PLoS ONE: kalpainas /SHP-1 Sąveika iki Honokiol slopinimo peritoninės sklaida skrandžio vėžio nu /nu Pelės

Anotacija

Fonas

Honokiol, mažas-molekulinė masė natūralus produktas, anksčiau buvo pranešta, kad aktyvuoti apoptozę ir slopina skrandžio tumorigenezei. Nesvarbu honokiol slopina angiogenezę ir metastazes skrandžio vėžio ląstelių lieka nežinoma.

metodika /Principal išvados

išbandė honokiol poveikį angiogeniniai veiklos ir pilvaplėvės sklaidos naudojant vivo ex in vivo parsisiųsti ir in vitro
analizes sistemas. Signalizacijos atsakas žmogaus skrandžio vėžio ląstelių, žmogaus Jungiamieji kraujagyslių endotelio ląstelės (HUVECs) ir izoliuotos navikų buvo aptikti ir išanalizuoti. Be ksenografiniuose skrandžio navikas pelės modelį, honokiol smarkiai slopino pilvaplėvės sklaidą aptiktas PET /CT technika. Honokiol taip pat efektyviai ardo tą angiogenezę aptiktas jauniklį chorioalantojo membranos testą, pelių Matrigel kištuko testą, žiurkė aortos žiedas endotelio ląstelių ataugų testą, ir endotelio ląstelių vamzdelio formavimosi tyrime. Be to, honokiol veiksmingai pagerinti signalo rele ir aktyvatorius transkripcijos (STAT-3) dephosphorylation ir inhibuoja STAT-3 DNR surišimo aktyvumą žmogaus skrandžio vėžio ląsteles ir HUVECs, kuris buvo susijęs su up-reguliavimo veiklos ir baltymų raiškos src Homologijos 2 (SH2) -Kurių sudėtyje tirozino fosfatazės-1 (SHP-1). Kalpainas II inhibitorius ir siRNR transfekcija žymiai pasikeitė honokiol sukeltos SHP-1 aktyvumą. Sumažėjo STAT-3 fosforilinimas ir padidėjo SHP-1 sąvoka taip pat buvo parodyta izoliuotų pilvaplėvės metastazavusiu navikų. Honokiol taip pat galėjo VEGF kartos, kuri gali būti atstatomi SHP-1 siRNA transfekciją.

Išvados /Reikšmė

Honokiol didina raišką ir aktyvumą SPH-1, kad toliau išjungia stat3 kelią. Šie duomenys taip pat rodo, kad honokiol yra naujas ir stipriai slopina angiogenezę ir pilvaplėvės sklaidos skrandžio vėžio ląsteles, teikia paramą už paraiškos potencialo honokiol skrandžio vėžio gydymo

nurodomoji dalis:. Liu SH Wang KiB, LAN KH Lee WJ, visos HC, VU S. et al. (2012) kalpainas /SHP-1 Sąveika iki Honokiol slopinimo peritoninės sklaida skrandžio vėžio nu /nu pervežimas Pelės. PLoS vieną iš 7 (8): e43711. Doi: 10,1371 /journal.pone.0043711

redaktorius: Henrikas Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Vokietija

Įstojo: sausio 17, 2012; Priimta 24 Liepos 2012 m Paskelbta rugpjūčio 24, 2012

Visos teisės saugomos: © Liu et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė mokslinių tyrimų dotacijų iš Taičungas veteranų General Hospital, Taivanas (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) ir nacionalinio mokslo tarybos Taivanas (NSC99-2320-B-005-003-MY3). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

dauguma pacientų (~60%) su skrandžio vėžiu, diagnozuojama vėlai liga. Skrandžio vėžys yra antra labiausiai paplitusi priežastis pasaulinės mirtingumo nuo vėžio išsivysčiusiose tautose ir eksponuoja metastazavusiu ligos diagnozę [1] metu. Chirurgija ir mišriai chemoterapiniais vaistiniais preparatais skrandžio vėžio buvo įrodyta, kad suteikia tik kuklius išgyvenimo naudos pažangias atvejais, ir beveik 50% pacientų, vis dar miršta po pasikartojimo [2], [3]. Pagrindinis forma pasikartojimo yra peritoninės sklaida. Vėžys augimas ir pilvaplėvės metastazių yra angiogenezę priklauso, procesas, kurio metu apima keletą angiogeninių veiksnius, įskaitant kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF), epidermio augimo faktoriaus (EGF), pagrindinio fibroblastų augimo faktoriaus, prostaglandino E2, interleukino-8, chemokino (CXC motyvas) ligando 1, ir matrica metaloproteinazės šeimos [4] - [6]. Keli molekulinės signalai, pavyzdžiui, signalo keitiklio ir aktyvatorių transkripcijos-3 (STAT-3), branduolinio faktoriaus eb, Akt, mitogenu aktyvinto proteino kinazės, ciklooksigenazės-2, lipoksigenazės, indukuojamo azoto oksido sintezės, naviko nekrozės faktoriaus ir kiti , taip pat buvo įrodyta, kad būti įtraukti į auglio progresavimo ir angiogenezę [7] - [9]. Tačiau ląstelių ir molekulinės mechanizmai kūrimo, progresavimo, ir metastazės skrandžio vėžio dar reikia patikslinti.

Janus aktyvuota kinazės (Jak) /STAT signalizacijos kelias vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant ląstelių augimas, angiogenezės, diferenciacija, migracija, ir metastazių [10]. Steigiamąjį aktyvavimo STAT kelius, ypač STAT-3, yra susijęs su įvairiomis žmogaus piktybinių navikų. Patvari STAT-3 fosforilinimo buvo stebimi įvairiose žmogaus vėžio, pavyzdžiui, solidinių auglių, skrandžio, storosios žarnos, kepenų, prostatos, krūties, plaučių, ir galvos ir kaklo, taip pat kraujo piktybinių navikų [8], [10]. Ankstesnis tyrimas parodė, kad fosforilinimas STAT-3 ir VEGF baltymų raiškos padidėja žmogaus skrandžio vėžio audinio, kuris savo ruožtu pakelti angiogeninf fenotipą ir prisidėti prie skrandžio vėžio išsivystymo ir progresavimo [11]. Kita vertus, tam tikri fosfatazės yra žinoma, kad auglio slopintuvai ir gali atlikti svarbų vaidmenį slopinimą arba kontrolės vėžys augimo [12] - [15]. Baltymų tirozino fosfatazės (PTPs), įskaitant SH2 domeno, kurių sudėtyje yra tirozino fosfatazės (SHP) -1 ir SHP-2, gali neigiamai reguliuoti STAT signalizacijos pagal tirozino dephosphorylation kelių komponentų susijusių signalizacijos būdus [13] - [15] , Nuolatinis aktyvavimo STAT-3 navikų gali būti lengviau bent iš dalies funkcijų netekimo šių fosfatazes. Kalpainas II buvo įrodyta, kad vaidinti svarbų vaidmenį Endoplazminis tinklas (ER) streso reguliuojama Tumorigenesis, kuris dalyvauja teikiant honokiol-slopino skrandžio Tumorigenesis [16] mechanizmą. Be to, ankstesnio tyrimo metu taip pat nurodė, kad SHP-1 yra endogeninė substratas kalpainas po A23187 sukeltai trombocitų aktyvacija [17]. Todėl kalpainas /SHP-1 reguliuojama STAT-3 ir VEGF kelias gali būti įtraukti į angiogeneziniu, augimo ir pilvaplėvės sklaida skrandžio vėžio ląsteles.

Honokiol, mažas-molekulinė masė natūralus produktas, yra pagrindinis aktyvus biphenolic junginys Magnolija officinalis
, kuri yra žinoma, pagerinti mikrobų infekcijas, uždegimus ir virškinimo sutrikimų tradicinių Azijos vaistinių sistemų [18]. Mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, kad honokiol slopina skrandžio tumorigenezei aktyvacijos 15-lipoksigenazės-1 ir dėl to slopinamas peroksisominių proliferatorių aktyvuota receptorių-A ir COX-2-priklausomų signalų [19]. Honokiol buvo įrodyta, kad sukelti ER stresą ir sukelti kalpainas II-tarpininkaujant gliukozės reguliuojama baltyminių 94 skilimo ir apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląstelių [16]. Buvo įrodyta, kad VEGF išraiška gali būti reaguoja į maistinių medžiagų nepriteklių sąlygomis, kurios sukelia ER stresą [20], [21]. Be to, ER stresas aktyvatorius tunicamycin buvo nustatyta, kad žymiai užkirsti kelią mikrokraujagyslių vystymąsi, o tai rodo, kad šis ER stresas induktorius gali turėti potencialų vaidmenį krūties naviko gydymui [21]. Į honokiol poveikis ER streso koreliacija angiogenezę ir skrandžio naviko metastazių vis dar neaišku. Čia mes iškėlė hipotezę, kad honokiol slopina angiogenezę ir pilvaplėvės sklaidą skrandžio vėžio ląsteles per kalpainas /SHP-1-reguliuojamoje STAT-3 ir VEGF keliu. Rezultatai parodė, kad honokiol žymiai slopinamas angiogenezę ir pilvaplėvės sklaida skrandžio vėžio ląsteles per kalpainas /SHP-1 sąveika aktyvuota STAT-3 dephosphorylation ir VEGF žemyn reguliavimo keliu.

Rezultatai

Honokiol Užblokuoti peritoninė metastazes skrandžio vėžys vivo

Vėžys dažnai pasižymi padidėjusiu įsisavinimo [ ^{18F] fluor-2-deoksi-d-gliukozės (FDG) ir [ 18F] -FDG /PET gali tarnauti kaip pakaitalas priemonę gydomojo poveikio. buvo įvertintas funkcinė galimybė smulkių gyvūnų vaizdavimo naudojant klinikinę PET /CT skaitytuvas su FDG. Tirtos keturios grupės pelių peritoninės metastazės eksperimentams. Pareiškimą /nuotrauka metastazes situacija buvo parodyta 1 paveiksle Mes panaudoti [ 18F] -FDG-PET /KT aptikti peritoninės metastazes pelėms užkrėstų žmogaus skrandžio vėžio ląstelių (MKN45 arba SCM-1) su arba be honokiol gydymas. Kaip parodyta 2 paveiksle, didžiausias intensyvumas projekcija buvo gautos iš Tipiški pelių. Pilvaplėvės metastazės buvo pažymėtos kontrolės pelėms (kairiajame skydelyje), ir tai iš tikrųjų buvo atstatomi honokiol gydymo (dešinėje skydelio). Šie vaizdai aiškiai parodė, kad neinvazinis [ 18F] -FDG dūmtakiuose pilvaplėvės metastazavusiu navikų kontrolės pelių buvo daug didesnis nei per honokiol gydytų pelių. Intensyvumo kiekybinė išraiška parodyta 3A pav. Injekciją į pilvą iš honokiol (5 mg /kg du kartus /savaitę) gerokai sumažino apskaičiuotus radioaktyvumo skaičius ir konkretūs Panaudotų vertės (SUV) nulemtus FDG-PET /CT pelėms užkrėstų skrandžio vėžio ląsteles (3 pav.). Be to, daugelis metastaziniai mazgeliai buvo rasta pilvaplėvės ertmę (žarnų pasaitai) iš kontrolinės pelių užkrėstų MKN45 ir SCM-1 (2 pav.) Ląsteles. Priešingai, pilvaplėvės naviko mazgeliai buvo pastebėtas kartkartėmis pelėms gydomiems honokiol. Kiekybinis mazgelių viename lauke rodomas 3B pav.}

Honokiol inhibiduotą Angiogenezė vivo
ex vivo
, ir in vitro

endotelio ląstelės yra labai svarbus angiogenezds procesą, kuris yra būtinas naviko augimui ir metastazių. Mes šalia tyrė angiogeninf poveikį honokiol naudojant jauniklį chorioalantojo membranos tyrimą ( CAM
tyrimas), Matrigel kištukas tyrimas, aortos žiedas ataugų analizė ir endotelio ląstelių vamzdis formavimas. Kaip parodyta 4A pav, honokiol efektyviai slopino neo-kraujagyslių susidarymą CAM pervežimas tyrimą be jokių matomų poveikio pasirengimo esamų kraujagysles. Kiekybinė analizė parodė, kad honokiol sukėlė 2,5 karto sumažėjo naujai suformuotų kraujagyslių skaičiaus, lyginant su vidutinio kontrolę.

Matrigel kištuko tyrimą, Matrigel, kurių sudėtyje yra VEGF (100 ng /ml gelio) su arba be honokiol (10 mikrogramų /ml) buvo po oda implantuoti į nuogas pelių. Po 21 dienų po implantavimo, susidarę Matrigel kištukai buvo pašalintų ir fotografavo. Kaiščiai su vien VEGF buvo ženkliai sluoksneliais, kraujagyslių ir raudona spalvos. Kištukai, kurių sudėtyje yra VEGF ir honokiol buvo išblyškęs, nurodant ne ar mažiau kraujagyslių formavimąsi (pav. 4B-A). Mes taip pat išnagrinėjo laivo tankis ir kraujagyslių morfologiją Plug skyriuose pagal H & El dažymo ir imunohistocheminį dažymo su antikūnais prieš CD31, An endotelio ląstelių persekiotoją. Yra nurodyti šios honokiol + VEGF grupės vaskuliarizacijos buvo žymiai mažesnis, palyginus su VEGF vien grupės (pav. 4B-b). Kiekybinis skaičiuojant laivus ir pristatė endotelio ląstelių vaskuliarizacijos atskleidė, kad kraujagyslių tankis honokiol gydytų pacientų grupėje buvo reikšmingai sumažėjo (Figos. 4B-C ir 4B-D).

Be to, endotelio ląstelės buvo sukeltas atauga iš izoliuotų žiurkės aortos žiedai iš Matrigel ir ECGM (endotelio ląstelių augimą vidutiniu), kuriame angiogeninių citokinus, pavyzdžiui, VEGF ir pagrindinio fibroblastų augimo faktoriaus buvimą. Platus endotelio ląstelių atauga iš žiurkių aortos žiedas eksplantuose buvo pastebėtas su kontroline grupe (pav. 5a). Honokiol gydymas lėmė reikšmingą (~five kartus) mažinti endotelio atauga ir ataugų aortos žiedais (Figos. 5a ir 5c). Be to, morfologinės diferenciacija endotelio ląstelių vamzdžių formavimo buvo tiriamas naudojant dvimatę Matrigel metodą. Kaip parodyta 5B pav, sėjimo iš HUVECs į Matrigel pradėta prie kraujagyslių vamzdžio pavidalo struktūros susidarymo. Honokiol efektyviai slopina endotelio ląstelių vamzdis formavimas mažinant vamzdelį panašus struktūrą ilgio ir pločio (Figos. 5B ir 5d).

Honokiol panaikinta STAT-3 signalizacijos Žmogaus skrandžio vėžio ląsteles, HUVECs ir Navikai

Ankstesni tyrimai parodė tvirtą ryšį tarp aktyvuota STAT-3 ir angiogeniniai fenotipą [11]. Mes taip pat išaiškinta, kad honokiol poveikį STAT-3 fosforilinimo žmogaus skrandžio vėžio ląstelių (MKN45 ir AGS) ir HUVECs. Kaip parodyta 6 pav, honokiol sumažino tirozino (Tyr705) fosforilinimo Apsaugos min-3 ir tam tikru priklausomu būdu su apie dviejų kartų mažiau 1-2 h AGS ląstelių (6A pav.) Ir nuo 3 iki 10- kartus sumažėjimas 0.5-24 h MKN45 ląstelių (pav. 6b). Keista, honokiol sukeltas STAT-3 dephosphorylation iš Tyr705, bet ne Ser727, likučius šiose žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Tačiau honokiol vienu metu slopino ir Tyr705 ir Ser727 fosforilinimo STAT-3 HUVECs (pav. 6c). Kiekybinė analizė baltymų juostų Vakarų dėmė naudojant Vaizdo-Pro Plus programinė įranga pavaizduota 7 paveiksle Analizės su mikroskopas rezultatai taip pat parodė, kad honokiol panaikino tirozino (Tyr705) fosforilinimas STAT-3 AGS ląstelių ir HUVECs (pav . 8A).

Mes taip pat išnagrinėjo STAT-3 fosforilinimo pilvaplėvės metastazavusiu navikų, išskirtų iš nuogas pelių užkrėstų MKN45 ląstelių su (5 mg /kg) gydymui arba be honokiol. Imunohistocheminis analizė parodė, kad P-STAT-3 raiška ir kaupimą auglio regione, įskaitant branduolių ir citoplazmoms, buvo žymiai pakeista į honokiol gydymo (8B pav.). Vakarų blotingo analizės, honokiol ženkliai sumažėjo p-STAT3 kaupimąsi navikų, palyginti su transporto priemonių kontrolės (pav. 9A). Iš steigiamojo STAT3 išraiška nepakinta. Be to, DNR privalomas veikla STAT-3 buvo dar kartą patvirtino, naudojant EMSA. Kaip parodyta 9B paveiksle, honokiol žymiai slopinamas padidėjusį DNR surišimo aktyvumą Apsaugos min-3 dalyvavimo žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Honokiol taip pat slopino VEGF padidėjo STAT-3 DNR privalomą veiklą HUVECs (Pav. 9b).

Honokiol sukeltas SHP-1-reguliuojami STAT-3 Dephosphorylation skrandžio vėžio ląstelių, endotelio ląstelių, ir Navikai

SHP-1 yra ne-transmembraninis PTP [12]. Mes šalia išnagrinėti, ar honokiol gali reguliuoti išraišką ir veiklą SHP-1. Kaip parodyta 10A paveiksle, honokiol sustiprintas baltymų ekspresiją SHP-1, bet ne SHP-2, į HUVECs ir AGS ląstelių laiko priklausomu būdu. Farmakologinis PTP inhibitorius ir SHP-1 siRNR transfekcija efektyviai panaikino honokiol sukeltos STAT-3 dephosphorylation į HUVECs ir AGS ląstelių (pav. 10B-a). Panašūs rezultatai SCM-1 ląstelių ir SV-40 įamžinta pelės mikrovaskulinių endotelio ląstelių (SVECs) gydomiems honokiol yra pavaizduota 10B-B. Mes šalia išnagrinėti, ar endogeninė SHP-1 moduliuoti honokiol. Honokiol galėjo žadina SHP-1 aktyvumą skrandžio vėžio ląsteles, HUVECs ir SVECs Tuo metu priklausomu būdu (11a pav.). Honokiol pat patobulintas SHP-1 baltymo raišką pilvaplėvės metastazavusiu navikų, išskirtų iš MKN45-paskiepytų pelių kaip atskleidė imunohistocheminio analizė (11B pav.). Mes toliau nagrinėjo tarp SHP-1 ir STAT-3 sąveiką naudojant CO-Imunoprecipitacijos ir imunoblotingo metodus. Kaip parodyta 11C pav, SHP-1 buvo specialiai susijęs su STAT-3 AGS ląstelių ir HUVECs į honokiol akivaizdoje, palyginti su IgG kontrolę.

Honokiol Altered ER morfologija, sukeltas kalpainas II reguliuojama SHP -1 sukeltos STAT-3 Dephosphorylation ir Sumažėjęs VEGF kartos

Ankstesni tyrimai parodė, kad ER stresas vaidina svarbų vaidmenį angiogenezę [20], [21]. Mes šalia išnagrinėjo honokiol poveikį ER mikrostruktūros, kad perdavimo elektroniniu mikroskopu. Kaip parodyta 12A pav ER išsiplėtimas ir fragmentacija buvo eksponuojami honokiol gydytų SCM-1 skrandžio vėžio ląsteles ir HUVECs.

Mes taip pat norėjome nustatyti, ar kalpainas II aktyvavimo reikia SHP-1 aktyvumui honokiol gydomiems ląstelės. Farmakologinis kalpainas inhibitorius ir kalpainas II siRNR transfekcija veiksmingai sumažinti honokiol padidinto SHP-1 aktyvumą AGS ląstelių ir HUVECs (Pav. 12b). Ląstelės, gydytų rekombinantiniu kalpainas-II, kaip teigiama kontrolė, parodė, kad 4-5 kartus padidinti SHP-1 aktyvumui (12b pav.). VEGF yra žinoma, kad yra stat-3 promotoriaus privalomą svetainę. Mes šalia išnagrinėti, ar honokiol gali reguliuoti VEGF išraiška. Honokiol žymiai sumažino VEGF kartos į AGS ląstelių ir HUVECs ir šis poveikis buvo panaikintas SHP-1 siRNA transfekciją (pav. 12C). Be to, transfekavimas mutantas-STAT-3 plazmidės į ląstelių, taip pat slopina VEGF kartos. Iš honokiol su mutantas-Stat-3 plazmidžių transfekciją ląstelėse derinys sinergetiškai sumažino VEGF gamybą, palyginti su vien tik arba gydymo (pav 12c.). Toliau patvirtinti tarp kalpainas-II ir SHP-1 sąveiką, bendrai imunoprecipitacijos ir imunoblotingu buvo atlikti skrandžio vėžio ląsteles. Kaip parodyta 12D paveiksle, kalpainas-II buvo konkrečiai susijęs su SHP-1 AGS ląsteles honokiol (20 mikronų) buvimą, palyginti su IgG kontrolės. Be to, honokiol sukeltos kalpainas /SHP-1 sąveika taip pat buvo rasta HUVECs (duomenys neparodyti).

Diskusijos

Honokiol yra pagrindinė sudedamoji dalis, Magnolija officinalis
, kuri yra pereinamasis medicina Azijoje [18]. Honokiol turi anti-oksidacinių ir priešuždegiminiu poveikiu in vitro, parsisiųsti ir vivo
[22] - [25]. Honokiol buvo įrodyta, kad eksponuoti stiprus antiproliferacinis veikla prieš endotelio ląstelės in vitro parsisiųsti ir antinavikinio poveikio prieš angiokarcinomos nuogas pelių [26]. Šiame tyrime, mes buvo pademonstruota siekiant gauti pirmą kartą, kad honokiol yra stipriai slopina angiogenezę ir pilvaplėvės metastazių skrandžio vėžio. Mūsų tyrimas buvo sutelktas į poveikį ir galimus mechanizmus honokiol, kuriems atliekama peritoninė metastazių ir angiogenezę naudojant PET /CT, CAM
tyrimas, Matrigel kištukas tyrimas, aortos žiedas endotelio ląstelių ataugų tyrimas, endotelio ląstelių vamzdis formavimas tyrimas, ir vitro
ląstelių eksperimentų. Rezultatai parodė, kad honokiol gali slopinti angiogenezę ir pilvaplėvės sklaidą per kalpainas II-aktyvuotos SHP-1 aktyvacijos signalizacijos kaskados. Aktyvinimas fosfatazės SHP-1 iki honokiol toliau lėmė žemyn reguliavimo STAT-3 aktyvacijos ir VEGF gamybą, todėl iš angiogenezę ir pilvaplėvės metastazių slopinimui. Tačiau, angiogenezės ir slopinimo metastazavusio potencialo vėžinių ląstelių slopinimo honokiol gali būti atskiri aspektai, kurių viena yra iš honokiol poveikis angiogenezės tiesiogiai ir kitas honokiol poveikis vėžio ląsteles.

Per pastaruosius keletą metų, parodė, keletas tyrimų, kad sudėtinė aktyvavimo STAT šeimos narių, ypač STAT-3, yra susijęs su ląstelių proliferacijos, angiogenezės ir metastazių [10], [11], [27] - [30]. Padidėjęs aktyvavimo STAT-3 išraiška buvo rasta įvairių vėžinių kilmės ląstelių ir mėginių iš žmogaus vėžio audiniuose. Nereguliuojamoje STAT-3 aktyvavimo buvo pasiūlyta vaidinti svarbų vaidmenį raiškos VEGF ir padidėjo angiogeninių fenotipų skrandžio vėžys, kuris gali prisidėti prie skrandžio vėžio išsivystymo ir progresavimo [11]. Šioje studijoje, mes nustatėme, kad honokiol gali veiksmingai slopinti STAT-3 HUVECs (abiejų Tyr705 ir Serine727 svetainių), žmogaus skrandžio vėžio ląstelių (Tyr705 vietoje), ir pilvaplėvės metastazavusiu navikų (Tyr705 vietoje) fosforilinimas. Kaip onkogeninė aktyvavimo tirozino kinazės yra bendras bruožas vėžio, mes sutelktas į Tyr705 fosforilinimo STAT-3 vaidmenį.

SHP-1 turi potencialią auglio slopinamojo funkciją ir yra neigiamas reguliatorius su jak /STAT signalizacijos kelias [15]. Taip pat buvo įrodyta, kad SHP-1 fosfatazės gali prisijungti prie fosforilinto Y1173 domeno, kuris veda į EGFR dephosphorylation [31]. Y429 į citoplazmos domeno eritropoetino receptorių buvo pasiūlyta būti privalomas svetainę baltymų tirozino fosfatazės SH-PTP1, kuris gali vaidinti svarbų vaidmenį nutraukiant antiproliferacinės signalus [32]. SHP-1 taip pat buvo įrodyta, kad būti augimo faktoriaus antagonistas signalizacijos epitelio ir kraujodaros ląstelių [15]. SHP-1 buvo ypač pabrėžta, kaip galimą fiziologinę antagonistas VEGFR signalizacijos [33]. Endotelio ląstelių, SHP-1 yra fiziškai susijęs su KEAFR 2 ir taip pat yra reikalingas tiek TNF-alfa medijuojamos ir audinių-inhibitorius metaloproteinazių (TIMP) sąlygojamą angiogenezės slopinimui [31]. Taigi SHP-1 aktyvavimo gali turėti svarbių pasekmių platinimu ir angiogenezę reglamentą. Šiame tyrime mes nustatėme, kad honokiol specialiai sustiprino SHP-1 išraišką, bet ne SHP-2, skrandžio vėžio ląstelių, endotelio ląstelių, ir pilvaplėvės metastazavusiu navikų. Šie rezultatai rodo, kad honokiol gali slopinti endotelio ląstelių angiogenezę ir vėžinių ląstelių metastazes, kuris gali būti per SHP-1 sukeltas STAT-3 žemyn reguliavimo keliu.

Ankstesni tyrimai pasiūlė svarbų vaidmenį ER stresą molekulinė mechanizmas angiogenezės ir vėžinių ląstelių augimo [16], [20], [21]. Koyama ir jo kolegos taip pat teigė, kad ER streso sukeltas kalcio sutrikimas gali būti įtraukti į amiloido beta kaupimo ir angiogeninis faktoriaus išraišką indukcijos tinklainės pigmentinio epitelio [34]. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad ER stresas reguliuojama IRE-1α signalizacijos turi esminę funkciją placentos plėtros ir embriono gyvybingumo, pabrėždama ER streso ir angiogenezę santykius placentą nėštumo [35] metu. Kim ir kolegos parodė, kad tiek SHP-1 ir SHP-2 yra endogeninių substratai kalpainas, kuris dalyvauja kontekste Entamoeba histolytica
indukuotų Ląstelė šeimininkė, mirtis [36]. Pažymėtina, calpains tapti aktyviais kai ląstelėje kalcio ([Ca ^{2 +] i) koncentracija yra padidėjusi; M-kalpainas (kalpainas II) reikalaujama [Ca 2 +] Aš ne milimolių diapazone, bet mikromolių koncentracijos [Ca 2 +] i yra pakankamai už μ-kalpainas (kalpainas I) aktyvacija [37 ], [38]. Ji buvo parodyta, kad aukšto lygio [Ca 2+] i trukdo baltymų tirozino kinazės aktyvumo kaip kalpainas aktyvinamo stimuliacijos pagal jonoforu trombocitų [39] metu. Honokiol galėjo paskatinti [Ca 2 +] ï mobilizaciją į neuronų ląstelių [40]. Neseniai tunicamycin buvo pranešta slopina angiogenezę in vivo
. Mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, kad honokiol skatina žmogaus skrandžio vėžio ląstelių apoptozę ir slopina tumorigenezei per kalpainas tarpininkaujant gliukozės reguliuojama baltyminių 94 skilimo [16]. Šiame tyrime mes tiesmukai parodė, kad ER buvo išsiplėtę ir nevienalytis honokiol gydytų skrandžio vėžio ląsteles ir HUVECs. Be to, farmakologinis inhibitorius kalpainas ir kalpainas II siRNA transfekciją veiksmingai sumažinti honokiol padidinto SHP-1 aktyvumą skrandžio vėžio ląsteles ir HUVECs. Pažymėtina, kad mūsų rezultatai pirmą kartą parodė, kad kalpainas /SHP-1 sąveika yra tiesiogiai sukėlė honokiol slopinimu STAT-3 fosforilinimo skrandžio vėžio ląsteles. Šie rezultatai rodo, kad honokiol gali sukelti ER stresą ir išprovokuoti kalpainas II-aktyvuota SHP-1 aktyvumą skrandžio vėžio ląsteles ir endotelio ląstelių.}

daryti išvadą, kad šio tyrimo rezultatai pateikti in vivo ex vivo, parsisiųsti ir in vitro
įrodymų slopinimo angiogenezę ir pilvaplėvės sklaidos skrandžio vėžio ląsteles honokiol ir molekulinės pagrindas jo poveikį. Šie duomenys pabrėžti ER kalpainas ir baltymų tirozino fosfatazės SHP-1 signalizacijos dalyvavimą honokiol-slopino STAT-3 aktyvacijos ir VEGF gamybos skrandžio vėžio ląsteles ir endotelio ląstelių (13 pav.). Šie duomenys taip pat rodo, kad žemyn reguliavimas STAT-3 ir VEGF signalizacijos sukeltas kalpainas /SHP-1 gali būti perspektyvus terapinis strategija skrandžio vėžio gydymo.

Medžiagos ir metodai

Ląstelės kultūra ir

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas, įskaitant Kaukazo ląstelių linijos (AGS, vidutiniškai /prastai (maišytas) diferencijuotų adenokarcinoma ląstelių) ir Azijos ląstelių linijas (MKN45 ir SCM-1, neišrūšiuotos adenokarcinoma ląstelių) buvo gauti iš ląstelių bankas Taipėjus veteranų General Hospital (Taivanas). Ląstelės buvo prižiūrimi RPMI1640 terpėje, turinčioje 10% FCS ir streptomicino /peniciliną drėgnoje 5% CO _{2 atmosferos.}

HUVECs buvo gauti iš virkštelės venos iki kolagenazės gydymo, kaip aprašyta anksčiau [41]. Šis tyrimas atitinka naudojimo žmogaus audinių nurodytų Helsinkio deklaracijos principais. Tyrimo protokolas buvo patvirtintas Etikos aspektų vertinimo tarybos Taichung veteranų General Hospital, Taichung, Taivanas (patvirtintas dokumentas TCVGH-C0062-1). buvo naudojami HUVECs trečiame praėjimą. Iš transfekciją efektyvumas (> 80%) pagal Lipofectin reagento (Invitrogen) buvo nustatomas trečiosios praėjimą. Kai eksperimentų, SV-40 įamžinta pelės kraujagyslių endotelio ląstelės (SVECs) kultivuojamos Dulbecco modifikuota Eagle terpėje (DMEM) papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) ir 1% penicilinui /streptomicino. Švec ląstelių linija buvo maloniai talentingas dr KH LAN (Cancer Center, Taipėjus veteranų General Hospital, Taivanas).

Honokiol buvo gauta iš WAKO Chemical Company (Osaka, Japonija), ir tai buvo nustatyta, kad ne mažiau kaip 99% grynumo HPLC metodu. Skirtingų koncentracijų honokiol buvo naudojami šiame tyrime, priklausomai nuo narkotikų jautrumo IC50 verčių nurodyta (20 mkm AGS, 40 mkm MKN45 ir AMT-1). MKN45 ir SCM-1 ląstelės, bet ne AGS ląstelės, buvo įrodyta, kad veiksmingai skatina navikų iš svetimo naviko pelės modelį.

Gyvūnai

Visos gyvūnų globos ir eksperimentinės procedūros buvo patvirtintos ir atliko dėl gyvūnų Eksperimentai komitetas, Nacionalinė Chung Hsing universitetas, Taičungas, Taivanas (patvirtintame dokumente NCHU-100-26). Keturių iki šešių savaičių amžiaus vyrai BALB /c nude pelėms buvo įsigytas iš NLAC (Taipėjus, Taivanas). Pelėms buvo veisiami ir prižiūrimi pagal konkrečias patogenais neužkrėstų sąlygomis, jei su sterilizuoti maisto ir vandens, iki soties parsisiųsti ir įsikūręs barjero įrenginio su 12 val šviesos /tamsos ciklo.

ksenografiniuose auglio pelės Modelis

Jei įvertinti peritoninė metastazių, išauginti žmogaus skrandžio vėžio ląstelės (4~5 × 10 ^{6 ląstelių) buvo pasėta į pilvaplėvės ertmę BALB /c nuogas pelių [42]. Peritoninės navikai nuogas pelėmis buvo nustatyta 7 dienas po to, kai skrandžio vėžio ląstelių, kuriose augliai buvo ieškoma PET /CT priežiūros injekcijos. Tada, buvo suleidžiama į pilvo ertmę su honokiol (5 mg /kg kūno svorio /du kartus per savaitę) 28 dienų. Iš honokiol apie pilvaplėvės sklaidos efektas buvo vertinamas PET /CT. Pareiškimas /vaizdą apie jo metastazių padėties buvo aprašyta 1 pav Tada, pelės buvo paaukotos pagal anestezijos (pentobarbitalio) ir makroskopinis tyrimas peritoninės metastazių buvimo. Augliai buvo pašalintų, supjaustomas gabalais, nustatytas 10% formalinu ir įdėta į parafino blokus arba przystawkę užšaldyti skystame azote.}

pozitronų emisijos tomografijos /kompiuterinės tomografijos (PET /KT) Skenavimo

Po mažiausiai 6 val pasninko, pelėms buvo suteikta 7,4 MBq (0,2 MCI) dozę ^{18F-FDG žodžiu prieš paraudimas su 1 ml vandens. Pelėms buvo anestezuoti su izoflurano garintuvas prieš kiekvieną nuskaitymas. Eksperimentai smulkių gyvūnų vaizdavimo buvo atliekami su bendra PET /CT skaitytuvas (Discovery ST; GE Medical Systems). Panaudotas multidetector eilutė spiralinės KT skaitytuvas. Techniniai parametrai naudojami CT dalį PET /CT buvo taip: kompiuterinė tomografija tipo su 0,5-antro visiškai sraigtinis skleidimas, detektorius eilės konfigūracija 16 × 1,25 mm, o intervalas erdvėje 2,75 mm, pjūvio storis 1,25 mm , iš 1.75:1 pikis (aukštos kokybės režimas), 17,5 mm per sukimosi greitis, didelė lauko-of-(FOV), 120 KVP įtampa ir srovė 200 mA. Techniniai parametrai naudojami PET dalį PET /CT buvo taip: 10,0 min kiekvienos lovos, regos lauko pasirinktas vaizdavimo rekonstrukcijos buvo 20 cm, o PET rezoliucija buvo apie 4,5 mm pločio pusę maksimalios (FWHM). Atkuria parametrai tipo 3D iteracijos kaip 21 pogrupių ir 2 iteracijų. Įvertinti kiekybinio gebėjimas PET /CT skaitytuvas smulkių gyvūnų vaizdavimo, lankytinos vietos (IG) regionas buvo ant mažesnių FOV transašinėje PET vaizdų visiškai apsupo FDG įsisavinimą sritis stebimų audinių vengiant netoliese audinių. Kiekvieno Pixel anketa veiklos vertę kiekvienoje IG vidurkis buvo įrašytas ir išreikšta Bq /ml.}

jauniklį chorioalantojo Membrana Analizės ( CAM
tyrimas)

Jei ištirti in vivo
angiogeninis veikla, modifikuotas jauniklį visa gyvūnas, CAM
tyrimą buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [43]. Apvaisintų viščiuko kiaušiniai buvo inkubuojamos, kuriame nuolatos drėkinama kiaušinių selekcininko 37 ° C temperatūroje. Po 3 dienų inkubacijos jauniklį embrionai buvo perkelti į kultūros patiekalas. Dvidešimt pL honokiol įterptų I tipo kolagenas mišinys tepti ant dengimo diskus ir polimerizuoti atšilimą. Diskai buvo įkelti į CAM
6 dienų amžiaus embrionų. Po 24-h inkubacijos aplink pakrautas disko plotas buvo fotografuotas su "Nikon" skaitmeniniame fotoaparate, o naujai suformuotų laivų skaičius buvo skaičiuojami du stebėtojai iš dvigubai aklu būdu. Tyrimai kiekvienam bandinio buvo atliekami naudojant 10-13 kiaušinių.

Matrigel Plug Analizės

Nude pelių ar C57BL /6 pelėms buvo švirkščiamas į poodį su 0,6 ml Matrigel, kuriame nurodytą sumą kapsaicino , 100 ng VEGF, ir 10 vienetų heparinu. Investuotas Matrigel greitai sudarė vieną, tvirtą gelio kištuką. Po 7-21 dienų, nuo pele oda buvo lengvai iškedentas atgal atskleisti Matrigel kištuką, kuris liko nepažeistas. Hemoglobinas buvo matuojamas naudojant Drabkin metodą ir Drabkin reagento komplektas 525 (Sigma, St Louis, MO) už kraujagyslių formavimosi kiekybinio. Hemoglobino koncentracija buvo apskaičiuojamas iš žinomu kiekiu hemoglobino tiriama tuo pačiu metu. Vaizdai buvo fotografuotas su "Nikon" skaitmeniniame fotoaparate, ir buvo skaičiuojamas naujai suformuotų mikro laivų skaičius.

ex vivo
Aortos žiedas Analizės

Aortas buvo izoliuoti nuo 6 -week senumo Sprague-Dawley žiurkėms. Plokštės (48-gerai) buvo padengtos 120 pL Matrigel. Aortas išskirti iš pelių buvo valomi periadventitial riebalų ir jungiamojo audinio, ir supjaustyti ~1-MM-ilgai, 1,5-mm ilgų žiedų. Po to, kai skalaujami penkis kartus su endotelio ląstelių pagrindu terpėje, aortas buvo patalpintas Matrigel dengtas šulinių ir padengta dar 100 pL Matrigel. Honokiol arba transporto priemonė buvo įtraukta į šulinėlius galutinis tirpalo tūris būtų 250 pL terpėje.

• PLoS ONE: Santykis tarp teigiamų ir neigiamų limfmazgių tinka vertinimas skrandžio vėžiu sergančių pacientų prognozė su Teigiamas node Metastasis
• PLoS ONE: Aukštas γ spinduliuotei jautrumas susijęs su padidėjusia skrandžio vėžio riziką Kinijos Han Gyventojų: atvejo ir kontrolės Analysis