PLOS ONE: Calpain /SHP-1 Interação por Honokiol Dampening Peritoneal Divulgação de câncer gástrico em nu /nu Mice

Abstract

Fundo

Honokiol, um produto natural pequeno peso molecular, tem anteriormente foi relatado para activar a apoptose e inibir a tumorigénese gástrico. Se honokiol inibe a angiogênese e metástase das células cancerosas gástricas permanece desconhecida.

Metodologia /Principais Achados

Foram testados os efeitos de honokiol sobre a atividade angiogênico e disseminação peritoneal usando in vivo, ex in vitro
sistemas de ensaio in vivo
e. As respostas de sinalização em células de cancro gástrico humano, células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVEC), e tumores isolados foram detectados e analisados. Em um modelo de rato tumor gástrico xenotransplante, honokiol inibiu significativamente a disseminação peritoneal detectados pela técnica de PET /CT. Honokiol também efetivamente atenuou a angiogênese detectado pelo ensaio pintainho membrana corioalant�ca, ensaio plugue rato matrigel, ensaio de germinação de aorta célula endotelial anel de rato, e ensaio de formação de tubos de células endoteliais. transdutor de sinal Além disso, honokiol efectivamente melhorada e activador de transcrição desfosforilação (STAT-3) e inibiu a actividade de ligação ao ADN de STAT-3 em células de cancro gástrico humano e células HUVEC, que estava correlacionado com o aumento da regulação da expressão de homologia Src actividade e proteína 2 (SH2) molecular contendo tirosina fosfatase-1 (SHP-1). inibidor de calpaína II e siRNA transfecção inverteu significativamente a actividade de SHP-1 induzida por honokiol. A diminuição da fosforilação de STAT-3 e aumentou SHP-1 expressão também foram demonstrados em tumores metastáticos peritoneais isolados. Honokiol também foi capaz de inibir a geração de VEGF, o que poderia ser revertida por SHP-1 siRNA transfecção.

Conclusões /Significado

Honokiol aumenta a expressão ea atividade da SPH-1 que desativa outra via de STAT3. Estas descobertas também sugerem que honokiol é um novo e potente inibidor da angiogênese e disseminação peritoneal de células cancerosas gástricas, fornecendo suporte para o potencial aplicação de honokiol na terapia do cancro gástrico

Citation:. Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et al. (2012) Calpain /SHP-1 Interação por Honokiol Dampening Peritoneal Divulgação de câncer gástrico em nu /nu
Mice. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10.1371 /journal.pone.0043711

editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Alemanha |

Recebido: 17 Janeiro, 2012; Aceito: 24 de julho de 2012; Publicação: 24 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação a partir de Taichung Veterans general Hospital, Taiwan (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) e do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan (NSC99-2320-B-005-003-MY3). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A maioria dos pacientes (-60%) com câncer gástrico são diagnosticadas com doença em estágio final. O câncer gástrico é a segunda causa mais comum de mortalidade por câncer global em nações desenvolvidas e exibe doença metastática no momento do diagnóstico [1]. Cirurgia e combinação quimioterapia para o câncer gástrico têm sido mostrados para conferir apenas benefícios modestos de sobrevivência em casos avançados, e quase 50% dos pacientes ainda morrem após o retorno [2], [3]. A principal forma de recorrência é a disseminação peritoneal. o crescimento do cancro e metástases peritoneais são dependentes da angiogénese, um processo que envolve vários factores angiogénicos incluindo o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento de fibroblastos básico, prostaglandina E2, interleucina-8, quimiocina (CXC motivo) ligando 1, e a família de metaloproteinases da matriz [4] - [6]. Vários sinais moleculares, tais como o transdutor de sinal e activador de transcrição-3 (STAT-3), factor nuclear-EB, Akt, proteínas quinases activadas por mitogénio, ciclo-oxigenase-2, lipoxigenase, sintase de óxido nítrico indutível, factor de necrose tumoral e outros , também foram exibidas para serem envolvidos em progressão tumoral e angiogénese [7] - [9]. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento, progressão e metástase de câncer gástrico ainda devem ser esclarecidas.

A quinase Janus-ativado (Jak) /via de sinalização STAT desempenha um papel importante na regulação da o crescimento celular, angiogénese, diferenciação, migração, e metástase [10]. A activação constitutiva de vias de STAT, particularmente STAT-3, está associada com uma grande variedade de malignidades humanas. Persistente fosforilação de STAT-3 tem sido observado em vários cancros humanos, tais como tumores sólidos, do estômago, do cólon, do fígado, da próstata, da mama, pulmão, cabeça e pescoço e, bem como doenças malignas do sangue [8], [10]. estudo anterior demonstrou que a fosforilação de STAT-3 e expressão da proteína VEGF são aumentados em tecido de cancro gástrico humano, que por sua vez elevar o fenótipo angiogénico e contribuir para o desenvolvimento e progressão do cancro gástrico [11]. Por outro lado, certos fosfatases são conhecidos como sendo supressores tumorais e pode desempenhar um papel importante na inibição ou no controlo do crescimento do cancro [12] - [15]. proteína tirosina fosfatases (PTPs), incluindo SH2 contendo o domínio de tirosina-fosfatase (PCH) -1 e SHP-2, são capazes de regular negativamente a sinalização STAT pela desfosforilação da tirosina de vários componentes nas vias de sinalização relacionados [13] - [15] . A activação contínua de STAT-3 nos tumores pode ser facilitada, pelo menos em parte, pela perda de função destas fosfatases. A calpaína II foi demonstrado desempenhar um papel no retículo endoplasmático (ER) reguladas tumorigénese-stress, que está envolvido no mecanismo de tumorigénese gástrica honokiol inibida [16]. Além disso, também estudo anterior indicou que a SHP-1 é um substrato de calpaína endógena para seguir a activação de plaquetas induzida por A23187 [17]. Portanto, um calpaína /SHP-1-regulada STAT-3 e via de VEGF pode estar envolvido na angiogénese, o crescimento e disseminação de células de cancro peritoneal gástricas.

Honokiol, um produto natural pequeno peso molecular, é um importante composto biphenolic activa de Magnolia officinalis
, que é conhecido para melhorar infecção microbiana, inflamação e distúrbios gastrointestinais em sistemas medicinais tradicionais asiáticos [18]. O nosso estudo anterior demonstrou que inibe a tumorigénese honokiol gástrico pela activação de 15-lipoxigenase-1 e a consequente inibição de sinais de peroxissoma activados pelo proliferador do receptor-A e da COX-2 dependentes [19]. Honokiol tem sido mostrado induzir ER stress e desencadear a calpaina II mediada por proteína de 94 clivagem regulada por glucose e apoptose em células de cancro gástrico humano [16]. Tem sido demonstrado que a expressão do VEGF poderia ser sensível às condições de privação de nutrientes, que provocam o stress ER [20], [21]. Além disso, o ER tunicamicina estresse activador foi encontrado para prevenir significativamente o desenvolvimento da microvasculatura, sugerindo que este ER o stress indutor pode ter um papel potencial no tratamento de tumores da mama [21]. Os efeitos da honokiol sobre ER angiogênese correlacionado-stress e metástase do tumor gástrico ainda não estão claros. Aqui, a hipótese de que honokiol inibe a angiogênese e disseminação peritoneal de células cancerosas gástricas através de uma PCH-1-regulamentado STAT-3 e VEGF via /calpaína. Os resultados mostraram que honokiol angiogênese marcadamente inibido e disseminação peritoneal de células cancerosas gástricas através de um calpaína /SHP-1 activado-interação STAT-3 desfosforilação e VEGF via infra-regulação.

Resultados

Honokiol bloqueado peritoneal metástase do câncer gástrico in vivo

Cancro é frequentemente caracterizada pelo aumento da captação de [ ^{18F] fluoro-2-desoxi-D-glicose (FDG), e [ 18F] /PET pode servir como uma medida substituta da eficácia terapêutica. foi avaliada a possibilidade funcional de imagens de pequenos animais usando um scanner /CT clínica PET com FDG. Quatro grupos de ratinhos para experiências metástases peritoneais foram investigados. Uma declaração /quadro da situação metástase foi mostrado na Figura 1. Nós utilizamos [ 18F]-PET /CT para detectar metástases peritoneais em camundongos inoculados com células humanas de câncer gástrico (MKN45 ou SCM-1) com ou sem tratamento honokiol. Como mostrado na Figura 2, a projecção de intensidade máxima foi gerado a partir de ratinhos representativos típicos. A metástase peritoneal foi marcado nos ratinhos de controlo (painel esquerdo), e foi eficaz na reversão pelo tratamento honokiol (painel da direita). Estas imagens mostraram claramente que não invasiva [ 18F] absorções -FDG em tumores metastáticos peritoneal de camundongos de controle eram muito mais elevados do que nos ratos tratados com honokiol. A quantificação da intensidade é mostrado na Figura 3A. A injecção intraperitoneal de honokiol (5 mg /kg, duas vezes /semana) reduziu significativamente as contagens de radioactividade estimados e valores de absorção específicos (SUV) determinados por FDG-PET /CT em ratos inoculados com células cancerígenas gástricos (Fig. 3). Além disso, muitos nódulos metastáticos foram encontradas na cavidade peritoneal (mesentério) dos ratinhos de controlo inoculados com MKN45 e SCM-1 (Fig. 2) células. Em contraste, os nódulos tumorais peritoneais foram observados esporadicamente em murganhos tratados com honokiol. Quantificação de nódulos por campo é mostrado na Figura 3B.}

Honokiol inibido Angiogenesis in vivo
, ex vivo
, e in vitro

as células endoteliais são críticos para o processo angiogénico, a qual é necessária para o crescimento tumoral e metástases. A seguir, investigou o efeito angiogênico do honokiol usando o ensaio de membrana corioalant�ca pinto ( CAM
ensaio), o ensaio de plugue matrigel, ensaio brotando anel aórtico, e formação de tubos de células endoteliais. Como mostrado na Figura 4A, honokiol inibiu eficazmente a formação de neo-vascular no CAM
ensaio, sem qualquer efeito visível nos vasos sanguíneos pré-existentes. A análise quantitativa revelou que honokiol causou um decréscimo de 2,5 vezes no número de vasos sanguíneos recentemente formados, em comparação com a de controlo do meio.

No ensaio de tampão de Matrigel, Matrigel contendo VEGF (100 ng /ml de gel) com ou sem honokiol (10 ug /mL) foi implantada subcutaneamente em ratinhos nus. Após 21 dias de implantação, os tampões de Matrigel formados foram excisados ​​e fotografado. Plugues somente com VEGF foram marcadamente entremeadas, vascular e de cor vermelha. Tomadas contendo VEGF e honokiol foram pálido, indicando nenhuma ou menos formação de vasos sanguíneos (Fig. 4B-a). Também examinou a densidade de vasos e morfologia navio nas seções de plug por H & E coloração e coloração imuno-histoquímica com um anticorpo contra CD31, um marcador de células endoteliais. A vascularização no grupo honokiol + VEGF foi significativamente reduzida quando comparada com o grupo de VEGF sozinho (Fig. 4B-b). Quantificação da vascularização por contagem dos vasos e células endoteliais apresentados revelou que a densidade vascular no grupo tratado com honokiol foi significativamente diminuída (4B-C Figs. 4B e-d)

A seguir foram induzidas.
, Células endoteliais a brotar a partir dos anéis de aorta de rato isolada na presença de Matrigel e ECGM (meio de crescimento de células endoteliais) contendo citocinas angiogénicos, tais como VEGF e factor de crescimento de fibroblastos básico. crescimento de células endoteliais extensiva a partir de explantes de anel de aorta de rato foi observado no grupo de controlo (Fig. 5A). Honokiol tratamento resultou numa redução significativa (~five vezes) de crescimento endotelial e brotação de anéis aórticos (Figs. 5a e 5c). Além disso, a diferenciação morfológica de formação do tubo endotelial celular foi investigada usando um método de matrigel bidimensional. Como mostrado na Figura 5B, a sementeira de células HUVEC em Matrigel levou à formação de estruturas do tipo tubo vascular. Honokiol inibiu eficazmente a formação de tubos de células endoteliais através da redução da estrutura de tubo, em comprimento e largura (Fig. 5B e 5D).

Honokiol Abolished STAT-3 de sinalização em células de cancro gástrico humano, células HUVEC, e tumores

estudos anteriores demonstraram uma forte correlação entre STAT-3 activado e fenótipo angiogênico [11]. Nós elucidado ainda mais o efeito de honokiol na fosforilação de STAT-3 em células de cancro gástrico humano (AGS e MKN45) e HUVECs. Como mostrado na Figura 6, o honokiol reduzida (Tyr705) fosforilação de STAT-3 de um modo dependente do tempo, com uma diminuição de cerca de duas vezes em 1-2 h tirosina em células AGS (Fig. 6A) e um 3 a 10- dobrar a diminuição 0,5-24 h em células MKN45 (Fig. 6B). Surpreendentemente, honokiol induzida STAT-3 desfosforilação de Tyr705, Ser727 mas não, resíduos nestas células gástricas cancerosas humanas. No entanto, honokiol simultaneamente inibida tanto Tyr705 e Ser727 fosforilação de STAT-3 em células HUVEC (Fig. 6C). A análise quantitativa das bandas de proteína na Western blot usando o programa Image-Pro Plus Software é mostrado na Figura 7. Os resultados da análise com o microscópio confocal mostraram também que honokiol aboliu a tirosina (Tyr705) fosforilação de STAT-3 em células AGS e HUVECs (Fig . 8A).

Examinámos ainda mais a fosforilação de STAT-3 em tumores metastáticos peritoneais isolados de ratinhos nus inoculados com células MKN45 com ou sem tratamento honokiol (5 mg /kg). A análise imuno-histoquímica mostrou que a p-STAT-3 sobre-expressão e acumulação na região do tumor, incluindo núcleos e citoplasma, foi significativamente invertida por tratamento honokiol (Fig. 8B). Na análise de transferência de Western, honokiol diminuiu marcadamente a acumulação de p-STAT3 em tumores, em comparação com o controlo de veículo (Fig. 9A). A expressão constitutiva de STAT3 não foi afectada. Além disso, a actividade de ligação a ADN de STAT-3 foi ainda confirmada usando a EMSA. Tal como mostrado na Figura 9B, o honokiol inibiu marcadamente a um aumento da actividade de ligação ao ADN de STAT-3 em células de cancro gástrico humano. Honokiol também inibiu o aumento de VEGF-STAT-3 actividade em HUVECs (Fig. 9B) de ligação ao ADN.

Honokiol Induzida SHP-1-regulados STAT-3 Desfosforilação gástrico em células cancerosas, células endoteliais, e tumores

SHP-1 é um não transmembranar PTP [12]. A seguir, analisou se honokiol pode regular a expressão e atividade da SHP-1. Como mostrado na Figura 10A, honokiol aumentou a expressão de proteínas de SHP-1, mas não SHP-2, em células HUVEC e AGS de uma forma dependente do tempo. inibidor de PTP farmacológicos e SHP-1 siRNA transfecção aboliu eficazmente o STAT-3 induzida por desfosforilação honokiol em células HUVEC e AGS (Fig. 10B-a). Resultados semelhantes em células SCM-1 e células endoteliais imortalizadas SV-40 de rato (microvasculares SVECs) tratados com honokiol estão apresentados na Figura 10B-b. A seguir, analisou se endógena SHP-1 é modulada por honokiol. Honokiol foi capaz de evocar a actividade SHP-1 em células de cancro gástrico, HUVEC e SVECs de uma forma dependente do tempo (Fig. 11A). Honokiol também aumentou a expressão da proteína SHP-1 em tumores metastáticos peritoneais isolados de ratinhos MKN45-inoculados, conforme revelado por análise imunoistoquímica (Fig. 11B). Foi investigada mais a interacção entre SHP-1 e STAT-3, utilizando os métodos de co-imunoprecipitação e Western blotting. Como mostrado na Figura 11C, SHP-1 estava especificamente associada com o STAT-3 em células AGS e células HUVEC na presença de honokiol em comparação com o controlo de IgG.

PCH Honokiol Alteradas ER Morfologia, induziu-calpaína II-regulada -1-induzida STAT-3 Desfosforilação, e diminuição de VEGF Geração

estudos anteriores sugeriram que o stress ER desempenha um papel importante na angiogénese [20], [21]. A seguir, examinou o efeito de honokiol na microestrutura ER por microscopia eletrônica de transmissão. Como mostrado na Figura 12A, a dilatação ER e fragmentação foram exibidas em SCM-1 células cancerosas tratadas com honokiol gástricas e HUVECs.

Também queríamos determinar se a activação de calpaína-II é necessário para SHP-1 actividade em honokiol células tenha sido tratada com. inibidor de calpaína farmacológica e calpaína-II siRNA transfecção efetivamente reduziu a atividade SHP-1-honokiol reforçada em células AGS e HUVECs (Fig. 12B). As células tratadas com calpaina recombinante-II, como um controlo positivo, revelou um aumento de 4 a 5 vezes em SHP-1 actividade (Fig. 12B). O VEGF é conhecido por conter o local de ligação ao promotor de STAT-3. A seguir, analisou se honokiol pode regular a expressão de VEGF. Honokiol reduziu significativamente a produção de VEGF em células HUVEC e AGS, e este efeito foi revertido pela SHP-1 siRNA transfecção (fig. 12C). Além disso, a transfecção de mutantes STAT-3-plasmídeo em células, também inibiu a produção de VEGF. A combinação de honokiol com mutantes STAT-3-transfecção de plasmídeo em células sinergicamente reduziu a produção de VEGF em comparação com qualquer dos tratamentos sozinhos (Fig. 12C). Para confirmar ainda mais a interacção entre a calpaína II e SHP-1, co-imunoprecipitação e Western blot foram realizados em células de cancro gástrico. Tal como mostrado na Figura 12D, a calpaína-II foi especificamente associada com SHP-1 em células AGS na presença de honokiol (20 uM) em comparação com o controlo de IgG. Da mesma forma, a calpaina induzida por honokiol /SHP-1 interacção também foi encontrado em células HUVEC (dados não mostrados).

Discussão

Honokiol é um componente importante de Magnolia officinalis
, que é um medicamento de transição na Ásia [18]. Honokiol possui efeitos anti-oxidantes e anti-inflamatórias in vitro
e in vivo
[22] - [25]. Honokiol tem sido demonstrado que exibem actividade anti-proliferativa contra as células endoteliais potente in vitro
e anti-tumor contra os efeitos angiossarcoma em ratinhos nus [26]. Neste estudo, foi demonstrado pela primeira vez que honokiol é um inibidor potente da angiogénese e metástases de cancro gástrico peritoneal. Nossa pesquisa centrou-se sobre os efeitos e possíveis mecanismos de honokiol em metástase peritoneal e angiogênese utilizando PET /CT, CAM
ensaio, ensaio plugue matrigel, ensaio de germinação de aorta célula endotelial anel, o ensaio de formação de tubos de células endoteliais, e experimentos in vitro de células
. Os resultados mostraram que o honokiol pode suprimir a angiogénese e disseminação peritoneal através de um SHP-1 activação da cascata de sinalização de calpaína II-activado. A activação da fosfatase SHP-1 por honokiol ainda levou ao sub-regulação de STAT-3 e a activação de VEGF produção, resultando na inibição da angiogénese e metástases peritoneais. No entanto, a inibição da angiogénese e a inibição do potencial metastático de células cancerosas por honokiol podem ser os aspectos separados, sendo um deles um efeito de honokiol directamente na angiogénese e um outro efeito de honokiol em células cancerosas.

Durante os últimos anos, uma série de estudos indicam que a activação constitutiva da família STAT, especialmente STAT-3, está associada com a proliferação celular, angiogénese e metástase [10], [11], [27] - [30]. O aumento da expressão de activação de STAT-3 tem sido encontrada em várias células derivadas de tumor e amostras de tecidos de cancro humano. Desregulada activação de STAT-3 tem sido sugerido para desempenhar um papel importante na sobre-expressão de VEGF e aumentou fenótipos angiogénicos em cancro gástrico, o que pode contribuir para o desenvolvimento e progressão do cancro gástrico [11]. No presente estudo, descobrimos que honokiol pode efetivamente inibir a fosforilação das células cancerosas gástricas humanas (do site Tyr705) STAT-3 em HUVECs (ambos os sites Tyr705 e Serine727), e tumores metastáticos peritoneal (local Tyr705). À medida que a activação oncogénica de tirosina-quinases é uma característica comum em cancros, que voltada para o papel de Tyr705 fosforilação de STAT-3.

SHP-1 possui um potencial função supressora de tumor e é um regulador negativo da JAK /via de sinalização STAT [15]. Também tem sido demonstrado que a SHP-1 fosfatase pode ligar-se ao Y1173 domínio fosforilado, o que leva à desfosforilação de EGFR [31]. Y429 no domínio citoplasmático do receptor de eritropoietina tem sido sugerida para ser o local de ligação para a proteína-tirosina-fosfatase-SH PTP1, que podem desempenhar um papel importante na terminação de sinais proliferativos [32]. SHP-1 também tem mostrado ser um antagonista de factor de crescimento de sinalização em células epiteliais e hematopoiéticas [15]. SHP-1 foi especialmente destacada como um potencial antagonista fisiológico de VEGFR sinalização [33]. Em células endoteliais, SHP-1 está fisicamente associada com VEGFR2 e também é necessária para ambos mediada por TNFa e o tecido inibidor de metaloproteinases (TIMP) a inibição mediada por angiogénese de [31]. Assim, SHP-1 ativação pode ter consequências importantes para a regulação da proliferação e angiogênese. Neste estudo, verificou-se que honokiol especificamente aumentou a expressão de SHP-1, mas não SHP-2, em células gástricas cancerosas, células endoteliais e tumores metastáticos peritoneais. Estes achados sugerem que o honokiol podem inibir a angiogénese de células endoteliais e a metástase de células de cancro, o que pode ser através de um STAT-3 sub-regulação induzida por via de SHP-1.

Estudos anteriores propuseram um papel importante para o stress no ER o mecanismo molecular da angiogénese e o crescimento de células de cancro [16], [20], [21]. Koyama e colegas também sugeriram que a perturbação de cálcio induzida por stresse ER podem estar envolvidos na indução da acumulação de amilóide β e expressão do factor angiogénico no epitélio pigmentado da retina [34]. Um estudo recente mostrou que a sinalização de IRE-1α ER-tensão regulada possui uma função essencial no desenvolvimento da placenta e a viabilidade embrionária, destacando a relação de ER stress, e a angiogénese na placenta durante a gravidez [35]. Kim e colegas demonstraram que tanto a SHP-1 e SHP-2 são substratos endógenos para a calpaina, a qual está envolvida no contexto de Entamoeba histolytica
morte da célula hospedeira induzida por [36]. Notavelmente, calpains tornar-se ativo quando o cálcio intracelular ([Ca ^{2 +] i) a concentração é elevada; m-calpaína (calpaína II) requer [Ca 2 +] i numa gama mil imolar, mas as concentrações micromolares de [Ca 2 +] i são suficientes para a activação de calpaina μ-(calpaina I) [37 ], [38]. Demonstrou-se que um elevado nível de [Ca 2+] i dificulta a actividade da tirosina cinase da proteína como um resultado da activação de calpaina durante a estimulação por ionóforo em plaquetas [39]. Honokiol era capaz de induzir [Ca 2+] i mobilização de células neuronais [40]. Recentemente, tunicamicina foi relatado para inibir a angiogênese in vivo
. O nosso estudo anterior demonstrou que honokiol induz a apoptose de células de cancro gástrico humano e inibe a tumorigénese através de uma proteína de 94 clivagem regulada por glucose mediada por calpaina [16]. No presente estudo, nós diretamente demonstraram que o ER estavam dilatadas e fragmentado em células de câncer gástrico tratados com honokiol e HUVECs. Além disso, inibidor farmacológico da calpaína e calpaína-II siRNA transfecção efetivamente reduziu a atividade SHP-1-honokiol reforçada em células cancerosas gástricas e HUVECs. Notavelmente, os nossos resultados para o primeiro tempo demonstraram que a calpaína /SHP-1 interacção está directamente desencadeada por inibição honokiol de STAT-3 fosforilação em células de cancro gástrico. Estes resultados indicam que o stress pode induzir o honokiol ER e desencadear a calpaína-II-activado actividade SHP-1 em células de cancro gástrico e células endoteliais.}

Em conclusão, os resultados do presente estudo fornecem in vivo , ex vivo
e in vitro
evidência de inibição da angiogênese e disseminação peritoneal de células cancerosas gástricas por honokiol e uma base molecular para os seus efeitos. Esses dados enfatizam o envolvimento da calpaína ER e proteína tirosina fosfatase SHP-1 sinalização em STAT-3 e a activação de VEGF produção honokiol inibida em células de cancro gástrico e células endoteliais (Fig. 13). Estas descobertas também sugerem que a regulação de STAT-3 e VEGF sinalização induzida por calpaína /SHP-1 pode ser uma estratégia terapêutica promissora para o tratamento do câncer gástrico.

Materiais e Métodos

Células e Cultura

linhas Humanos gástricas celulares de cancro, incluindo uma linha celular Caucasiano (AGS), células de adenocarcinoma diferenciadas moderadamente /mal (mistos) e linhas celulares asiáticos (MKN45 e SCM-1, células de adenocarcinoma indiferenciadas) foram obtidos a partir da banco de células de Taipei Veterans general Hospital (Taiwan). As células foram mantidas em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS e estreptomicina /penicilina numa atmosfera humidificada de 5% de CO _{2 atmosfera.}

HUVECs foram obtidos a partir de veias de cordão umbilical por tratamento de colagenase tal como descrito anteriormente [41]. Este estudo está em conformidade com os princípios para a utilização de tecidos humanos descritos na Declaração de Helsinki. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Review Board of Taichung Veterans General Hospital, Taichung, Taiwan (documento aprovado TCVGH-C0062-1). As HUVECs foram usadas na terceira passagem. A eficiência de transfecção (> 80%) por reagente de Lipofectin (Invitrogen) foi determinada na terceira passagem. Em algumas experiências, SV-40 imortalizadas microvascular rato células endoteliais (SVECs) cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina /estreptomicina. linha de células SVEC foi gentilmente oferecida por Dr. KH Lan (Cancer Center, Taipei Veterans General Hospital, Taiwan).

Honokiol foi obtido a partir de Wako Chemical Company (Osaka, Japão), e foi determinada a ser, pelo menos, 99% puro por HPLC. Diferentes concentrações de honokiol foram utilizados neste estudo, dependendo da sensibilidade ao fármaco indicado pelos valores de IC50 (20 uM em AGS, 40 uM em MKN45 e SCM-1). células AGS MKN45 e células SCM-1, mas não, têm sido mostrados para induzir eficazmente tumores em um modelo de rato tumor xenoenxerto.

Animais

Todos os cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram aprovados e conduzida por Comitê de Experimentação animal da Universidade Nacional Chung Hsing, Taichung, Taiwan (documento aprovado NCHU-100-26). macho com quatro a seis semanas de idade, ratinhos BALB /c nus foram adquiridos a NLAC (Taipei, Taiwan). Os ratos foram criados e mantidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos, desde que com comida esterilizada e água ad libitum
e alojados em uma instalação de barreira com um 12 h ciclo de luz /escuridão.

Tumor Xenoenxerto Modelo do rato

Para avaliar a metástase peritoneal, células gástricas cancerosas humanas cultivadas (4~5 × 10 ^{6 células) foram inoculados na cavidade peritoneal de ratinhos Balb /c nus [42]. tumores peritoneais em ratinhos nus foram estabelecidas durante 7 dias após a injecção de células de cancro gástrico, no qual os tumores foram verificados por vigilância de PET /CT. Em seguida, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com honokiol (5 mg /kg /duas vezes por semana) durante 28 dias. O efeito da honokiol na disseminação peritoneal foi avaliada por PET /CT. Uma declaração /imagem da situação metástase foi descrito na Figura 1. Em seguida, os ratos foram sacrificados, sob anestesia (pentobarbital) e examinados macroscopicamente quanto à presença de metástases peritoneais. Os tumores foram excisadas, cortado em blocos, fixados em formol a 10%, e incluídos em blocos de parafina ou congelados instantaneamente em azoto líquido.}

Positron Emission Tomography /tomografia computadorizada (PET /CT) Scanning

Depois de pelo menos 6 horas de jejum, os ratos receberam uma média de 7,4 MBq (0,2 mCi) dose de ^{18F-FDG por via oral antes de uma lavagem com 1 ml de água. Os ratinhos foram anestesiados com isoflurano antes de um vaporizador de cada varrimento. Experimentos para geração de imagens de pequenos animais foram realizados com um scanner combinado PET /CT (Discovery ST; GE Medical Systems). Foi utilizado um aparelho de tomografia computadorizada helicoidal linha multidetectores. parâmetros técnicos utilizados na porção CT de PET /CT foram os seguintes: Tipo de tomografia computadorizada com um 0.5-segunda verificação completa helicoidal, uma configuração de linha detector de 16 × 1,25 mm, um espaço de intervalo de 2,75 mm, uma espessura de corte de 1,25 mm , um passo de 1.75:1 (modo de alta qualidade), a uma velocidade de 17,5 mm por rotação, um grande campo de visão (FOV), a tensão de 120 kVp e corrente de 200 mA. Os parâmetros técnicos utilizados para a porção de PET PET /CT foram como se segue: 10,0 minutos em cada leito, o FOV escolhido para a reconstrução de imagem foi de 20 cm e a resolução de PET era cerca de 4,5 mm largura total a meia altura (FWHM). Os parâmetros de reconstrução foram do tipo iteração 3D como 21 subconjuntos e 2 iterações. Para avaliar a capacidade quantificação do scanner de PET /TC na imagiologia de pequenos animais, uma região de interesse (ROI) foi colocada em pequenas imagens PET transaxial FOV para cercar completamente as zonas de captação de FDG nos tecidos observados, evitando os tecidos circundantes. A média do valor de actividade de cada pixel dentro de cada ROI foi gravado e expressa como Bq /ml.}

Chick Corioalantóide Membrane Assay ( CAM
Assay)

Para investigar o in vivo
atividade angiogênica, um animal completo pintainho modificado CAM
ensaio foi realizado como descrito anteriormente [43]. ovos de galinha fertilizados foram incubadas em um criador ovo continuamente humidificado a 37 ° C. Aos 3 dias de incubação, os embriões de pinto foram transferidos para um prato de cultura. Vinte mL de honokiol aprisionado em colagénio do tipo I mistura foi aplicada sobre discos de revestimento e polimerizado por aquecimento. Os discos foram carregados no
CAM de embriões com 6 dias de idade. Após 24 h de incubação, a área em torno do disco carregado foi fotografada com uma câmara digital Nikon, e o número de vasos recém-formados foi contado por dois observadores de uma forma duplamente cega. Os ensaios para cada amostra de teste foram realizadas utilizando 10-13 ovos.

Matrigel plug Ensaio

ratinhos nus ou ratinhos C57BL /6 foram injectados subcutaneamente com 0,6 ml de Matrigel contendo a quantidade indicada de capsaicina , 100 ng de VEGF, e 10 unidades de heparina. O matrigel injetado formada rapidamente uma única camada de gel sólido. Depois de 7-21 dias, a pele do murganho foi facilmente puxado para trás para expor a ficha de matrigel, que permaneceu intacto. A hemoglobina foi medida usando o método de Drabkin e um kit de reagente de Drabkin 525 (Sigma, St Louis, MO) para a quantificação da formação de vasos sanguíneos. A concentração da hemoglobina foi calculada a partir de uma quantidade conhecida de hemoglobina ensaiados em paralelo. As imagens foram fotografadas com uma câmera digital Nikon, bem como o número de micro-vasos recém-formados foi contado.

Ex Vivo
aórtica Anel Ensaio

aortas foram isolados a partir de 6 -week de idade ratos Sprague-Dawley. As placas (48 poços) foram revestidas com 120 uL de Matrigel. Aortas isoladas de ratos foram limpos de gordura e tecidos conjuntivos periadventiciais, e cortado em ~ 1-mm de comprimento para anéis de 1,5 mm de comprimento. Depois de ser lavado cinco vezes com meio à base de células endoteliais, as aortas foram colocados nos poços cobertos de matrigel e coberto com mais 100 mL de matrigel. Honokiol ou veículo foram adicionados aos poços num volume final de 250 ul de meio.

• PLOS ONE: Relação entre negativo e positivo linfonodos se adequada para avaliação do prognóstico dos pacientes com câncer gástrico com positivos metástase
• PLOS ONE: Alta γ-Radiação A sensibilidade está associada ao aumento do risco de câncer gástrico em um chinês Han População: A Case-Control Análise