PLoS One: Calpain /SHP-1 kölcsönhatás Honokiol nedvesítő peritoneális terjesztése gyomorrák nu /nu egerek

absztrakt

háttér

Honokiol, egy kis molekulatömegű természetes termék, már korábban leírták, hogy aktiválja az apoptózis és gátolják a gyomorsav tumorigenezis. Akár honokiol gátolja az angiogenezis és metasztázis gyomorrák sejtek továbbra is ismeretlen. Katalógusa

Módszertan /fő eredményei katalógusa

Megvizsgáltuk a hatását honokiol az angiogén aktivitás és a peritoneális terjesztése a in vivo, ex vivo katalógusa és in vitro katalógusa vizsgálati rendszerekben. A jelzési reakciók humán gyomorrák-sejtek, humán köldökzsinór vaszkuláris endoteliális sejtek (HUVEC), és izolált tumorok detektáltuk és analizáltuk. Xenograft gyomor tumor egérmodellben honokiol jelentősen gátolta a peritoneális terjesztése által észlelt PET /CT technika. Honokiol is hatékonyan csökkentette a angiogenezis által észlelt csirke chorioallantois membrán vizsgálat, egér matrigel dugó vizsgálatban patkány aorta gyűrű endotél sejtek csírázás vizsgálat, illetve az endothel csőképződésre vizsgálatban. Továbbá honokiol hatékonyan elősegíti jelátvivő és transzkripciós aktivátor (STAT-3) defoszforiláció és gátolták a STAT-3 DNS-kötő aktivitást humán gyomor rákos sejteket, és HUVEC, mely korrelált a up-reguláció a tevékenység és a fehérje expresszióját az Src homológia 2 (SH2) -tartalmú tirozin-foszfatáz-1 (SHP-1). Calpain-II inhibitor és siRNS transzfekció jelentősen megfordította a honokiol indukált SHP-1 aktivitását. A csökkent STAT-3 foszforiláció és fokozott SHP-1 expresszió is látható izolált peritoneális metasztatikus tumorok. Honokiol is képes volt gátolni a VEGF termelés, amely visszafordítható SHP-1 siRNS transzfekció. Katalógusa

Következtetések /Jelentés katalógusa

Honokiol növeli expressziója és aktivitása az SPH-1 további deaktiválja STAT3 út. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy honokiol egy új és hatásos inhibitora az angiogenezis és a peritoneális terjesztése gyomorrák sejtek, támogatást nyújt az alkalmazás lehetőségeit honokiol gyomorrákban terápiában. Katalógusa

Citation: Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et al. (2012) Calpain /SHP-1 kölcsönhatás Honokiol nedvesítő peritoneális terjesztése gyomorrák nu /nu katalógusa Egerek. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10,1371 /journal.pone.0043711 katalógusa

Szerkesztő: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Németország katalógusa

Beérkezett: január 17, 2012; Elfogadva: július 24, 2012; Megjelent: augusztus 24, 2012 katalógusa

Copyright: © Liu et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott kutatási támogatást Taichung Veterans General Hospital, Tajvan (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) és a Nemzeti Tudományos Tanács Tajvan (NSC99-2320-B-005-003-MY3). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

A betegek többsége (~ 60%) a gyomorrák diagnosztizálnak késői stádiumú betegség. A gyomorrák a második leggyakoribb oka a globális rák okozta halálozás a fejlett országokban, és mutat a metasztatikus betegség, a diagnózis idején [1]. Sebészet és kombinált kemoterápiás gyomorrák kimutatták, hogy ruházza csak szerény túlélési előnyök az előrehaladott esetekben, és közel 50% -ánál még mindig meghalnak után kiújulás [2], [3]. A fő formája a kiújulás peritoneális terjesztését. A rák növekedését, és a peritoneális metasztázisok vannak angiogenezis függő, olyan eljárással, amely magában foglal számos angiogén faktorok, beleértve a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), az epidermális növekedési faktor (EGF), a bázikus fibroblaszt növekedési faktor, a prosztaglandin E2, interleukin-8, kemokin (CXC motívum) ligandum 1, és a mátrix metalloproteináz család [4] - [6]. Számos molekuláris jeleket, mint például a jelátvivő és transzkripciós aktivátor-3 (STAT-3), a nukleáris faktor-EB, Akt, mitogén-aktivált protein kinázok, a ciklooxigenáz-2, lipoxigenáz, az indukálható nitrogén-oxid-szintáz, a tumor nekrózis faktor és mások , azt is kimutatták, hogy részt vesz a tumor progresszióját és az angiogenezist [7] - [9]. Azonban a celluláris és molekuláris mechanizmusok fejlesztésének, progresszió és metasztázis gyomorrák kell még tisztázni. Katalógusa

A Janus-aktivált kináz (Jak) /STAT jelátviteli fontos szerepet játszik a szabályozás sejtnövekedés, angiogenezis, a differenciálódást, a migráció, és metasztázis. [10] Konstitutív aktiválása STAT utak, különösen STAT-3, a kapcsolódó sokféle humán rosszindulatú betegségekben. Állandó STAT-3 foszforiláció volt megfigyelhető különböző humán rákos megbetegedések, mint például a szilárd tumorok, a gyomor, vastagbél, máj, prosztata, emlő, tüdő, és a fej és a nyak, valamint a vér rosszindulatú betegségek [8], [10]. Korábbi tanulmány kimutatta, hogy a foszforiláció STAT-3 és a VEGF fehérje expressziója megnő a humán gyomorrák szövet, ami viszont emeli a angiogén fenotípus és hozzájárulnak a gyomorrák kifejlődésének és progressziójának [11]. Másrészt, egyes foszfatázok ismert, hogy tumor szupresszor és fontos szerepet játszanak a gátlását, illetve ellenőrzése rák növekedésének [12] - [15]. A protein tirozin foszfatázok (PTP-k), beleértve a SH2 domént tartalmazó tirozin-foszfatáz (SHP) -1 és az SHP-2, képesek negatívan szabályozzák STAT jelátvitel által a tirozin defoszforilációja több komponensből a kapcsolódó jelátviteli utak [13] - [15] . A folyamatos aktiválása a STAT-3 a tumorok lehet könnyíteni legalább részben funkciójának elvesztése ezek foszfatázok. A kalpain II kimutatták, hogy szerepet játszanak a endoplazmatikus retikulumban (ER) stressz-szabályozott tumorigenezis, amely részt vesz a mechanizmus a honokiol gátolt gyomor tumorigenezis [16]. Ezen túlmenően, a korábbi tanulmány azt is jelezte, hogy a SHP-1 egy endogén szubsztrátja kalpain következő A23187 által kiváltott vérlemezke-aktiváció [17]. Ezért a kalpain /SHP-1-szabályozott STAT-3 és a VEGF útvonal is be lehet vonni a angiogenezis, a növekedés, és a peritoneális terjesztése gyomor rákos sejteket.

Honokiol, egy kis molekulatömegű természetes termék, a egy fő aktív biphenolic vegyület Magnólia officinalis katalógusa, amelyről ismert, hogy enyhítsük a mikrobiális fertőzés, gyulladás és gasztrointesztinális rendellenességek hagyományos ázsiai gyógyászati ​​rendszerek [18]. A mi korábbi tanulmány kimutatta, hogy honokiol gátolja a gyomorsav tumorigenezis aktiválása által 15-lipoxigenáz-1 és ennek következtében gátolja a peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor-A és a COX-2-függő jelek [19]. Honokiol kimutatták, hogy indukálja az ER stressz és kiváltó kalpain-II-közvetített glükóz-szabályozott fehérje-94 hasítási és apoptózis humán gyomorrák-sejtek [16]. Bebizonyosodott, hogy a VEGF-expresszió lehet fogékony a tápanyag-megvonást feltételek okozó ER stressz [20], [21]. Ezen túlmenően, az ER stressz aktivátor tunikamicin azt találtuk, hogy jelentősen megakadályozzák mikroérrendszerben fejlődés, ami arra utal, hogy ez a ER stressz induktora lehet a potenciális szerepet emlő tumor kezelésére [21]. A hatások a honokiol ER stressz összefügg angiogenezis és a gyomor daganatos áttétek még nem tisztázott. Itt feltételeztük, hogy honokiol gátolja az angiogenezis és a peritoneális terjesztése gyomorrák sejtek egy calpain /SHP-1-szabályozott STAT-3 és a VEGF útvonal. Az eredmények azt mutatták, hogy honokiol jelentősen gátolta az angiogenezis és a peritoneális terjesztése gyomorrák sejtek keresztül calpain /SHP-1 kölcsönhatást aktivált STAT-3 defoszforilációjához és VEGF leszabályozza útvonal. Katalógusa

Eredmények katalógusa

Honokiol Blokkolt peritoneális Metastasis gyomorrák in vivo Matton

Cancer gyakran jellemzi a fokozott felvételét [ ^{18F] -fluor-2-dezoxi-D-glükóz (FDG), és [ 18F] -FDG /PET szolgálhat egy helyettesítő intézkedésnek a terápiás hatás. A funkcionális lehetősége kisállat képalkotás segítségével klinikai PET /CT FDG értékelték. Négy egércsoport peritoneális metasztázis kísérletekben vizsgáltuk. A kimutatás /képet a metasztázis helyzet az 1. ábra mutatja Mi hasznosított [ 18F] -FDG-PET /CT kimutatására peritoneális áttétek beoltott egerek humán gyomorrák sejtek (MKN45 vagy SCM-1) vagy anélkül honokiol kezelést. Amint a 2. ábrán látható, a maximális intenzitás vetítés keletkezett tipikus képviselője egerekben. A peritoneális metasztázis volt jelölve a kontroll egerekben (bal panel), és azt hatékonyan visszafordítható a honokiol kezelés (jobb panel). Ezek a képek világosan mutatták, hogy nem invazív [ 18F] -FDG felvételeket a peritoneális metasztatikus tumorok kontroll egerek jóval nagyobb volt, mint az honokiol-kezelt egerekben. Számszerűsítéséhez intenzitás ábrán látható a 3A. Intraperitoneális injekció honokiol (5 mg /kg, kétszer /heti) jelentősen csökkentette a becsült radioaktivitás számít, és specifikus felvétel értékek (SUV) által meghatározott FDG-PET /CT beoltott egerek gyomor rákos sejtek (ábra. 3). Ezenkívül számos metasztatikus gócok találtak a hasüregbe (bélfodor) a kontroll oltott egerek MKN45 és SCM-1 (ábra. 2) sejtek. Ezzel szemben, a peritoneális tumorcsomók észleltek szórványosan kezelt egerekben honokiol. Számszerűsítése csomók parcellánként ábrán látható a 3B. Katalógusa}

Honokiol Gátolt Az angiogenezis in vivo katalógusa, ex vivo katalógusa, és in vitro Matton

az endoteliális sejtek kritikusak az angiogén folyamatot, amely szükséges a tumor növekedését és a metasztázist. Mi a következő vizsgáltuk angiogén hatását honokiol a csirke chorioallantois membrán vizsgálat ( CAM katalógusa assay), matrigel dugó esszé, aorta gyűrű csírázás assay, illetve az endothel csőképződésre. Amint a 4A ábrán látható, honokiol hatékonyan gátolta a neo-vaszkuláris kialakulását a CAM
assay nélkül látható hatással a már meglévő ereket. Mennyiségi analízis kimutatta, hogy honokiol okozott 2,5-szeres számának csökkenése az újonnan képződött erek képest, hogy a közepes ellenőrzés.

a matrigel dugó esszé, Matrigel tartalmazó VEGF (100 ng /ml gél) a vagy anélkül honokiol (10 ng /ml) szubkután implantáltunk csupasz egerekben. 21 nap eltelte után az implantáció, a képződött Matrigel dugókat kivágtuk és lefényképeztük. Dugók a VEGF egyedül voltak feltűnően csíkos, érrendszeri és piros színű. Dugók tartalmazó VEGF és honokiol volt sápadt, jelezve, hogy nincs, vagy kisebb erek képződését (ábra. 4B-a). Megvizsgáltuk a hajó sűrűség és a hajó morfológia a dugó szakaszokat H & E festés és immunhisztokémiai festésre elleni ellenanyag CD31, egy endoteliális sejt-marker. A vaszkularizáció a honokiol + VEGF csoportban szignifikánsan csökkent, összehasonlítva a VEGF kapó csoportban (ábra. 4B-B). Számszerűsítve a vérellátásának számolva a hajók és bemutatott endothel sejtek kiderült, hogy a vaszkuláris sűrűsége a honokiol kezelt csoportban szignifikánsan csökkent (ábra. 4B-c és 4B-d). Katalógusa

Továbbá, endotél sejteket indukált kihajt az izolált patkány aorta gyűrűk jelenlétében Matrigel és ECGM (endoteliális sejt növekedési táptalaj), mely az angiogén citokinek, például VEGF és bázikus fibroblaszt növekedési faktor. Kiterjedt endoteliális sejt kinövését patkány aortából gyűrűs explantátumokat volt megfigyelhető a kontroll csoportban (ábra. 5A). Honokiol kezelés eredményezett szignifikáns (~five-szeres) csökkentése endoteliális kinövés és csírázás aorta gyűrűket (ábra. 5A és 5C). Továbbá a morfológiai differenciálódás az endoteliális sejt csőképződést alkalmazásával vizsgáltuk egy kétdimenziós Matrigel módszerrel. Ábrán látható az 5B, beoltását HUVEC matrigelben vezetett vaszkuláris cső-szerű szerkezet kialakulását. Honokiol hatékonyan gátolta endoteliális sejt csőképződés csökkentésével a cső-szerű szerkezet hossza és szélessége (ábra. 5B és 5D).

Honokiol eltörölte a STAT-3 jelátviteli emberi gyomorban Cancer Cells, HUVEC és daganatok

Korábbi tanulmányok kimutatták, erős összefüggés aktivált STAT-3 és az angiogén fenotípus [11]. Mi tovább tisztázott hatását honokiol a foszforilációja STAT-3 humán gyomorrák sejtek (MKN45 és AGS) és HUVEC. Amint a 6. ábrán látható, honokiol csökkentette a tirozin (Tyr705) foszforilezése a STAT-3 egy időfüggő módon körülbelül egy kétszeres csökkenése a 1-2 órán AGS sejtek (ábra. 6a) és egy 3 a 10- szeres csökkenést 0,5-24 h MKN45 sejtek (6B.). Meglepő, honokiol indukált STAT-3 defoszforilációjában Tyr705, de nem Ser727, maradványok ezek az emberi gyomor rákos sejteket. Azonban honokiol egyidejűleg gátolta Tyr705 és Ser727 foszforilációja STAT-3 HUVEC (ábra. 6C). Mennyiségi elemzése protein sávok a Western blot segítségével Image-Pro Plus szoftvert 7. ábrán látható az eredményeit analízis konfokális mikroszkóppal is kimutatta, hogy honokiol eltörölte a tirozin (Tyr705) foszforilezése a STAT-3 AGS sejtekben és HUVEC (ábra . 8A).

továbbá vizsgálta a STAT-3 foszforiláció peritoneális metasztázisos daganatok izolált meztelen beoltott egerek MKN45 sejtek vagy anélkül honokiol (5 mg /kg) kezelés. Az immunhisztokémiai analízis kimutatta, hogy a p-STAT-3 túltermelése és felhalmozódását a tumor régióban, beleértve magok és a citoplazmában, jelentősen megfordult honokiol kezelés (ábra. 8B). A Western-blot analízis, honokiol jelentősen csökkent a felhalmozódása a p-STAT3 tumorokban összehasonlítva járműirányító (ábra. 9a). A kifejezés a konstitutív STAT3 nem érintette. Továbbá, a DNS-kötő aktivitását a STAT-3 tovább alkalmazásával bizonyítottuk EMSA. Amint a 9B ábrán, honokiol jelentősen gátolta a megnövekedett DNS-kötő aktivitását STAT-3 humán gyomorrák sejtek. Honokiol is gátolta a VEGF-megnövekedett STAT-3 DNS-kötő aktivitást HUVEC (ábra. 9b).

Honokiol Induced SHP-1-szabályozott STAT-3 defoszforiláció a gyomorrák, endoteliális sejtekből, és a tumorok

SHP-1 egy nem transzmembrán PTP [12]. A következőkben azt vizsgálta, hogy honokiol képes szabályozni az expressziója és aktivitása az SHP-1. Amint a 10A ábrán látható, honokiol fokozott fehérje expresszióját SHP-1, de nem SHP-2, a HUVEC és AGS sejtek idő-függő módon. Farmakológiai PTP gátló és az SHP-1 siRNS transzfekciója hatékonyan megszüntette a honokiol indukálta STAT-3 defoszforiláció a HUVEC és AGS sejtek (10B.-A). Hasonló eredményeket SCM-1 sejtek és az SV-40 immortalizált egér mikrovaszkuláris endoteliális sejtek (SVECs) kezeljük honokiol ábra mutatja 10B-B. A következőkben azt vizsgálta, hogy az endogén SHP-1 által modulált honokiol. Honokiol volt képes felidézni az SHP-1 aktivitás gyomorrák sejtek, HUVEC és SVECs egy időfüggő módon (ábra. 11 A). Honokiol növelte az SHP-1 fehérje expressziót peritoneális áttétes daganatok izolált MKN45 beoltott egerek által feltárt immunhisztokémiai analízis (ábra. 11B). Mi tovább vizsgáltuk a kölcsönhatás SHP-1 és a STAT-3 módszerek alkalmazásával a CO-immunprecipitációval és Western-blottal. Ábrán látható 11C, SHP-1-et specifikusan a STAT-3 AGS sejtekben és HUVEC jelenlétében honokiol képest IgG kontroll.

Honokiol Altered ER Morfológia, indukált Calpain-II-szabályozott SHP -1-indukált STAT-3 defoszforiláció, és a csökkent VEGF Generation

Korábbi vizsgálatok arra utaltak, hogy az ER stressz fontos szerepet játszik az angiogenezisben [20], [21]. Mi a következő hatását vizsgálták honokiol ER mikroszerkezeti transzmissziós elektronmikroszkóppal. Ábra mutatja, a 12A, ER tágítás és fragmentáció voltak kiállítva honokiol kezelt SCM-1 gyomorrák sejtek és HUVEC. Katalógusa

Azt is akarta meghatározni, hogy calpain-II aktiválás szükséges SHP-1 aktivitás honokiol -gyel kezelt sejtekben. Farmakológiai kalpaininhibitor és kalpainaktivációt-II siRNS transzfekció hatékonyan csökkentette honokiol javított SHP-1 aktivitás AGS sejtek és HUVEC (ábra. 12B). A sejteket kezeltük rekombináns kalpain-II, mint a pozitív kontroll, mutatott 4-5-szeres növekedését SHP-1-aktivitás (ábra. 12b). A VEGF ismerten az tartalmazza a STAT-3 promoter kötőhely. A következőkben azt vizsgálta, hogy honokiol képes szabályozni a VEGF expresszióját. Honokiol szignifikánsan csökkentette a VEGF-termelés AGS sejtek és HUVEC, és ez a hatás megfordul az SHP-1 siRNS transzfekció (ábra. 12c). Ezen túlmenően, transzfekciója mutáns-STAT-3 plazmidot a sejtekbe is gátolta a VEGF-termelés. A kombináció honokiol mutáns-STAT-3 plazmid transzfekciót sejtekben szinergikusan csökkentette a VEGF termelés képest bármelyik kezelés egymagában (ábra. 12C). Annak további igazolására, közötti kölcsönhatás kalpain-II és SHP-1, CO-immunprecipitációval és Western blot végeztük gyomor rákos sejtekben. Ábrán látható 12D, kalpain-II-t specifikusan asszociált SHP-1 AGS sejtek jelenlétében honokiol (20

• PLoS One: Ratio között negatív és pozitív nyirokcsomók Alkalmas értékelése a gyomorrák prognózisa pozitív betegek Node Metastasis
• PLoS One: Nagy γ-sugárzás érzékenység társul kiszélesedett Gyomor rák kockázatát a kínai Han Népesség: A Case-Control Analysis