Фон
<р> Honokiol, небольшой молекулярной массой натуральный продукт, ранее сообщалось, чтобы активировать апоптоз и ингибируют желудочную туморогенез. Является ли ингибирует хонокиол ангиогенез и метастазирование клеток рака желудка остается неизвестной.
Финансирование:. Эта работа при финансовой поддержке исследовательских грантов от Тайчжун ветеранов больницы, Тайвань (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) и Национального научного совета Тайваня (NSC99-2320-B-005-003-MY3). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> большинство пациентов (~ 60%) с раком желудка с диагнозом поздней стадии заболевания. Рак желудка является второй наиболее распространенной причиной глобальной смертности от рака в развитых странах и демонстрирует метастазами в момент постановки диагноза [1]. Хирургия и комбинированные химиотерапевтические препараты для рака желудка, как было показано, чтобы придать лишь скромные выгоды выживания в запущенных случаях, и почти 50% пациентов все еще умирают после рецидива [2], [3]. Основная форма рецидива перитонеального распространения. рост рака и перитонеальный метастаз зависят ангиогенез, процесс, который включает в себя несколько ангиогенных факторов, в том числе сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF), основной фактор роста фибробластов, простагландин Е2, интерлейкин-8, хемокина (СХС мотив) лиганда 1, а матрица семейства металлопротеиназ [4] - [6]. Несколько молекулярных сигналов, таких как преобразователь сигнала и активатор транскрипции-3 (Stat-3), ядерный фактор-ЕВ, Akt, митоген-активируемой протеинкиназы, циклооксигеназы-2, липоксигеназы, адаптивные азотно-синтазы, фактор некроза опухоли и другие , также было показано, участвует в прогрессии опухоли и ангиогенез [7] - [9]. Тем не менее, клеточные и молекулярные механизмы развития, прогрессирования, и метастазирования рака желудка до сих пор остаются в разъяснении.
<Р> Янус-киназы активируются (Jak) /STAT сигнальный путь играет важную роль в регуляции рост клеток, ангиогенез, дифференцировка, миграции и метастазирование [10]. Конститутивной активации STAT путей, в частности, STAT-3, связан с широким спектром злокачественных опухолей человека. Стойкие STAT-3 фосфорилирования наблюдается в различных злокачественных опухолях человека, таких как твердые опухоли желудка, толстой кишки, печени, простаты, молочной железы, легких, головы и шеи, а также злокачественных опухолей крови [8], [10]. Предыдущее исследование показало, что фосфорилирование STAT-3 и экспрессии белка VEGF увеличиваются в человеческой ткани рака желудка, что в свою очередь возвысить ангиогенный фенотип и способствуют развитию рака желудка и прогрессии [11]. С другой стороны, некоторые фосфатазы, как известно, опухолевые супрессоры и могут играть важную роль в ингибировании или контроля роста рака [12] - [15]. Протеин тирозин фосфатазы (PTPs), в том числе SH2 домена содержащих тирозин фосфатазы (SHP) -1 и SHP-2, способны негативно регулирует передачу сигналов STAT на тирозин дефосфорилирование нескольких компонентов в соответствующих сигнальных путей [13] - [15] , Непрерывная активация Stat-3 в опухолях можно было бы достичь, по крайней мере частично за счет потери функции этих фосфатаз. Кальпаином II было показано, играют определенную роль в эндоплазматической сети (ER) стресс-регулируемых онкогенеза, который участвует в механизме хонокиол подавленного желудка онкогенеза [16]. Кроме того, предыдущее исследование также показало, что ШП-1 является эндогенным субстратом для кальпаином следующих А23187-индуцированной активации тромбоцитов [17]. Поэтому калпаин /SHP-1-регулируемый STAT-3 и VEGF, путь может быть вовлечен в ангиогенеза, роста и перитонеальный распространение клеток рака желудка.
<Р> Honokiol, небольшой молекулярной массой натуральный продукт, является основным активным biphenolic соединение <ЕМ> магнолии лекарственный
, который, как известно для улучшения микробной инфекции, воспаление и желудочно-кишечные расстройства в традиционных азиатских лекарственных систем [18]. Наше предыдущее исследование показало, что гонокиол ингибирует желудочную туморогенез активацией 15-липоксигеназы-1 и последующее торможение пролиферации пероксисом активированный рецептор-и ЦОГ-2-зависимых сигналов [19]. Honokiol было показано, чтобы вызвать стресс ER и вызвать калпаин-II-опосредованную глюкозой регулируется белком-94 расщеплению и апоптоз в раковых клетках желудка человека [16]. Было показано, что экспрессия VEGF может реагировать на питательных условиях лишения, которые вызывают стресс ER [20], [21]. Более того, ER стресс активатор туникамицина было установлено, заметно предотвратить развитие микрососудов, предполагая, что это ER стресс индуктор может иметь потенциальную роль в лечении опухоли молочной железы [21]. Эффекты хонокиол на ER стресс-коррелируют ангиогенеза и метастазирования опухоли желудка до сих пор неясны. Здесь мы предположили, что хонокиол ингибирует ангиогенез и перитонеальный распространение клеток рака желудка через кальпаина /SHP-1-регулируемого STAT-3 и VEGF пути. Результаты показали, что хонокиол заметно тормозится ангиогенез и перитонеальный распространение клеток рака желудка с помощью кальпаина /SHP-1 взаимодействия активированного STAT-3 дефосфорилирование и VEGF понижающей регуляции пути.
хонокиол Заблокированные перитонеальные метастазы рака желудка <ЕМ> в естественных условиях Предыдущие исследования показали сильную корреляцию между активированным STAT-3 и развитие кровеносных сосудов фенотипа [11]. Кроме того, мы выяснен эффект гонокиол на фосфорилирование STAT-3 в клеток рака желудка человека (MKN45 и AGS) и HUVECs. Как показано на рисунке 6, гонокиол уменьшило тирозин (Tyr705) фосфорилирование STAT-3 в зависимости от времени с приблизительно двукратному снижению в течение 1-2 ч в AGS клетках (рис. 6, а), и от 3 до 10- кратное уменьшение на 0,5-24 ч в MKN45 клетках (рис. 6б). Удивительно, но гонокиол индуцированной STAT-3 дефосфорилирование Tyr705, но не Ser727, остатки в этих человеческих клеток рака желудка. Тем не менее, хонокиол одновременно ингибирует как Tyr705 и Ser727 фосфорилирования Stat-3 в HUVECs (рис. 6в). Количественный анализ белковых полос в Вестерн-блот с использованием Image-Pro Plus программного обеспечения показан на рисунке 7. Результаты анализа с помощью конфокальной микроскопии показал также, что хонокиол отменили тирозин (Tyr705) фосфорилирование Stat-3 в AGS клетках и HUVECs (рис . 8А). Клетки и культура
<р> Рак часто характеризуется повышенным поглощением [ 18F] фтор-2-дезокси-D-глюкозы (ФДГ), и [ 18F] -FDG /ПЭТ может служить в качестве суррогатной меры терапевтической эффективности. Функциональная возможность небольшого изображения животных с использованием клинического ПЭТ /КТ сканер с ФДГ оценивали. Были исследованы четыре группы мышей для перитонеального экспериментов метастазирования. Заявление /картина ситуации метастаз было показано на рисунке 1. Мы использовали [ 18F] -FDG-ПЭТ /КТ для выявления перитонеального метастазов у мышей, зараженных клеток рака желудка человека (MKN45 или SCM-1) с или без хонокиол лечение. Как показано на рисунке 2, максимальная проекция интенсивность была сгенерирована из типичных репрезентативных мышей. Перитонеальный метастаз был отмечен у контрольных мышей (левая панель), и это было эффективно отменено лечения гонокиол (правая панель). Эти изображения ясно показали, что неинвазивные [ 18F] -FDG перитонеальных поглощений метастатических опухолей у контрольных мышей были значительно выше, чем те, в гонокиол обработанных мышей. Количественное определение интенсивности показано на фигуре 3А. Внутрибрюшинное введение гонокиол (5 мг /кг, в два раза /неделю) значительно снижены расчетные счетчики радиоактивности и конкретные величины поглощения (SUV), определяемых ФДГ-ПЭТ /КТ у мышей, инокулированных клеток рака желудка (рис. 3). К тому же, многие метастатические узелки были обнаружены в брюшную полость (брыжейки) контрольных мышей, привитых MKN45 и SCM-1 (фиг. 2) клеток. В отличие от этого, наблюдались перитонеальные опухолевые узелки эпизодически у мышей, обработанных гонокиол. Количественное узелков на поле показан на рисунке 3B.
Honokiol Ингибированная ангиогенез В естественных условиях
, ех естественных условиях
и в пробирке
<р> эндотелиальные клетки имеют решающее значение для процесса ангиогенеза, который необходим для роста опухоли и метастазов. Далее мы исследовали ангиогенный эффект хонокиол с использованием хорионалантоисной анализа мембраны ( CAM
анализ), Матригель плагин анализа, аортального кольца всходов анализ и формирование эндотелиальных клеток трубки. Как показано на рисунке 4A, хонокиол эффективно ингибирует нео-сосудистые образования в CAM
анализа без какого-либо видимого эффекта на ранее существовавших кровеносных сосудов. Количественный анализ показал, что гонокиол вызвало 2,5-кратное уменьшение количества вновь образованных кровеносных сосудов по сравнению с таковым в контрольной среды.
<Р> В анализе Матригель пробки, Матригель содержащий VEGF (100 нг /мл геля) с или без гонокиол (10 мкг /мл) подкожно имплантировали голым мышам. Через 21 дней после имплантации, образованные Матригель пробки были иссечены и фотографировали. Вилки с только VEGF были заметно прослойками, сосудистые и красного цвета. Пробки, содержащие VEGF и хонокиол были бледными, что указывает на отсутствие или образование кровеносных сосудов меньше (рис. 4В-а). Мы также исследовали плотность сосудов и морфология сосудов в секциях ШТЫРЕВОГО H &усилителя; E окрашивания и иммуногистохимического окрашивания с антителом против CD31, эндотелиальной клетки маркером. Васкуляризации в гонокиол + VEGF группе была значительно снижена по сравнению с одной только группой VEGF (рис. 4В-б). Количественное васкуляризации путем подсчета сосудов и представленные эндотелиальные клетки показали, что сосудистая плотность в хонокиол группе, получавшей значительно снизилась (. 4B-с и 4B-d рис).
<Р> Далее, индуцируют эндотелиальные клетки вырастать из изолированных крыс аортального кольца в присутствии Matrigel и ECGM (среда для роста эндотелиальных клеток), содержащих развитие кровеносных сосудов, цитокины, такие как VEGF и основного фактора роста фибробластов. Обширные эндотелиальные клетки отросток из аорты крысы кольцевых эксплантов наблюдалось в контрольной группе (фиг. 5А). Лечение Honokiol привело к значительному (~five раза) уменьшению эндотелиального выроста и прорастает из колец аорты (рис. 5А и 5С). Кроме того, морфологической дифференциации образования эндотелиальных клеток трубки исследовали с использованием двумерного метода Матригель. Как показано на рисунке 5В, засев HUVECs в Матригель привело к формированию структуры сосудистой трубчатым. Honokiol эффективно ингибирует образование эндотелиальных клеток трубки за счет уменьшения трубчатую структуру, по длине и ширине (рис. 5В и 5D).
Honokiol упразднена STAT-3 Сигнализации в клетках человека рак желудка, HUVECs, и Опухоли
<р> Мы исследовали далее фосфорилирование STAT-3 в перитонеальных метастатических опухолей, выделенных из голых мышей, инокулированных клетками MKN45 с или без гонокиол (5 мг /кг) лечения. Иммуногистохимическое анализ показал, что р-STAT-3 избыточная экспрессия и накопление в области опухоли, в том числе ядер и цитоплазмы, была значительно отменено хонокиол обработки (рис. 8б). В Вестерн-блоттинга анализа, гонокиол заметно снижало накопление р-STAT3 в опухолях по сравнению с контролем-носителем (рис. 9а). Выражение конститутивной STAT3 не была затронута. Кроме того, активность связывания ДНК Stat-3 было дополнительно подтверждено с помощью EMSA. Как показано на фиг.9В, гонокиол заметно ингибирует увеличение ДНК-связывающую активность Stat-3 в раковых клетках желудка человека. Honokiol также ингибирует VEGF-увеличилась Stat-3 ДНК-связывающую активность в HUVECs (рис. 9б).
Honokiol Индуцированные ШП-1-регулируемые STAT-3 Дефосфорилирование в желудочном Раковые клетки, эндотелиальные клетки, и Опухоли
<р> SHP-1 не является трансмембранный PTP [12]. Далее мы исследовали, может ли хонокиол регулировать экспрессию и активность SHP-1. Как показано на фигуре 10А, гонокиол усиливал экспрессию белка SHP-1, но не SHP-2, в HUVECs и AGS клетки в зависимости от времени. Фармакологическая ингибитор ПКМ и ШП-1 миРНК трансфекции эффективно отменили хонокиол-индуцированной STAT-3 дефосфорилирование в HUVECs и AGS клеток (рис. 10B-а). Аналогичные результаты в клетках SCM-1 и SV-40 увековечили микрососудистых эндотелиальных клеток мыши (SVECs), обработанных хонокиол показаны на рисунке 10b-б. Далее мы исследовали, является ли эндогенный ШП-1 модулируется хонокиол. Honokiol был способны вызвать активность ШП-1 в клетках рака желудка, HUVECs и SVECs в зависимости от времени (фиг. 11А). Honokiol также усиливает экспрессию ШП-1 белка в перитонеальных метастатических опухолей, выделенных из MKN45-привитых мышей как показали иммуногистохимического анализа (рис. 11б). Кроме того, мы исследовали взаимодействие между SHP-1 и STAT-3 с использованием методов совместного иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга. Как показано на рисунке 11С, ШП-1 специфически связан с Stat-3 в клетках AGS и HUVECs в присутствии гонокиол по сравнению с IgG-контролем.
Honokiol Измененное Е.Р. Морфология, индуцированный кальпаином-II-регулируемых ШП -1-индуцированной STAT-3 Дефосфорилирование, и снижение VEGF Generation
<р> Предыдущие исследования показали, что ER стресс играет важную роль в ангиогенеза [20], [21]. Далее мы исследовали влияние хонокиол на ER микроструктуры с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Как показано на рисунке 12А, ER дилатация и фрагментация были выставлены в хонокиол обработанных SCM-1 клеток рака желудка и HUVECs.
<Р> Мы также хотели, чтобы определить, требуется ли активация калпаина-II для ШП-1 активности в хонокиол -обработанной клетки. Фармакологическая ингибитор калпаина и калпаина-II миРНК трансфекции эффективно уменьшить хонокиол повышенной ШП-1 активность в AGS клетках и HUVECs (рис. 12б). Клетки, обработанные рекомбинантным кальпаина-II, в качестве положительного контроля, показал увеличение 4 до 5-кратного в ШП-1 активность (рис. 12, б). СЭФР, как известно, содержат промотор сайт связывания STAT-3. Далее мы исследовали, может ли хонокиол регулировать экспрессию VEGF. Honokiol значительно снижало поколение VEGF в AGS клетках и HUVECs, и этот эффект был отменено ШП-1 миРНК трансфекции (рис. 12в). Кроме того, трансфекция мутантной-STAT-3 плазмиды в клетки также ингибируют выработку VEGF. Сочетание гонокиол с мутантом-STAT-3 плазмиды трансфекции в клетках синергически сократила производство VEGF по сравнению с либо только лечения (рис. 12в). Для дальнейшего подтверждения взаимодействия между кальпаина-II и ШП-1, совместно иммунопреципитации и Вестерн-блоттинг проводили в желудочном раковых клеток. Как показано на рисунке 12D, калпаин-II была специфически связана с ШП-1 в AGS клетках в присутствии гонокиол (20 мкМ), по сравнению с IgG-контролем. Аналогичным образом, хонокиол-индуцированной калпаина /SHP-1 взаимодействие было также найдено в HUVECs (данные не показаны).
Обсуждение
<р> Honokiol является одним из основных компонентов Магнолия лекарственный
, который является переходным медицина в Азии [18]. Honokiol обладает антиоксидантные и противовоспалительные эффекты в пробирке
и В естественных условиях
[22] - [25]. Honokiol было показано, обладает потенциальной антипролиферативной активностью в отношении эндотелиальных клеток в пробирке игровые новости и противоопухолевые эффекты против ангиосаркомой у голых мышей [26]. В этом исследовании мы показали впервые, что гонокиол является сильным ингибитором ангиогенеза и перитонеальные метастазы рака желудка. Наше исследование было сосредоточено на эффектах и возможных механизмах хонокиол на перитонеальном метастазирования и ангиогенеза с использованием ПЭТ /КТ, CAM
анализа, Матригель плагин анализа, аортального кольца эндотелиальные клетки прорастают анализа, клеточной трубки анализ эндотелиальной образование, и в пробирке
экспериментах с клетками. Результаты показали, что гонокиол может подавлять ангиогенез и перитонеальный распространение через калпаин-II-активированной ШП-1 активации сигнального каскада. Активация фосфатазы ШП-1 путем гонокиол далее привело к понижающей регуляции STAT-3 активации и СЭФР производства, что приводит к ингибированию ангиогенеза и перитонеальный метастаз. Тем не менее, ингибирование ангиогенеза и ингибирование метастатического потенциала раковых клеток хонокиол могут быть отдельные аспекты, один из которых эффект хонокиол на ангиогенез непосредственно и другой эффект хонокиол на раковые клетки.
<Р> В течение последних нескольких лет, ряд исследований показал, что конститутивной активации семейства STAT, особенно STAT-3, связан с клеточной пролиферации, ангиогенеза и метастазирования [10], [11], [27] - [30]. Увеличение активации экспрессии STAT-3 было обнаружено в различных опухолевых клеток, полученных и образцов из раковых тканей человека. Дерегулированы активации STAT-3 было предложено играть важную роль в избыточной экспрессии VEGF и увеличение кровеносных сосудов фенотипов рака желудка, что может способствовать развитию рака желудка и прогрессии [11]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что хонокиол может эффективно ингибировать фосфорилирование Stat-3 в HUVECs (как Tyr705 и Serine727 сайтов), клеток рака желудка человека (Tyr705 участка) и перитонеального метастатических опухолей (Tyr705 сайт). По мере того как онкогенными активации тирозинкиназ является общим признаком при раке, мы сосредоточились на роли Tyr705 фосфорилирования Stat-3.
<Р> SHP-1 обладает потенциальной функцией супрессор опухолей и является негативным регулятором JAK /STAT сигнального пути [15]. Кроме того, было показано, что ШП-1 фосфатазы может связываться с фосфорилированным доменом Y1173, что приводит к EGFR дефосфорилирование [31]. Y429 в цитоплазматическом домене рецептора эритропоэтина было высказано предположение, что сайт связывания протеинтирозинфосфатазы SH-PTP1, которые могут играть важную роль в прекращении пролиферативных сигналов [32]. ШП-1 также было показано, что антагонист фактора роста сигнализации в эпителиальных и гемопоэтических клеток [15]. ШП-1 была особо отмечена как потенциальный физиологический антагонист VEGFR сигнализации [33]. В эндотелиальных клетках, ШП-1 физически связан с VEGFR2 и также необходим для обоих ФНО-опосредованный и тканевого ингибитора металлопротеиназ (ТИМП) опосредованной ингибирования ангиогенеза [31]. Таким образом, активация ШП-1 может иметь важные последствия для регуляции пролиферации и ангиогенеза. В этом исследовании мы обнаружили, что гонокиол специально усиливал экспрессию SHP-1, но не SHP-2, в желудочном раковых клетках, эндотелиальных клетках и перитонеальных метастатических опухолей. Эти данные позволяют предположить, что гонокиол могут ингибировать ангиогенез эндотелиальный клеток и клеток метастазов рака, который может быть через ШП-1-индуцированной Stat-3 понижающая регуляция пути.
<Р> Предыдущие исследования предложили важную роль для ER стресса в молекулярный механизм ангиогенеза и роста раковых клеток [16], [20], [21]. Кояма и его коллеги также предположили, что ER стресс-индуцированного нарушения кальция могут быть вовлечены в индукции накопления амилоида бета и экспрессии ангиогенного фактора в развитие пигментного эпителия сетчатки [34]. Недавнее исследование показало, что ER стресс-регулируемых сигнализации ИРЭ-1α обладает важной функцией в плацентарной развития и эмбриональной жизнеспособности, подчеркивая связь ER стресса и ангиогенеза в плаценте во время беременности [35]. Ким и его коллеги показали, что оба ШП-1 и SHP-2 являются эндогенными субстратами для кальпаином, который участвует в контексте энтамеба гистолитика
индуцированная гибель клеток хозяина [36]. Следует отметить, что калпаины становятся активными, когда внутриклеточный кальций ([Са 2 +] я) концентрация повышена; м-калпаина (калпаина II) требует [Са 2 +] я в миллимолярной диапазоне, но микромолярные концентрации [Са 2 +] я достаточно для активации μ-кальпаина (кальпаина I) [37 ], [38]. Было показано, что высокий уровень [Са 2+], препятствует активности протеинкиназы тирозина в результате активации кальпаина во время стимуляции ионофором в тромбоцитах [39]. Honokiol был способен индуцировать [Са 2 +] мобилизации я в нервных клетках [40]. В последнее время туникамицина сообщалось ингибирует ангиогенез в естественных условиях
. Наше предыдущее исследование показало, что хонокиол индуцирует апоптоз раковых клеток желудка человека и ингибирует туморогенез через кальпаина опосредованной глюкозы регулируется белком-94 расщеплению [16]. В настоящем исследовании мы прямолинейно показали, что ER были расширены и фрагментированной хонокиол лечение рака желудка клеток и HUVECs. Кроме того, фармакологическая ингибитор кальпаином и калпаина-II миРНК трансфекции эффективно уменьшить хонокиол повышенной ШП-1 активность в клетках рака желудка и HUVECs. Следует отметить, что наши результаты впервые показали, что калпаина /SHP-1 взаимодействие непосредственно вызвано хонокиол ингибирования STAT-3 фосфорилирования в клетках рака желудка. Эти результаты указывают на то, что гонокиол может вызвать стресс ER и вызвать калпаин-II-активированный ШП-1 активность в желудочном раковых клеток и эндотелиальных клеток.
<Р> В заключение, результаты данного исследования обеспечивают в естественных условиях , исключая виво
и в пробирке
доказательства для ингибирования ангиогенеза и перитонеальный распространение клеток рака желудка путем хонокиол и молекулярной основы для его последствий. Эти данные подчеркивают причастность ER кальпаином и протеинтирозинфосфатазы ШП-1 сигнализации в хонокиол-тормозится STAT-3 и активации VEGF производства в желудочном раковых клеток и эндотелиальных клеток (рис. 13). Эти данные также свидетельствуют о том, что вниз регулирование Stat-3 и VEGF сигнализации, индуцированный кальпаином /SHP-1 может быть перспективным терапевтической стратегией для лечения рака желудка.
Материалы и методы
<р> желудка человека линии клеток рака, включая кавказского клеточной линии (AGS, умеренно /плохо (смешанных) дифференцированных клеток аденокарциномы) и азиатским клеточных линий (MKN45 и SCM-1, недифференцированные клетки аденокарциномы) были получены из банк клеток Тайбэй ветеранов больницы (Тайвань). Клетки поддерживали в среде RPMI1640, содержащей 10% FCS и стрептомицин /пенициллин в увлажненной 5% CO <суб> 2 атмосферы.
<Р> HUVECs были получены из пупочной вены мозга путем обработки коллагеназой, как описано ранее [41]. Это исследование соответствует принципам использования человеческих тканей, изложенных в Декларации Хельсинки. Протокол исследования был одобрен Советом по этике рассмотрению Тайчжун ветеранов больницы, Тайчжун, Тайвань (утвержден документ TCVGH-C0062-1). были использованы HUVECs в третьем проходе. Эффективность трансфекции (> 80%) с помощью реагента липофектина (Invitrogen), была определена на третьем проходе. В некоторых экспериментах, СВ-40 иммортализованные мыши микрососудистых эндотелиальных клеток (SVECs) культивировали в среде Игла в модификации Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина /стрептомицина. клеточная линия SVEC была любезно подарена доктором KH Lan (онкологический центр, Taipei ветеранов больницы, Тайвань).
<р> Honokiol получали из Wako Chemical Company (Осака, Япония), и оно было определено, что по крайней мере, 99% чистоты по данным ВЭЖХ. Различные концентрации гонокиол были использованы в этом исследовании, в зависимости от чувствительности к лекарству, обозначенном значений IC50 (20 мкМ в AGS, 40 мкМ в MKN45 и SCM-1). MKN45 и SCM-1 клетки, но не AGS клетки, было показано, что эффективно вызывать опухоли в мышиной модели опухоли ксенотрансплантата.
Животные
<р> Все по уходу за животными и экспериментальные процедуры были одобрены и проведены Комитет по Эксперименты на животных, Национальный университет Чжунсин, Тайчжун, Тайвань (утвержденный документ Nchu-100-26). От четырех до шести недельных самцов мышей BALB /с голых мышей были приобретены у NLAC (Тайбэй, Тайвань). Мышей выращивали и поддерживали под конкретного патогена условиях, при условии, стерилизованной пищи и воды вволю
и помещен в барьерном объекте с 12 ч циклом свет /темнота.
ксенотрансплантата опухоли Мышь Модель
<р> Для оценки перитонеальные метастазы, культивированные клетки рака желудка человека (4~5 × 10 6 клеток) прививали в брюшную полость BALB /C голых мышей [42]. Перитонеальный опухоли у голых мышей, были установлены в течение 7 дней после инъекции клеток рака желудка, в которых опухоли были проверены наблюдением ПЭТ /КТ. Затем мышам вводили внутрибрюшинно гонокиол (5 мг /кг /два раза в неделю) в течение 28 дней. Эффект гонокиол на брюшную распространение оценивали с помощью ПЭТ /КТ. Заявление /картина ситуации метастазирования была описана на рисунке 1. Затем мышей умерщвляли под анестезией (фенобарбиталом) и исследовали макроскопически на наличие перитонеального метастазирования. Опухоли вырезают, разрезают на блоки, фиксировали в 10% формалине и заливали в парафиновые блоки или быстро замораживают в жидком азоте.
позитронно-эмиссионной томографии /компьютерной томографии (ПЭТ /КТ)
<р> После того, как по крайней мере 6 часов голодания, мышам дали 7,4 МБк (0,2 мКи) дозу 18F-ФДГ перорально перед промывкой 1 мл воды. Мышей анестезировали изофлуран испарителем перед каждым сканированием. Эксперименты для маленьких изображений животных были выполнены с помощью комбинированного сканера ПЭТ /КТ (Discovery ST; GE Medical Systems). Используют многодетекторная ряд спиральной КТ. Технические параметры, используемые в КТ части ПЭТ /КТ распределились следующим образом: КТ типа сканирования с 0,5-второй полной спиральной развертки, конфигурации детектора строки 16 × 1,25 мм, интервал пространстве 2,75 мм, толщина среза 1,25 мм , с шагом 1.75:1 (режим высокого качества), скорость 17,5 мм за один оборот, большое поле-обзора (FOV), напряжение 120 кВп и ток 200 мА. Технические параметры, используемые для части ПЭТ ПЭТ /КТ распределились следующим образом: 10,0 мин в каждой кровати, то FOV выбран для реконструкции изображения составляет 20 см, а разрешение ПЭТ составляла около 4,5 мм полная ширина на половине максимума (FWHM). Реконструктивной параметры были типа 3D итерации, как 21 подмножеств и 2 итераций. Для оценки количественного определения способности /КТ сканера ПЭТ в небольших изображений животных, область интереса (ROI) был сделан на более мелкие FOV трансаксиальной ПЭТ изображений полностью окружают области поглощения ФДГ в наблюдаемых тканях, избегая при этом соседние ткани. Среднее значение активности каждого пикселя в пределах каждого ROI был записан и выражается как Бк /мл.
хорионалантоисной Мембрана анализа ( CAM
анализ)
<р> Чтобы исследовать в естественных условиях
развитие кровеносных сосудов, активность, модифицированный цыпленок целое животное САМ
анализ проводили, как описано ранее [43]. Оплодотворенные куриных яиц инкубировали в непрерывно увлажненный яичного заводчика при 37 ° С. В 3-х дней инкубации куриных эмбрионов переносили в чашку для культивирования. Двадцать мкл гонокиол захвачена в типе коллагена смесь наносили на диски покрытий и полимеризуется при нагревании. Диски были загружены на CAM
6-дневных эмбрионов. После 24-часовой инкубации, область вокруг загруженного диска была сфотографирована с цифровой камерой Nikon, а число вновь образованных сосудов подсчитывали двумя наблюдателями двойным слепым методом. Анализы для каждого испытуемого образца проводили с использованием 10-13 яиц.
Матригель штепсельной вилки пробирного
<р> Голых мышей или мышей C57BL /6 вводили подкожно 0,6 мл Матригель, содержащей указанное количество капсаицина , 100 нг СЭФР, и 10 единиц гепарина. Вводимый Матригель быстро образуется единый, твердый гель пробку. После 7-21 дней, кожа мыши легко отстранился, чтобы выставить Матригель пробку, которая осталась без изменений. Гемоглобин измеряли с использованием метода Drabkin и набора для Drabkin реагента 525 (Sigma, St Louis, MO) для количественного измерения образования кровеносных сосудов. Концентрацию гемоглобина вычисляли из известного количества гемоглобина анализируемой параллельно. Изображения были сфотографированы с помощью цифрового фотоаппарата Nikon, а число вновь образованных микрососудов подсчитывали.
Ex Vivo
аортального кольца Анализ
<р> аорте были выделены из 6 -недельный-старые Sprague-Dawley крыс. Плиты (48-луночные) покрывали 120 мкл Matrigel. Аорте, выделенные из мышей были очищены от periadventitial жира и соединительных тканей и нарезают в ~ 1 мм длинной до 1,5 мм длинных колец. После того, как промывать пять раз с клеточной среде на основе эндотелиального аорты были помещены на Матригель покрытые лунки, покрытые еще 100 мкл Matrigel. Honokiol или транспортное средство было добавлено в лунки в конечном объеме 250 мкл среды.
Пациенты с СРК могут получить пользу от добавок витамина D,
Первоначальные результаты проекта «Микробиом человека» вызвали «сотни последующих исследований».
Новый инструмент для расшифровки микробиома кишечника
Микропластик впервые обнаружен в отходах жизнедеятельности человека
Новые взаимодействия хозяина, вируса и микробиома во время COVID-19 могут определить исход
Почему вы должны включать в свой рацион натуральные источники клетчатки
Подробная карта микробиома человеческого языка
Новое исследование, опубликованное в журнале Отчеты по ячейкам в марте 2020 года сообщает об использовании передовых и быстрых методов спектральной визуализации для разработки подробной карты микроб
Анти-коронавирусные молекулы микробов могут стать ключом к новым методам лечения
Микробы в кишечнике, которые производят полезные соединения, могут стать ключом к лечению симптомов коронавируса. Микробиом кишечника. Изображение предоставлено:Anatomy Image / Shuttersto
Страны с более старым населением имеют более высокий уровень инфицирования и смертности от SARS-CoV-2,
говорит исследование Прошло больше года после начала пандемии коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванный тяжелым острым респираторным синдромом коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), Стало очевидны