PLoS ONE: Calpain /SHP-1 Interactie door Honokiol Dampening peritoneale Verspreiding van maagkanker in nu /nu Mice

De abstracte

Achtergrond

Honokiol, een klein-moleculair gewicht natuurlijk product, heeft hiervoor vermeld apoptose te activeren en remt tumorigenese maag. Of honokiol de angiogenese en metastase van maagkanker cellen remt blijft onbekend.

Methodologie /voornaamste bevindingen

We testten de effecten van honokiol op angiogene activiteit en peritoneale verspreiding gebruik In vivo, ex vivo Kopen en in vitro
testsystemen. De signalering reacties in menselijke maagkanker cellen, humane navelstreng vasculaire endotheelcellen (HUVEC) en geïsoleerde tumoren gedetecteerd en geanalyseerd. In een xenograft muismodel maagtumor, honokiol remde de peritoneale verspreiding gedetecteerd door PET /CT techniek. Honokiol ook effectief verzwakt het gedetecteerd door chick chorioallantoïsmembraan assay, muis Matrigel plug-test, rat aorta-ring van endotheelcellen kiemen assay, en endotheelcellen buis vorming assay angiogenese. Bovendien honokiol effectief verbeterd signaal transducer en activator van transcriptie (STAT-3) defosforylering en remde STAT-3 DNA bindingsactiviteit in humane maagkanker cellen en HUVEC, die werd gecorreleerd met de up-regulatie van de activiteit en eiwitexpressie van Src homologie 2 (SH2) bevattende tyrosine fosfatase-1 (SHP-1). Calpaïne-II-remmer en siRNA transfectie significant omgekeerd de honokiol geïnduceerde SHP-1 activiteit. De verminderde STAT-3 fosforylering en verhoogde SHP-1 expressie werd ook aangetoond in geïsoleerde peritoneale metastatische tumoren. Honokiol was ook in staat tot het remmen van VEGF-generatie, die zouden kunnen worden omgekeerd door SHP-1 siRNA transfectie.

Conclusies /Belang

Honokiol verhoogt de expressie en activiteit van SPH-1, die verder deactiveert STAT3 route. Deze bevindingen suggereren ook dat honokiol is een nieuwe en krachtige remmer van angiogenese en peritoneale verspreiding van maagkanker cellen, het verstrekken van steun voor de toepassingsmogelijkheden van honokiol bij maagkanker therapie

Visum:. Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et al. (2012) Calpain /SHP-1 Interactie door Honokiol Dampening peritoneale Verspreiding van maagkanker in de nu /nu
Muizen. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10.1371 /journal.pone.0043711

Editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Duitsland

Ontvangen: 17 januari 2012; Aanvaard: 24 juli 2012; Gepubliceerd: 24 augustus 2012

Copyright: © Liu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door onderzoek subsidies van Taichung Veterans General Hospital, Taiwan (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) en de National Science Raad van Taiwan (NSC99-2320-B-005-003-my3). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

De meerderheid van de patiënten (-60%) met maagkanker zijn gediagnosticeerd met de late stadium van de ziekte. Maagkanker is de tweede meest voorkomende oorzaak van de opwarming van kankersterfte in de ontwikkelde landen en vertoont gemetastaseerde ziekte op het moment van de diagnose [1]. Chirurgie en de combinatie chemokuren voor maagkanker is gebleken dat slechts een bescheiden overleven voordelen bieden in gevorderde gevallen, en bijna 50% van de patiënten nog steeds sterven na herhaling [2], [3]. Een belangrijke vorm van herhaling is peritoneale verspreiding. groei van kanker en peritoneale metastase angiogeneseafhankelijke, een proces dat verschillende angiogene factoren omvattende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), epidermale groeifactor (EGF), basic fibroblast growth factor, prostaglandine E2, interleukine-8, chemokine (CXC motief) ligand omvat 1, en de matrixmetalloproteïnase familie [4] - [6]. Verschillende moleculaire signalen, zoals signaal transducer en activator van transcriptie-3 (STAT-3), nuclear factor-eb, Akt, mitogeen geactiveerde eiwitkinasen, cyclooxygenase-2 lipoxygenase induceerbare stikstofoxide-synthase, tumornecrosefactor en anderen , is ook getoond te zijn betrokken bij tumorprogressie en angiogenese [7] - [9]. Echter, de cellulaire en moleculaire mechanismen van de ontwikkeling, progressie, en metastase van maagkanker moeten nog worden verduidelijkt.

De Janus-geactiveerde kinase (Jak) /STAT signaalweg speelt een belangrijke rol in de regulering van de celgroei, angiogenese, differentiatie, migratie en metastase [10]. Constitutieve activering van STAT pathways, vooral STAT-3 is geassocieerd met een breed scala van menselijke maligniteiten. Persistent STAT-3 fosforylering waargenomen bij verschillende menselijke kankers, zoals vaste tumoren van de maag, darm, lever, prostaat-, borst-, long- en hoofd- en nek en bloed maligniteiten [8], [10]. Eerdere studie heeft aangetoond dat fosforylatie van STAT-3 en VEGF eiwitexpressie zijn verhoogd bij humane maagkanker weefsel, wat op zijn beurt verhogen het angiogene fenotype en bijdragen aan maagsappen ontwikkeling en progressie van kanker [11]. Anderzijds worden bepaalde fosfatasen bekend tumor- suppressors en kan een belangrijke rol spelen bij de remming of bestrijding van kanker groei [12] spelen - [15]. Proteïnetyrosinefosfatasen (PTP's), met inbegrip van SH2-domein bevattende tyrosine fosfatase (SHP) -1 en SHP-2, kunnen negatief reguleren STAT signalering door de tyrosine defosforylering van diverse componenten in de gerelateerde signaalroutes [13] - [15] . De continue activering van STAT-3 in de tumoren kan worden gefaciliteerd ten minste gedeeltelijk door het verlies van functie van deze fosfatasen. Calpaïne II is aangetoond dat het een rol in het endoplasmatisch reticulum (ER) stress gereguleerd tumorigenese, dat betrokken is in het mechanisme van honokiol geremde maag tumorigenese [16] spelen. Bovendien heeft eerdere studie ook aan dat SHP-1 is een endogeen substraat voor calpaïne volgende A23187 geïnduceerde bloedplaatjesactivering [17]. Daarom is een calpaïne /SHP-1 gereguleerde STAT-3 en VEGF pathway betrokken kunnen zijn bij de angiogenese, groei en peritoneale verspreiding van maagkanker cellen.

Honokiol, een klein molecuulgewicht natuurproduct, is een belangrijke actieve biphenolic verbinding met de Magnolia officinalis
, waarvan bekend is dat microbiële infectie, ontsteking en gastro-intestinale stoornissen verbeteren in traditionele Aziatische geneesmiddelen systemen [18]. Onze eerdere studie toonde aan dat honokiol maag remt tumorigenese door activering van 15-lipoxygenase-1 en daaropvolgende remming van peroxisoom proliferator geactiveerde receptor-a en COX-2-afhankelijke signalen [19]. Honokiol is aangetoond dat ER stress veroorzaken en leiden calpaïne II-gemedieerde glucose-gereguleerd eiwit-splitsing 94 en apoptose in menselijke maagkanker cellen [16]. Het is aangetoond dat VEGF-expressie in reactie op nutriënten ontbering voorwaarden die ER stress [20], [21] oorzaak zijn. Bovendien heeft de ER stress activator tunicamycine bleken aanzienlijk voorkomen microvasculatuur ontwikkeling, wat suggereert dat deze ER stress inductor een mogelijke rol in borsttumor behandeling [21] kan hebben. De effecten van honokiol op ER stress gecorreleerde angiogenese en maag tumormetastase zijn nog onduidelijk. Hier veronderstelden we dat honokiol remt de angiogenese en peritoneale verspreiding van maagkanker cellen door een calpaïne /SHP-1-gereguleerde STAT-3 en VEGF pathway. De resultaten toonden aan dat honokiol sterk geremd angiogenese en peritoneale verspreiding van maagkanker cellen via een calpaïne /SHP-1-interactie geactiveerde STAT-3 defosforylering en VEGF downregulatie route.

Resultaten

Honokiol geblokkeerde Peritoneale metastase van maagkanker in vivo

Cancer wordt vaak gekenmerkt door de verhoogde opname van [ ^{18F] fluor-2-deoxy-D-glucose (FDG), en [ 18F] -FDG /PET kan dienen als een surrogaat maat voor therapeutische werkzaamheid. De functionele mogelijkheid van kleine dieren beeldvorming met behulp van een klinisch PET /CT-scanner met FDG werd geëvalueerd. Vier groepen muizen voor peritoneale metastase experimenten onderzocht. Een verklaring /beeld van de metastase situatie weergegeven in figuur 1. We gebruik gemaakt van [ 18F] -FDG-PET /CT voor peritoneale uitzaaiingen in muizen ingeënt met menselijke maagkanker cellen (MKN45 of SCM-1) met of zonder op te sporen honokiol behandeling. Zoals getoond in Figuur 2, werd de maximale intensiteit projectie gegenereerd typische vertegenwoordiger muizen. De peritoneale metastasen werd gekenmerkt in de controlemuizen (linker paneel), en het werd daadwerkelijk omgekeerd door de honokiol behandeld (rechter paneel). Deze beelden duidelijk aan dat invasieve [ 18F] -FDG uitlaten in peritoneale metastatische tumoren van controlemuizen waren veel hoger dan die in de honokiol-behandelde muizen. De kwantificering van de intensiteit wordt weergegeven in figuur 3A. Intraperitoneale injectie van honokiol (5 mg /kg, twee keer /week), significant de geschatte radioactiviteit telt en specifieke opname waarden (SUV) bepaald met FDG-PET /CT in muizen geïnoculeerd met maagkanker cellen (Fig. 3). Bovendien werden veel metastatische knobbeltjes in de peritoneale holte (mesenterium) van de controle muizen geïnoculeerd met MKN45 en SCM-1 (fig. 2) cellen. Daarentegen werden peritoneale tumoren sporadisch waargenomen in muizen behandeld met honokiol. Kwantificering van knobbeltjes per veld wordt weergegeven in figuur 3B.}

Honokiol geremd Angiogenese In vivo
, ex vivo
en In vitro

Endotheliale cellen zijn cruciaal voor het angiogene proces, dat nodig is voor tumorgroei en metastase is. Vervolgens onderzochten we de angiogene effect van honokiol met behulp van de chick chorion membraan test ( CAM
assay), Matrigel plug-test, ring aorta kiemen assay, en endotheelcellen buis formatie. Zoals getoond in figuur 4A, honokiol remt effectief de neo-vasculaire vorming in de
CAM assay zonder zichtbare invloed op de reeds bestaande bloedvaten. Kwantitatieve analyse toonde dat honokiol veroorzaakte een 2,5-voudige verlaging van het aantal nieuw gevormde bloedvaten vergeleken met die van mediumcontrole.

In de Matrigel plug assay matrigel bevattende VEGF (100 ng /ml gel) met of zonder honokiol (10 ug /ml) werd subcutaan geïmplanteerd in naakt muizen. Na 21 dagen implantatie werden de gevormde Matrigel pluggen uitgesneden en gefotografeerd. Stoppen met alleen VEGF aanmerkelijk buikspek, vasculaire en rood van kleur. Stoppen met VEGF en honokiol waren bleke, aangeeft dat er geen of minder bloedvatvorming (Fig. 4B-a). We onderzochten ook het schip dichtheid en vaatmorfologie in de stekker secties van H & E kleuring en immunohistochemische kleuring met een antilichaam tegen CD31, een endotheelcel merker. De vascularisatie in de honokiol + VEGF-groep was significant verminderd ten opzichte van de VEGF alleen groep (fig. 4B-b). Kwantificering van de vascularisatie door telling van het vaartuigen en gepresenteerd endotheelcellen bleek dat de vasculaire dichtheid in het honokiol-behandelde groep significant af (fig. 4B-C en 4B-d).

Vervolgens endotheelcellen werden geïnduceerd te ontspruiten uit de geïsoleerde rat aorta ringen in de aanwezigheid van matrigel en ECGM (endotheelcellen kweekmedium) bevattende angiogene cytokines, zoals VEGF en basische fibroblast groeifactor. Normale endotheelcellen uitgroei van rat aorta ring explantaten werd waargenomen in de controlegroep (Fig. 5A). Honokiol behandeling resulteerde in een significante (~five-voudig) afname van endotheliale uitgroei en ontspruiten uit aortaringen (fig. 5A en 5C). Bovendien is de morfologische differentiatie van endotheelcellen vaatvorming werd onderzocht onder toepassing van een tweedimensionale methode Matrigel. Zoals getoond in figuur 5B, het zaaien van HUVEC's in Matrigel tot vasculaire buisvormige structuur vormen. Honokiol remt effectief de endotheelcellen vaatvorming doordat de buisvormige structuur in lengte en breedte (fig. 5B en 5D).

Honokiol Abolished STAT-3 Signalering in Human Gastric Cancer Cells, HUVEC en Tumoren

Eerdere studies hebben aangetoond een sterke correlatie tussen geactiveerd STAT-3 en angiogene fenotype [11]. Verder hebben we het effect van honokiol de fosforylatie van STAT-3 in humane cellen maagkanker (MKN45 en AGS) en HUVEC toegelicht. Zoals getoond in figuur 6, honokiol verminderde het tyrosine (Tyr705) fosforylatie van STAT-3 in een tijdsafhankelijke wijze met ongeveer een tweevoudige afname in 1-2 uur in AGS cellen (Fig. 6A) en een 3- tot 10- voudige afname van 0,5-24 h in MKN45 cellen (Fig. 6B). Verrassenderwijs honokiol geïnduceerde STAT-3 defosforylering van Tyr705, maar niet Ser727, residuen in deze menselijke maagkanker cellen. Echter, honokiol gelijktijdig remde zowel Tyr705 en Ser727 fosforylatie van STAT-3 in HUVEC (fig. 6C). Kwantitatieve analyse van de eiwitbanden in de Western blot met behulp Image-Pro Plus software is getoond in figuur 7. De resultaten van de analyse met confocale microscoop bleek ook dat honokiol schafte de tyrosine (Tyr705) fosforylatie van STAT-3 in AGS cellen en HUVECs (Fig . 8A).

We voorts onderzocht STAT-3 fosforylatie in peritoneale metastatische tumoren geïsoleerd uit naakt muizen geïnoculeerd met MKN45 cellen met of zonder honokiol (5 mg /kg) behandeling. Immunohistochemische analyse toonde aan dat p-STAT-3 overexpressie en accumulatie in de tumor regio, waaronder kernen en cytoplasma significant omgekeerd door honokiol behandeling (Fig. 8B). In Western blot analyse honokiol duidelijk verminderd de ophoping van p-STAT3 in tumoren in vergelijking met dragercontrole (Fig. 9A). De expressie van constitutieve STAT3 werd niet beïnvloed. Bovendien werd de DNA bindingsactiviteit van STAT-3 verder bevestigd middels EMSA. Zoals getoond in figuur 9B, honokiol aanzienlijk remde de verhoogde DNA bindingsactiviteit van STAT-3 in menselijke maagkanker cellen. Honokiol remde ook toegenomen VEGF-STAT-3 DNA bindingsactiviteit in HUVEC (fig. 9B).

Honokiol geïnduceerde SHP-1 gereguleerde STAT-3 Defosforylering bij maagkanker cellen, endotheelcellen, en Tumoren

SHP-1 is een niet-transmembraan PTP [12]. We volgende onderzocht of honokiol de expressie en activiteit van SHP-1 kan reguleren. Zoals getoond in figuur 10A, honokiol verhoogde de eiwitexpressie van SHP-1, maar niet SHP-2, in HUVEC en AGS cellen op een tijdsafhankelijke wijze. Farmacologische PTP inhibitor en SHP-1 siRNA transfectie effectief afgeschaft honokiol-geïnduceerde STAT-3 defosforylering in HUVECs en AGS cellen (Fig. 10B-a). Vergelijkbare resultaten in SCM-1 cellen en SV-40 onsterfelijk gemaakte muizen microvasculaire endotheelcellen (SVECs) behandeld met honokiol worden getoond in Figuur 10B-b. We volgende onderzocht of endogene SHP-1 wordt gemoduleerd door honokiol. Honokiol kon roepen de SHP-1 activiteit in maagkanker cellen, HUVECs en SVECs in een tijd-afhankelijke wijze (Fig. 11A). Honokiol verbeterde ook SHP-1 eiwitexpressie in peritoneale metastatische tumoren geïsoleerd uit MKN45-geïnoculeerde muizen onthuld door immunohistochemische analyse (Fig. 11B). Verder hebben we onderzochten de interactie tussen SHP-1 en STAT-3 met de methoden van co-immunoprecipitatie en Western blotting. Zoals getoond in figuur 11C, werd SHP-1 specifiek aan STAT-3 in AGS cellen en HUVEC in de aanwezigheid van honokiol vergelijking met IgG controle.

Honokiol Altered ER morfologie geïnduceerd calpaïne II-gereguleerde SHP -1 geïnduceerde STAT-3 Defosforylering en verminderde VEGF Generation

Eerdere studies hebben gesuggereerd dat ER stress een belangrijke rol in angiogenese [20] bereikt, [21]. We vervolgens onderzocht het effect van honokiol op ER microstructuur door transmissie elektronenmicroscopie. Zoals getoond in figuur 12A, werden ER dilatatie en fragmentatie vertoonden in honokiol behandelde SCM-1 maagkanker cellen en HUVEC.

Ook wilden we bepalen of calpaïne II-activering vereist SHP-1 activiteit in honokiol behandelde cellen. Farmacologische calpaïne inhibitor en calpaïne II-siRNA transfectie effectief gereduceerd-honokiol versterkte SHP-1 activiteit in AGS cellen en HUVEC (Fig. 12B). Cellen behandeld met recombinant calpaïne-II, als een positieve controle, toonde een 4-5-voudige toename van SHP-1-activiteit (Fig. 12B). VEGF is bekend dat de STAT-3 promoter bindingsplaats bevatten. We volgende onderzocht of honokiol VEGF expressie kan reguleren. Honokiol verminderde de VEGF generatie AGS cellen en HUVECs, en dit effect werd omgekeerd door SHP-1 siRNA transfectie (fig. 12C). Bovendien transfectie van mutant-STAT-3 plasmide in cellen remden eveneens de VEGF generatie. De combinatie van honokiol met mutant-STAT-3 plasmide transfectie in cellen verminderde synergistisch de VEGF-productie in vergelijking met de behandelingen afzonderlijk (fig. 12C). De interactie tussen calpaïne-II en SHP-1 verder te bevestigen, co-immunoprecipitatie en Western blotting werd uitgevoerd bij maagkanker cellen. Zoals getoond in Figuur 12D, werd calpaïne II-specifiek aan SHP-1 in AGS-cellen in aanwezigheid van honokiol (20 uM) vergeleken met controle IgG. Op dezelfde manier werd de honokiol geïnduceerde calpaïne /SHP-1 interactie ook gevonden in HUVEC's (gegevens niet getoond).

Discussie

Honokiol is een belangrijk onderdeel van de Magnolia officinalis
, een overgangs- geneesmiddel in Azië [18]. Honokiol bezit anti-oxidatieve en anti-inflammatoire effecten In vitro Kopen en In vivo
[22] - [25]. Honokiol is aangetoond dat krachtige anti-proliferatieve activiteit vertonen tegen endotheelcellen in vitro Kopen en antitumorale effecten tegen angiosarcoma in naakt muizen [26]. In deze studie hebben we aangetoond voor de eerste keer dat honokiol is een krachtige remmer van angiogenese en metastase peritoneale maagkanker. Ons onderzoek heeft zich gericht op de effecten en de mogelijke mechanismen van honokiol op peritoneale metastasering en angiogenese met behulp van PET /CT, CAM
assay, Matrigel plug-test, aorta-ring van endotheelcellen kiemen assay, endotheelcellen buis vorming assay, en in vitro
cel experimenten. De resultaten toonden aan dat honokiol angiogenese en peritoneale verspreiding kan onderdrukken door een calpaïne-II-geactiveerde SHP-1 activering signaalcascade. Activatie van fosfatase SHP-1 door honokiol verder geleid tot de neerwaartse regulatie van STAT-3 activatie en VEGF productie, wat resulteert in de inhibitie van angiogenese en peritoneale metastasen. Echter, de remming van angiogenese en inhibitie van metastatisch potentieel van kankercellen door honokiol als afzonderlijke aspecten, waarvan een een effect honokiol angiogenese rechtstreeks en ander effect van honokiol op kankercellen.

In de afgelopen jaren een aantal studies hebben aangetoond dat constitutieve activatie van de STAT familie, vooral STAT-3 is geassocieerd met celproliferatie, angiogenese en metastase [10], [11], [27] - [30]. Verhoogde activering van STAT-3-expressie werd gevonden in verschillende tumor afgeleide cellen en monsters van menselijke kanker weefsels. Gedereguleerd STAT-3 activatie is gesuggereerd dat een belangrijke rol speelt overexpressie van VEGF en verhoogde angiogene fenotypen bij maagkanker, die kan bijdragen tot maag ontwikkeling en progressie van kanker [11]. In deze studie bleek dat honokiol effectief de fosforylatie van STAT-3 in HUVECs (zowel Tyr705 en Serine727 sites), menselijke maagkanker cellen (Tyr705 plaatse), peritoneale en metastatische tumoren (Tyr705 plaatse) kan remmen. Aangezien de oncogene activatie van tyrosinekinasen is een gemeenschappelijk kenmerk van kanker, hebben we ons gericht op de rol van Tyr705 fosforylatie van STAT-3.

SHP-1 bezit een potentiële tumor suppressor functie en is een negatieve regulator van de JAK /STAT signaalweg [15]. Ook is gebleken dat SHP-1 fosfatase kan binden aan de gefosforyleerde Y1173 domein, wat leidt tot defosforylering EGFR [31]. Y429 in het cytoplasmatische domein van de erytropoëtine-receptor is voorgesteld om de bindingsplaats voor eiwittyrosinefosfatase SH-PTP1, die een belangrijke rol spelen bij beëindiging proliferatieve signalen [32] zijn. SHP-1 is ook aangetoond dat een antagonist van groeifactor signaaltransductie in epitheliale en hematopoietische cellen [15] zijn. SHP-1 werd bijzonder benadrukt als een mogelijke fysiologische antagonist van VEGFR signalering [33]. In endotheelcellen wordt SHP-1 fysiek gekoppeld aan VEGFR2 en is ook vereist voor zowel TNFa gemedieerde en weefsel-inhibitor van metalloproteïnasen (TIMP) gemedieerde remming van angiogenese [31]. Aldus kan SHP-1 activering belangrijke consequenties voor de regulering van celproliferatie en angiogenese. In deze studie hebben we vastgesteld dat honokiol specifiek verhoogde de expressie van SHP-1, maar niet SHP-2, bij maagkanker cellen, endotheelcellen en peritoneale metastatische tumoren. Deze bevindingen suggereren dat honokiol endotheelcellen en angiogenese van kankercellen metastase, eventueel via een SHP-1 geïnduceerde STAT-3 downregulatie enzym kan remmen.

Eerdere studies hebben een belangrijke rol in ER stress voorgestelde het moleculaire mechanisme van angiogenese en de groei van kankercellen [16], [20], [21]. Koyama en collega's hebben ook gesuggereerd dat ER stress geïnduceerde calcium verstoring betrokken kan zijn bij de inductie van amyloïd β accumulatie en angiogene factor expressie in het retinale pigmentepitheel [34]. Een recente studie heeft aangetoond dat ER stress-gereguleerde IRE-1α signalering bezit een essentiële functie in de ontwikkeling van de placenta en embryonale levensvatbaarheid, aandacht voor de verhouding van ER stress, en angiogenese in de placenta tijdens zwangerschap [35]. Kim en collega's hebben aangetoond dat zowel SHP-1 en SHP-2 endogeen substraten voor calpaïne, dat betrokken is in de context van Entamoeba histolytica
geïnduceerde gastheer celdood [36]. Met name calpains worden actief wanneer de intracellulaire calcium ([Ca ^{2 +] i) de concentratie verhoogd is; m-calpaïne (calpaïne II) is [Ca 2,] i op een millimolair bereik, maar micromolaire concentraties van [Ca 2,] zijn voldoende voor het activeren van μ-calpaïne (calpaïne I) [37 ], [38]. Het is aangetoond dat een hoog niveau van [Ca 2,] belemmert proteïne tyrosine kinase activiteit als gevolg van calpaïne-activatie tijdens stimulatie door ionofoor in bloedplaatjes [39]. Honokiol kon induceren [Ca 2+] i mobilisatie in neuronale cellen [40]. Recent is gerapporteerd tunicamycine angiogenese In vivo
remmen. Onze eerdere studie is gebleken dat honokiol induceert menselijke maagkanker cel apoptose en remt tumorigenese door een calpaïne-gemedieerde glucose-gereguleerd eiwit-splitsing 94 [16]. In de onderhavige studie hebben we aangetoond dat de rechtlijnig ER werden verwijd en gefragmenteerd in-honokiol behandelde maagkanker cellen en HUVEC. Bovendien farmacologische remmer van calpaïne en calpaïne II-siRNA transfectie effectief gereduceerd-honokiol versterkte SHP-1 activiteit in maagkanker cellen en HUVEC. Met name onze resultaten voor de eerste keer aangetoond dat calpaïne /SHP-1 interactie direct wordt geactiveerd door honokiol inhibitie van STAT-3 fosforylering bij maagkanker cellen. Deze resultaten geven aan dat honokiol ER stress kunnen veroorzaken en leiden tot de calpaïne-II-geactiveerde SHP-1 activiteit in maagkanker en endotheelcellen.}

Concluderend, de resultaten van de huidige studie geven In vivo , ex vivo Kopen en in vitro
bewijs voor de remming van angiogenese en peritoneale verspreiding van maagkanker cellen door honokiol en een moleculaire basis voor de gevolgen ervan. Deze gegevens wijzen op de betrokkenheid van ER calpaïne en eiwit tyrosine fosfatase SHP-1 signalering in honokiol geïnhibeerde STAT-3 activatie en VEGF productie in maagkanker en endotheelcellen (Fig. 13). Deze bevindingen suggereren ook dat de down-regulatie van STAT-3 en VEGF signalering geïnduceerd door calpaïne /SHP-1 kan een veelbelovende therapeutische strategie voor de behandeling van maag- kanker.

Materialen en methoden

Cells en cultuur

Human maagkanker cellijnen waaronder een blanke cellijn (AGS, matig /slecht (gemengde) gedifferentieerd adenocarcinoom cellen) en Aziatische cellijnen (MKN45 en SCM-1, ongedifferentieerde adenocarcinoom cellen) werden verkregen van de celbank van Taipei Veterans General Hospital (Taiwan). De cellen werden gehandhaafd in RPMI1640 medium dat 10% FCS en streptomycine /penicilline in een bevochtigde 5% CO _{2 atmosfeer.}

HUVEC's werden uit navelstreng aders verkregen door collagenase behandeling zoals eerder beschreven [41]. Deze studie voldoet aan de principes voor het gebruik van menselijke weefsels geschetst in de Verklaring van Helsinki. De studie protocol werd goedgekeurd door de Ethische Review Board van Taichung Veterans General Hospital, Taichung, Taiwan (goedgekeurd document TCVGH-C0062-1). HUVECs bij de derde doorgang gebruikt. De efficiëntie van transfectie (> 80%) van Lipofectine reagens (Invitrogen) werd bepaald bij de derde passage. In sommige experimenten SV-40 onsterfelijk gemaakte muizen microvasculaire endotheelcellen (SVECs) gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline /streptomycine. SVEC cellijn werd vriendelijk geschonken door Dr. KH Lan (Cancer Center, Taipei Veterans General Hospital, Taiwan).

Honokiol werd verkregen van Wako Chemical Company (Osaka, Japan), en het was vastbesloten om op zijn minst 99% zuiver volgens HPLC. Verschillende concentraties honokiol werden bij dit onderzoek afhankelijk van de gevoeligheid drug aangeduid met IC50-waarden (20 uM in AGS, 40 uM in MKN45 en SCM-1). MKN45 en SCM-1-cellen, maar niet AGS cellen, is aangetoond dat ze effectief tumoren induceren in een tumor xenograft muismodel.

Dieren

Alle dierverzorging en experimentele procedures waren goedgekeurd en uitgevoerd door het Comité voor dierproeven, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan (goedgekeurd document Nchu-100-26). Vier tot zes weken oude mannelijke BALB /c naakt muizen werden gekocht van NLAC (Taipei, Taiwan). De muizen werden gefokt en onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden onderhouden, voorzien van gesteriliseerd voedsel en water ad libitum
en is gehuisvest in een barrière faciliteit met een 12 uur licht /donker-cyclus.

Xenograft Tumor muismodel

de peritoneale metastasen evalueren gekweekte menselijke maagkanker cellen (4~5 x 10 ^{6 cellen) werden geënt in de peritoneale holte van BALB /c naakt muizen [42]. Peritoneale tumoren in naakt muizen werden vastgesteld voor 7 dagen na de injectie van maagkanker cellen, waarbij de tumoren werden gecontroleerd door PET /CT surveillance. Daarna werden de muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met honokiol (5 mg /kg /tweemaal per week) gedurende 28 dagen. Het effect van honokiol peritoneale verspreiding werd geëvalueerd door PET /CT. Opgave /beeld van de metastase situatie is beschreven in figuur 1. Vervolgens werden de muizen onder narcose (pentobarbital) opgeofferd en onderzocht macroscopisch op de aanwezigheid van peritoneale metastasen. De tumoren werden uitgesneden, gesneden in blokken, in 10% formaline gefixeerd en ingebed in paraffine blokken en snel bevroren in vloeibare stikstof.}

positronemissietomografie /Computed Tomography (PET /CT) Scanning

Na tenminste 6 uur vasten werden de muizen een 7,4 MBq (0,2 mCi) dosis ^{18F-FDG oraal vóór spoelen met 1 ml water. De muizen werden geanesthetiseerd met isofluraan vaporizer voor elke scan. Experimenten voor beeldvorming van kleine proefdieren werden uitgevoerd met een gecombineerde PET /CT-scanner (Discovery ST; GE Medical Systems). Een multidetector rij spiraalvormige CT-scanner werd gebruikt. Technische parameters voor de CT gedeelte van PET /CT waren als volgt: CT-scan type met een 0,5-tweede volledige helical scan, een detectorrij configuratie van 16 x 1,25 mm, een interval ruimte van 2,75 mm, een plakdikte van 1,25 mm , een pitch van 1.75:1 (hoge kwaliteit modus), een snelheid van 17,5 mm per omwenteling, een groot veld-of-view (FOV), spanning van 120 kVP en stroom van 200 mA. Technische parameters voor de PET gedeelte van PET /CT is als volgt: 10,0 min in elk bed, het ZV gekozen beeldvorming reconstructie was 20 cm en de resolutie PET was ongeveer 4,5 mm breedte op halve hoogte (FWHM). De reconstructieve parameters waren soort 3D-iteratie als 21 subsets en 2 iteraties. De kwantificering vermogen van de PET /CT scanner beeldvorming van kleine proefdieren te evalueren, een van belang (ROI) werd op kleine FOV transaxiaal PET beelden volledig omringen het gebied van FDG opname in de waargenomen weefsels met vermijding nabijgelegen weefsels. Het gemiddelde van elke pixel's activiteiten binnen elk ROI werd opgenomen en uitgedrukt in Bq /ml.}

Chick chorioallantoïsmembraan Assay ( CAM
Assay)

Om de onderzoeken in vivo
angiogene activiteit, een gemodificeerde chick hele dier cAM
test werd uitgevoerd zoals eerder [43] beschreven. Bevruchte chick eieren werden geïncubeerd in een bevochtigde continu ei fokker bij 37 ° C. Op 3 dagen incuberen werden kippenembryo's overgebracht naar een kweekschaal. Twintig pl honokiol ingevangen in type I collageen werd aangebracht op bekleding schijven en gepolymeriseerd door verwarming. De schijven werden geladen op de CAM
van 6 dagen oude embryo's. Na 24 uur incubatie werd het gebied rond de geladen schijf gefotografeerd met een Nikon digitale camera en het aantal nieuw gevormde vaten werd geteld door twee waarnemers in een dubbelblinde wijze. Assays voor elk testmonster werden uitgevoerd met 10-13 eieren.

Matrigel plug Assay

Naakt muizen en C57BL /6 muizen werden subcutaan geïnjecteerd met 0,6 ml Matrigel met de opgegeven hoeveelheid capsaïcine , 100 ng VEGF en 10 eenheden heparine. De geïnjecteerde matrigel snel vormden een enkele, vaste gel stekker. Na 7-21 dagen werd de huid van de muis eenvoudig teruggetrokken naar de Matrigel plug, die intact bleef bloot. Hemoglobine werd gemeten met de Drabkin werkwijze en Drabkin reagenskit 525 (Sigma, St. Louis, MO) voor de kwantificering van bloedvatvorming. De concentratie van hemoglobine werd berekend uit een bekende hoeveelheid hemoglobine parallel getest. De beelden werden gefotografeerd met een Nikon digitale camera, en het aantal nieuw gevormde micro-schepen werd geteld.

Ex Vivo
Aorta Ring Assay

aorta's werden geïsoleerd uit 6 -week-oude Sprague-Dawley ratten. Platen (48 putjes) werden bekleed met 120 pi Matrigel. Aorta geïsoleerd uit muizen ontdaan van periadventitial vet en bindweefsel en tot -1 mm lang 1,5 mm lang ringen gesneden. Na vijfmaal met endotheliale cellen gebaseerde medium gespoeld, werden de aorta op de Matrigel-bedekte putjes geplaatst en bedekt met een 100 pl Matrigel. Honokiol of drager werd in een eindvolume van 250 ul van medium aan de putjes toegevoegd.

• PLoS ONE: verhouding tussen negatieve en positieve lymfeklieren is geschikt voor de evaluatie van de prognose van patiënten met maagkanker met positieve Node metastase
• PLoS ONE: High γ-straling gevoeligheid is geassocieerd met een verhoogd risico maagkanker in een Chinese Han Bevolking: A Case-Control Analysis