estomac (Fig. 3). En outre, un grand nombre de nodules métastatiques ont été trouvées dans la cavité péritonéale (méso) des souris témoins inoculées avec des cellules MKN45 et SCM-1 (2 fig.). En revanche, les nodules de tumeur ont été observées de façon sporadique péritonéaux chez les souris traitées avec l'honokiol. Quantification des nodules par champ est représenté sur la figure 3B.}

Honokiol Inhibé angiogenèse in vivo
, ex vivo
et in vitro

les cellules endothéliales sont essentielles pour le processus angiogénique qui est nécessaire pour la croissance tumorale et les métastases. Nous avons ensuite étudié l'effet angiogénique de honokiol en utilisant le test de la membrane chorio poussin ( CAM
test), la fiche test de matrigel, anneau aortique test de germination, et la formation de tubes de cellules endothéliales. Comme on le voit sur la figure 4A, l'honokiol inhibe efficacement la formation de néo-vasculaires dans la CAM test sans aucun effet visible sur les vaisseaux sanguins préexistants. L'analyse quantitative a révélé que honokiol a provoqué une diminution de 2,5 fois le nombre de vaisseaux sanguins nouvellement formés par rapport à celle du milieu témoin.

Dans le test de prise de matrigel, matrigel contenant VEGF (100 gel ng /ml) avec ou sans honokiol (10 pg /ml) a été implantée par voie sous- cutanée dans des souris nude. Après 21 jours d'implantation, les bouchons de matrigel formés ont été excisés et photographiées. Plugs avec VEGF seuls étaient nettement entrelardées, vasculaire et de couleur rouge. Les bouchons contenant le VEGF et l'honokiol étaient blême, indiquant l'absence ou la diminution de la formation de vaisseaux sanguins (Fig. 4B-a). Nous avons également examiné la densité des vaisseaux et des vaisseaux morphologie dans les sections enfichables par H & E coloration et la coloration immunohistochimique avec un anticorps dirigé contre CD31, un marqueur des cellules endothéliales. La vascularisation dans le groupe honokiol + VEGF a été significativement réduite par comparaison avec le VEGF seul groupe (Fig. 4B-b). La quantification de la vascularisation en comptant les vaisseaux et les cellules endothéliales présentées a révélé que la densité vasculaire dans le groupe traité par l'honokiol est significativement diminuée (Fig. 4B-4B-c et d).

Ensuite, les cellules endotheliales ont été induites à germer à partir des anneaux isolés d'aorte de rat en présence de matrigel et ECGM (milieu de croissance des cellules endothéliales) contenant des cytokines angiogéniques tels que le VEGF et le facteur basique de croissance des fibroblastes. Extensif excroissance des cellules endotheliales de l'aorte de rat explants de cycle a été observée dans le groupe témoin (Fig. 5A). traitement Honokiol a donné lieu à une augmentation significative (~five fois) la réduction de la croissance des cellules endothéliales et la germination des anneaux aortiques (fig. 5A et 5C). Par ailleurs, la différenciation morphologique de la formation de tubes de cellules endotheliales a été étudiée en utilisant un procédé de matrigel bidimensionnelle. Comme on le voit sur la figure 5B, l'ensemencement des HUVEC dans matrigel vasculaire conduit à la formation de la structure tubulaire. Honokiol efficacement inhibé la formation de tubes de cellules endotheliales en réduisant la structure semblable à un tube en longueur et en largeur (Fig. 5B et 5D).

honokiol Abolished STAT-3 signalisation dans les cellules de cancer gastrique humain, HUVEC et Tumors

Des études antérieures ont montré une forte corrélation entre STAT-3 activée et le phénotype angiogénique [11]. Nous avons élucidé davantage l'effet de l'honokiol sur la phosphorylation de STAT-3 dans les cellules du cancer de l'estomac MKN45 et humains (AGS) et HUVEC. Comme on le voit sur la figure 6, l'honokiol a réduit la tyrosine (Tyr705) la phosphorylation de STAT-3 d'une manière dépendante du temps à une diminution d'environ deux fois à 02.01 h dans les cellules AGS (Fig. 6A) et de 3 à 10 pliez baisse à 0,5-24 h en MKN45 cellules (Fig. 6B). De manière surprenante, l'honokiol induite par STAT-3 déphosphorylation de Tyr705, mais pas Ser727, les résidus dans ces cellules de cancer gastrique humain. Cependant, honokiol simultanément inhibé à la fois Tyr705 et Ser727 phosphorylation de STAT-3 dans HUVEC (Fig. 6C). L'analyse quantitative des bandes de protéines dans le Western Blot en utilisant Image-Pro Plus le logiciel est représenté sur la figure 7. Les résultats de l'analyse au microscope confocal a également montré que l'honokiol abolit la tyrosine (Tyr705) la phosphorylation de STAT-3 dans les cellules AGS et HUVEC (fig . 8A).

Nous avons examiné en outre la phosphorylation de STAT-3 dans des tumeurs métastatiques isolées à partir du péritoine des souris nues inoculées avec des cellules MKN45 avec ou sans honokiol (5 mg /kg) de traitement. L'analyse immunohistochimique a montré que le p-STAT-3 surexpression et l'accumulation dans la région de la tumeur, y compris les noyaux et cytoplasme, était significativement inversé par un traitement honokiol (Fig. 8B). Dans l'analyse Western Blot, l'honokiol diminue nettement l'accumulation de p-STAT3 dans les tumeurs par comparaison avec le contrôle du véhicule (fig. 9A). L'expression de STAT3 constitutive n'a pas été affectée. En outre, l'activité de liaison à l'ADN de STAT-3 a été confirmée à l'aide EMSA. Comme on le voit sur la figure 9B, l'honokiol nettement inhibé l'augmentation de l'activité de liaison d'ADN de STAT-3 dans les cellules cancéreuses gastriques humaines. Honokiol inhibe également la STAT-3 ADN VEGF-activité accrue dans HUVEC (Fig. 9B) de liaison.

STAT-3 déphosphorylation dans les cellules cancéreuses gastriques Honokiol Induced SHP-1-réglementées, les cellules endothéliales, et Tumeurs

SHP-1 est un non-transmembranaire PTP [12]. Nous avons ensuite examiné si honokiol peut réguler l'expression et l'activité de SHP-1. Comme cela est représenté sur la figure 10A, l'honokiol amélioré l'expression de la protéine SHP-1, mais pas SHP-2, dans des cellules HUVEC et AGS d'une manière dépendante du temps. inhibiteur de PTP pharmacologique et SHP-1 transfection de siRNA a effectivement aboli l'honokiol induite par STAT-3 déphosphorylation dans des cellules HUVEC et AGS (Fig. 10B-a). Des résultats similaires dans le SCM-1 et des cellules endothéliales microvasculaires de souris immortalisée SV-40 (SVECs) traités par l'honokiol sont représentés sur la figure 10B-b. Nous avons ensuite examiné si endogène SHP-1 est modulée par honokiol. Honokiol est capable d'évoquer l'activité de SHP-1 dans les cellules cancéreuses gastriques, HUVEC et SVECs d'une manière dépendante du temps (Fig. 11A). Honokiol a également amélioré l'expression de la protéine SHP-1 dans les tumeurs métastatiques péritonéale isolées de souris MKN45-inoculés comme révélé par l'analyse immunohistochimique (Fig. 11B). Nous avons également étudié l'interaction entre SHP-1 et STAT-3 en utilisant les procédés de co-immunoprécipitation et transfert de Western. Comme cela est représenté sur la figure 11C, SHP-1 a été spécifiquement associé aux STAT-3 dans les cellules AGS et HUVEC en présence d'honokiol par rapport au contrôle d'IgG.

Altered SHP Honokiol ER Morphology, induite par la calpaïne II régulé -1-induite STAT-3 déphosphorylation et Diminué VEGF Generation

des études antérieures ont suggéré que le stress du RE joue un rôle important dans l'angiogenèse [20], [21]. Nous avons ensuite examiné l'effet de l'honokiol ER sur la microstructure au microscope électronique à transmission. Comme le montre la figure 12A, ER dilatation et la fragmentation ont été exposées dans-1 SCM cellules honokiol traités gastriques cancer et HUVEC.

Nous voulions également déterminer si l'activation calpaïne-II est nécessaire pour SHP-1 activité dans honokiol cellules traités par. inhibiteur de la calpaïne et pharmacologique calpaïne-II siRNA transfection efficacement réduits honokiol améliorée SHP-1 activité dans les cellules AGS et HUVEC (Fig. 12B). Les cellules traitées avec la protéine recombinante calpaïne II, en tant que témoin positif, a montré une augmentation de 4 à 5 fois dans SHP-1 'activité (Fig. 12B). VEGF est connu pour contenir le site de liaison STAT-3 promoteur. Nous avons ensuite examiné si honokiol peut réguler l'expression du VEGF. Honokiol réduit de manière significative la production de VEGF dans les cellules AGS et HUVEC, et cet effet a été inversé par SHP-1 transfection de siRNA (Fig. 12C). En outre, la transfection de mutants STAT-3 du plasmide dans les cellules a également inhibé la production de VEGF. La combinaison de honokiol avec mutant-STAT-3 plasmidique transfection dans des cellules synergétique a réduit la production de VEGF par rapport à une ou l'autre traitement seul (Fig. 12C). Pour confirmer davantage l'interaction entre la calpaïne II et SHP-1, la co-immunoprécipitation et transfert de Western ont été effectuées dans des cellules de cancer gastrique. Comme cela est représenté sur la figure 12D, la calpaïne II est spécifiquement associé à SHP-1 dans les cellules AGS en présence d'honokiol (20 uM) en comparaison avec le contrôle d'IgG. De même, la calpaïne induite honokiol-/SHP-1 interaction a également été trouvée dans HUVEC (données non présentées).

Discussion

Honokiol est un composant majeur de Magnolia officinalis
qui est un médicament de transition en Asie [18]. Honokiol possède des effets anti-oxydantes et anti-inflammatoires in vitro
et in vivo
[22] - [25]. Honokiol a été montré pour présenter une activité anti-proliférative puissante contre les cellules endothéliales in vitro
et anti-tumorales effets contre angiosarcome chez la souris nude [26]. Dans cette étude, nous avons démontré pour la première fois que l'honokiol est un inhibiteur puissant de l'angiogenèse et la métastase peritoneale d'un cancer gastrique. Notre recherche a porté sur les effets et les mécanismes possibles de honokiol sur métastases péritonéales et de l'angiogenèse en utilisant PET /CT, CAM
test, prise matrigel dosage, aortique cellulaire anneau endothéliale test de germination, endothéliale essai de formation de tube de cellules, et in vitro
expériences sur les cellules. Les résultats montrent que l'honokiol peut supprimer l'angiogenèse et la dissémination peritoneale par un SHP-1 activation en cascade de signalisation de la calpaïne II activé. L'activation de la phosphatase SHP-1 par honokiol en outre conduit à la régulation à la baisse de l'activation STAT-3 et la production de VEGF, ce qui entraîne l'inhibition de l'angiogenèse et la métastase peritoneale. Cependant, l'inhibition de l'angiogenèse et l'inhibition du potentiel métastatique des cellules cancéreuses par l'honokiol peut être les aspects distincts, l'un étant un effet d'honokiol sur l'angiogenèse directement et un autre effet de l'honokiol sur les cellules cancéreuses.

Au cours des dernières années, plusieurs études ont montré que l'activation constitutive de la famille STAT, en particulier STAT-3 est associée à une prolifération cellulaire, l'angiogenèse et les métastases [10], [11], [27] - [30]. Augmentation de l'activation de STAT-3 expression a été trouvée dans les différentes cellules dérivées de tumeurs et des échantillons de tissus cancéreux humains. Dérégulée STAT-3 activation a été suggéré de jouer un rôle important dans la surexpression de VEGF et l'augmentation de phénotypes angiogéniques dans le cancer gastrique, ce qui peut contribuer au développement du cancer gastrique et la progression [11]. Dans la présente étude, nous avons constaté que l'honokiol peut efficacement inhiber la phosphorylation de STAT-3 dans des cellules HUVEC (les deux sites Tyr705 et Serine727), des cellules de cancer gastrique humain (site Tyr705) et des tumeurs métastatiques du péritoine (site Tyr705). Comme l'activation oncogénique de tyrosine kinases est une caractéristique commune dans les cancers, nous nous sommes concentrés sur le rôle de Tyr705 phosphorylation de STAT-3.

SHP-1 possède une fonction de potentiel suppresseur de tumeur et est un régulateur négatif de la JAK /STAT voie de signalisation [15]. Il a également été démontré que la phosphatase SHP-1 peut se lier au domaine Y1173 phosphorylée, ce qui conduit à l'EGFR déphosphorylation [31]. Y429 dans le domaine cytoplasmique du récepteur de l'érythropoïétine a été suggéré que le site de liaison pour la protéine tyrosine phosphatase SH-PTP1, ce qui peut jouer un rôle important dans la terminaison des signaux prolifératifs [32]. SHP-1 a également été montré comme un antagoniste de la signalisation du facteur de croissance des cellules épithéliales et hématopoïétique [15]. SHP-1 a été particulièrement mis en évidence comme un antagoniste potentiel physiologique de VEGFR signalisation [33]. Dans les cellules endothéliales, SHP-1 est physiquement associé à VEGFR2 et est également nécessaire pour les deux TNFa induite par un tissu et un inhibiteur de métalloprotéinases (TIMP), l'inhibition de l'angiogenèse médié [31]. Ainsi, SHP-1 activation peut avoir des conséquences importantes pour la régulation de la prolifération et l'angiogenèse. Dans cette étude, nous avons constaté que l'honokiol spécifiquement amélioré l'expression de SHP-1, mais pas SHP-2, dans des cellules cancéreuses gastriques, les cellules endothéliales et les tumeurs métastasiques péritonéale. Ces résultats suggèrent que honokiol peut inhiber l'angiogenèse des cellules endothéliales et la métastase des cellules cancéreuses, ce qui peut être par une voie SHP-1 induite par STAT-3 down-regulation.

Des études antérieures ont proposé un rôle important pour le stress du RE dans le mécanisme moléculaire de l'angiogenèse et la croissance des cellules cancéreuses [16], [20], [21]. Koyama et ses collègues ont également suggéré que la perturbation de calcium ER induite par le stress peut être impliqué dans l'induction de l'accumulation amyloïde β et l'expression du facteur angiogénique dans l'épithélium pigmentaire rétinien [34]. Une étude récente a montré que la signalisation IRE-1α ER stress régulé possède une fonction essentielle dans le développement du placenta et la viabilité embryonnaire, mettant en évidence la relation entre le stress du RE, et de l'angiogenèse dans le placenta pendant la grossesse [35]. Kim et collègues ont montré que les deux SHP-1 et PSM-2 sont des substrats endogènes pour la calpaïne, qui est impliqué dans le contexte de Entamoeba histolytica
induite par la mort des cellules hôtes [36]. Notamment, les calpaïnes deviennent actifs lorsque le calcium intracellulaire ([Ca ^{2+] i) la concentration est élevée; m-calpaïne (calpaïne II) exige [Ca 2 +] i à une gamme millimolaire, mais des concentrations micromolaires de [Ca 2+] i sont assez pour l'activation de μ-calpaïne (calpaïne I) [37 ], [38]. Il a été montré qu'un haut niveau de [Ca 2+] i entrave l'activité de la protéine tyrosine kinase à la suite de l'activation de la calpaïne lors de la stimulation par l'ionophore dans les plaquettes [39]. Honokiol est capable d'induire [Ca 2+] i dans la mobilisation des cellules neuronales [40]. Récemment, tunicamycine a été signalé à inhiber l'angiogenèse in vivo
. Notre étude antérieure a montré que l'honokiol induit l'apoptose des cellules du cancer gastrique humaine et inhibe la tumorigenèse par une protéine régulée par le glucose, 94 le clivage à médiation par la calpaïne [16]. Dans la présente étude, nous avons carrément démontré que l'ER ont été dilaté et fragmentée dans les cellules et le cancer gastrique HUVEC honokiol traité. En outre, un inhibiteur pharmacologique de la calpaine et de la calpaïne II transfection de siRNA réduit efficacement l'honokiol améliorée SHP-1 'activité dans les cellules cancéreuses gastriques et des HUVEC. Notamment, nos résultats pour la première fois démontré que la calpaïne /SHP-1 interaction est déclenchée directement par inhibition honokiol de STAT-3 phosphorylation dans les cellules de cancer gastrique. Ces résultats indiquent que honokiol peut induire un stress ER et de déclencher la calpaïne-II-activé SHP-1 activité dans les cellules de cancer de l'estomac et les cellules endothéliales.}

En conclusion, les résultats de la présente étude fournira in vivo , ex vivo et
in vitro
preuves pour l'inhibition de l'angiogenèse et la dissémination peritoneale de cellules de cancer gastrique par honokiol et une base moléculaire pour les effets. Ces données mettent en évidence l'implication de la calpaïne ER et la protéine tyrosine phosphatase SHP-1 signalisation STAT-3 et l'activation du VEGF production honokiol inhibée dans les cellules cancéreuses gastriques et les cellules endothéliales (fig. 13). Ces résultats suggèrent également que la régulation négative de STAT-3 et VEGF signalisation induite par la calpaïne /SHP-1 peut être une stratégie thérapeutique prometteuse pour le traitement du cancer gastrique.

Matériels et méthodes Cellules et de la culture

lignes humaines gastriques de cellules cancéreuses, y compris une lignée cellulaire Caucasien (AGS, modérément /mal (mixtes) cellules d'adénocarcinome différenciées) et des lignées cellulaires asiatiques (MKN45 et SCM-1, les cellules d'adénocarcinome indifférenciées) ont été obtenus à partir de la banque de cellules de Taipei Veterans General Hospital (Taiwan). Les cellules ont été maintenues dans du milieu RPMI1640 contenant 10% de FCS et de streptomycine /pénicilline dans un humidifiée de 5% de CO _{2 atmosphère.}

HUVEC ont été obtenus à partir des veines du cordon ombilical par traitement à la collagénase tel que décrit précédemment [41]. Cette étude est conforme aux principes d'utilisation des tissus humains énoncés dans la Déclaration d'Helsinki. Le protocole d'étude a été approuvé par le Conseil de Taichung Veterans General Hospital, Taichung, Taiwan (document approuvé TCVGH-C0062-1) Examen éthique. HUVEC au troisième passage ont été utilisés. L'efficacité de la transfection (> 80%) par le réactif lipofectine (Invitrogen) a été déterminée au troisième passage. Dans certaines expériences, SV-40 de souris immortalisée microvasculaire cellules endothéliales (SVECs) cultivées dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline /streptomycine. lignée cellulaire SVEC a été aimablement offert par Dr. KH Lan (Cancer Center, Taipei Veterans General Hospital, Taiwan).

Honokiol a été obtenu à partir de Wako Chemical Company (Osaka, Japon), et il a été déterminé à être au moins 99% de pureté par HPLC. Différentes concentrations d'honokiol ont été utilisés dans cette étude en fonction de la sensibilité aux médicaments indiqués par des valeurs IC50 (uM dans 20 AGS, 40 pM dans MKN45 et SCM-1). les cellules AGS MKN45 et SCM-1 cellules, mais non, ont été montré pour induire efficacement des tumeurs dans un modèle de souris xénogreffe de tumeur.

Animaux

Tous les soins des animaux et des procédures expérimentales ont été approuvées et menées par le Comité pour l'expérimentation animale, Université nationale Chung Hsing, Taichung, Taiwan (document approuvé NCHU-100-26). souris /c nu de quatre à six semaines mâles âgés BALB ont été achetés chez NLAC (Taipei, Taiwan). Les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques, fournis avec de la nourriture et de l'eau stérilisée ad libitum
et logé dans une installation de barrière avec un cycle de 12 h de lumière /obscurité.

xénogreffe de tumeur souris Modèle

Pour évaluer la métastase péritonéale, les cellules cultivées de cancer gastrique humain (4~5 × 10 ^{6 cellules) ont été inoculées dans la cavité péritonéale de souris BALB /c nude [42]. tumeurs péritonéale chez la souris nude ont été établies pendant 7 jours après l'injection de cellules de cancer gastrique, dans lequel les tumeurs ont été vérifiées par la surveillance PET /CT. Ensuite, les souris ont été injectées par voie intrapéritonéale avec honokiol (5 mg /kg /fois par semaine) pendant 28 jours. L'effet de honokiol sur la diffusion péritonéale a été évaluée par PET /CT. Une déclaration /image de la situation de métastases a été décrite dans la figure 1. Ensuite, les souris ont été sacrifiées sous anesthésie (pentobarbital) et examinés macroscopiquement pour la présence de métastases péritonéales. Les tumeurs ont été excisées, coupé en blocs, fixée à 10% de formaline, et intégrés dans des blocs de paraffine ou congélation rapide dans de l'azote liquide.}

tomographie par émission de positons Tomographie /Computed (PET /CT) Numérisation

Après au moins 6 h de jeûne, les souris ont reçu un 7,4 MBq (0,2 mCi) dose de ^{18F-FDG par voie orale avant le rinçage avec 1 ml d'eau. Les souris ont été anesthésiés avec un vaporisateur isoflurane avant chaque analyse. Des expériences pour l'imagerie du petit animal ont été effectuées avec un scanner combiné PET /CT (Discovery ST; GE Medical Systems). Une multidetector rangée tomodensitomètre hélicoïdal a été utilisé. Les paramètres techniques utilisés dans la partie CT du PET /CT ont été les suivants: CT Type de balayage avec une 0,5 seconde analyse complète hélicoïdale, une configuration détecteur de rangée de 16 × 1,25 mm, un espace intervalle de 2,75 mm, une épaisseur de tranche de 1,25 mm , un pas de 1.75:1 (mode haute qualité), une vitesse de 17,5 mm par rotation, un grand champ de vision (FOV), tension de 120 kV et un courant de 200 mA. Les paramètres techniques utilisés pour la partie PET PET /CT étaient les suivants: 10,0 min dans chaque lit, le FOV choisi pour la reconstruction de l'imagerie était de 20 cm et la résolution PET était d'environ 4,5 mm de largeur à mi-hauteur (FWHM). Les paramètres de reconstruction étaient de type itération 3D comme 21 sous-ensembles et 2 itérations. Pour évaluer la capacité de quantification de la /CT scanner PET en imagerie du petit animal, une région d'intérêt (ROI) a été placé sur les petits FOV images PET transaxiales pour entourer complètement les zones de FDG dans les tissus observés, tout en évitant les tissus voisins. La moyenne de la valeur de l'activité de chaque pixel dans chaque ROI a été enregistrée et exprimée en Bq /ml.}

Chick chorioallantoïque Membrane Assay ( CAM
Assay)

Pour enquêter sur la vivo
activité angiogénique dans, un animal entier poussin modifié CAM
test a été réalisé comme décrit précédemment [43]. oeufs de poulet fécondés ont été incubés dans un éleveur d'oeuf en continu humidifié à 37 ° C. Au bout de 3 jours d'incubation, les embryons de poulet ont été transférés dans une boîte de culture. Vingt ul de honokiol piégé dans du collagène de type mélange a été appliqué sur des disques de revêtement et polymérisé par le réchauffement. Les disques ont été chargés sur le CAM
6 jours embryons âgés. Après 24 heures d'incubation, la zone autour du disque chargé a été photographié avec un appareil photo numérique Nikon, et le nombre de vaisseaux nouvellement formés a été compté par deux observateurs en double-aveugle. Des tests pour chaque échantillon d'essai ont été réalisées à l'aide 10-13 oeufs.

Plug-Matrigel Assay

souris nude ou les souris C57BL /6 ont été injectées par voie sous-cutanée avec 0,6 ml de matrigel contenant la quantité indiquée de capsaïcine , 100 ng de VEGF, et 10 unités d'héparine. Le matrigel injecté rapidement formé une seule prise, de gel solide. Après 7-21 jours, la peau de la souris a été facilement retiré pour exposer le bouchon de matrigel, qui est resté intact. L'hémoglobine a été mesurée en utilisant la méthode de Drabkin et d'un kit de réactif de Drabkin 525 (Sigma, St Louis, MO) pour la quantification de la formation de vaisseaux sanguins. La concentration de l'hémoglobine est calculée à partir d'une quantité connue d'hémoglobine analysé en parallèle. Les images ont été photographiés avec un appareil photo numérique Nikon, et le nombre de micro-vaisseaux nouvellement formés a été compté.

Aortic Anneau Assay
Ex Vivo

aortes ont été isolés à partir de 6 -Week vieux rats Sprague-Dawley. Les plaques (48 puits) ont été revêtues avec 120 pi de matrigel. Aortes isolées de souris ont été nettoyées des tissus adipeux et conjonctif periadventitial, et coupés en ~ 1 mm de long et 1,5 mm de long anneaux. Après avoir été rincées cinq fois avec un milieu à base de cellules endothéliales, les aortes ont été placées dans les puits de matrigel recouvert et recouvert d'un autre 100 pi de matrigel. Honokiol ou du véhicule ont été ajoutés aux puits dans un volume final de 250 ul de milieu.

• PLOS ONE: Rapport entre positif et négatif des ganglions lymphatiques est approprié pour l'évaluation du pronostic des patients atteints de cancer gastrique avec métastases ganglionnaires positifs
• PLOS ONE: Haute γ-Radiation sensibilité est associée à une augmentation du risque de cancer gastrique dans un Han Population chinoise: A Case-Control Analyse