PLoS ONE: kalpain /SHP-1 Interaksjon med Honokiol dempe Peritoneal Formidling av magekreft i nu /nu Mice

Abstract

Bakgrunn

Honokiol, en liten molekylvekt naturprodukt, har tidligere blitt rapportert å aktivere apoptose og hemmer mave tumorigenesis. Enten honokiol hemmer angiogenese og metastasering av magekreftceller forblir ukjent.

metodikk /hovedfunnene

Vi testet effekten av honokiol på angiogen aktivitet og peritoneal formidling ved hjelp av in vivo, ex vivo Hotell og in vitro
analysesystemer. Signalerings reaksjoner i humane magecancerceller, ble humane navlestreng vaskulære endotelceller (HUVECs), og isolerte tumorer detektert og analysert. I en xenograft gastric svulst musemodell, honokiol vesentlig hemmet peritoneal formidling oppdaget av PET /CT-teknikk. Honokiol også effektivt dempet den angiogenese oppdaget av chick chorioallantoic membran analysen, mus Matrigel plugg analysen, rotte aorta ring endotelceller spirende analysen, og endotelceller tube-analysen. Videre honokiol effektivt forsterket signal transduser og aktivator av transkripsjon (STAT-3) defosforylering og hemmet STAT-3 DNA-bindende aktivitet i humane magecancerceller og HUVECs, som ble korrelert med oppregulering av aktiviteten og protein ekspresjon av Src-homologi 2 (SH2) -inneholdende tyrosin fosfatase-1 (SHP-1). Kalpain-II-hemmer og siRNA transfeksjon reversert honokiol-indusert SHP-1 aktivitet betydelig. Den reduserte STAT-3 fosforylering og økt SHP-1 uttrykk ble også vist i isolerte peritoneal metastatiske svulster. Honokiol var også i stand til å inhibere VEGF-produksjon, noe som kan bli reversert ved SHP-1 siRNA transfeksjon.

Konklusjoner /Betydningen

Honokiol øker ekspresjon og aktivitet av SPH-1 som ytterligere deaktiverer STAT3 pathway. Disse funnene tyder også på at honokiol er en roman og potent hemmer av angiogenese og peritoneal formidling av magekreftceller, og gir støtte til anvendelsespotensial for honokiol i magekreft terapi

Citation. Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et al. (2012) kalpain /SHP-1 Interaksjon med Honokiol dempe Peritoneal Formidling av magekreft i nu /nu
Mus. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10,1371 /journal.pone.0043711

Redaktør: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Tyskland

mottatt: 17 januar 2012; Godkjent: 24 juli 2012; Publisert: 24 august 2012

Copyright: © Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra Taichung Veterans General Hospital, Taiwan (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) og National Science Council of Taiwan (NSC99-2320-B-005-003-My3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

De fleste pasientene (-60%) med magekreft er diagnostisert med sent stadium sykdommen. Magekreft er den nest vanligste årsaken til global kreftdødelighet i utviklede land og viser metastatisk sykdom ved diagnosetidspunktet [1]. Kirurgi og kombinasjons chemotherapies for magekreft har vist seg å gi beskjedne overlevelse fordeler i avanserte tilfeller, og nesten 50% av pasientene fortsatt dø etter tilbakefall [2], [3]. En viktig form for gjentakelse er peritoneal formidling. Kreftvekst og peritoneal metastase er angiogenese avhengige, en prosess som involverer flere angiogene faktorer, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), epidermal vekstfaktor (EGF), basisk fibroblast vekstfaktor, prostaglandin E2, interleukin-8, kjemokin (CXC motiv) ligand 1, og den matriks-metalloproteinase-familien [4] - [6]. Flere molekylsignaler, for eksempel signal transduser og aktivator av transkripsjon-3 (STAT-3), nukleær faktor-Eb, Akt, mitogenaktiverte proteinkinaser, cyklooksygenase-2, lipoxygenase, induserbar nitrogenoksid-syntase, tumornekrosefaktor og annet , har også blitt vist å være involvert i tumorprogresjon og angiogenese [7] - [9]. Men de cellulære og molekylære mekanismer for utvikling, progresjon og metastasering av magekreft fortsatt gjenstår å avklare.

Janus-aktivert kinase (Jak) /STAT signalveien spiller en viktig rolle i reguleringen av cellevekst, angiogenese, differensiering, migrering og metastase [10]. Konstitutiv aktivering av STAT veier, særlig STAT-3, er forbundet med et bredt spekter av humane maligniteter. Vedvarende STAT-3-fosforylering er observert i forskjellige humane kreftformer, slik som faste tumorer i mage, tykktarm, lever, prostata, bryst, lunge, og hode og nakke, samt blod maligniteter [8], [10]. Foregående studie har vist at fosforylering av STAT-3 og VEGF-protein ekspresjon økes i human magekreft vev, som i sin tur heve den angiogene fenotype og bidra til magekreft utvikling og progresjon [11]. På den annen side er visse fosfataser kjent for å være kreft suppressorer og kan spille en viktig rolle ved inhibering eller kontroll av kreft vekst [12] - [15]. Protein tyrosin fosfataser (PTP), inkludert SH2 domene som inneholder tyrosin fosfatase (SHP) -1 og SHP-2, er i stand til å negativt regulere STAT signalering av tyrosin defosforylering av flere komponenter i de relaterte signalveier [13] - [15] . Den kontinuerlige aktivering av STAT-3 i tumorene kan legges til rette i det minste delvis ved tap av funksjon av disse fosfataser. Calpain II har vist seg å spille en rolle i endoplasmatisk retikulum (ER) spenning regulert tumorgenese, som er involvert i mekanismen for honokiol-inhiberte gastrisk tumorigenesis [16]. I tillegg har tidligere studie viste også at SHP-1 er en endogen substrat for calpain følgende A23187-indusert blodplateaktivering [17]. Derfor er en kalpain /SHP-1-regulert STAT-3 og VEGF reaksjonsvei kan være involvert i angiogenese, vekst, og peritoneal formidling av gastrisk kreft celler.

Honokiol, en liten molekylvekt naturprodukt, er en større aktiv biphenolic forbindelse av Magnolia officin
, som er kjent for å lindre mikrobiell infeksjon, betennelse og gastrointestinale forstyrrelser i tradisjonelle asiatiske medisinske systemer [18]. Vår tidligere studien viste at honokiol hemmer mave tumorigenesis ved aktivering av 15-lipoksygenase-1 og derav følgende hemning av peroksisom proliferator-aktiverte reseptor-a og COX-2-avhengige signaler [19]. Honokiol har vist seg å indusere ER stress og utløse kalpain-II-mediert glukoseregulerte protein-94 spalting og apoptose i humane magecancerceller [16]. Det har blitt vist at VEGF-ekspresjon kan være mottakelig for næringsmangel betingelser, noe som forårsaker ER stress [20], [21]. Videre har ER stress aktivatoren tunicamycin blitt funnet å vesentlig forhindre mikrovaskulaturen utvikling, noe som tyder på at dette ER stress-indus kan ha en potensiell rolle i brysttumorbehandling [21]. Effektene av honokiol på ER stress-korrelert angiogenese og mage metastase er fortsatt uklart. Her hypotese vi at honokiol hemmer angiogenese og peritoneal formidling av magekreftceller gjennom en kalpain /SHP-1-regulert STAT-3 og VEGF veien. Resultatene viste at honokiol markert hemmet angiogenese og peritoneal formidling av magekreftceller via en kalpain /SHP-en interaksjon aktivert STAT-3 defosforylering og VEGF nedregule veien.

Resultater

Honokiol blokkert Peritoneal metastasering av magekreft in vivo

Kreft er ofte preget av økt opptak av [ ^{18F] fluor-2-deoksy-D-glukose (FDG), og [ 18F] -FDG /PET kan tjene som et surrogat mål for terapeutisk effekt. Den funksjonelle muligheten for små dyr bildebehandling ved hjelp av en klinisk PET /CT-skanner med FDG ble evaluert. Fire grupper av mus for peritoneale metastase eksperimenter ble undersøkt. En uttalelse /bilde av metastase situasjonen ble vist i figur 1. Vi utnyttet [ 18F] -FDG-PET /CT for å påvise peritoneal metastaser hos mus inokulert med menneskelige mage kreftceller (MKN45 eller SCM-1) med eller uten honokiol behandling. Som vist i figur 2 ble maksimal intensitet fremspring som genereres fra typiske representative mus. Den peritoneal metastaser ble markert i kontrollmusene (venstre panel), og det ble effektivt omgjøres av honokiol behandling (høyre panel). Disse bildene tydelig viste at ikke-invasiv [ 18F] -FDG uptakes i peritoneal metastatiske svulster i kontrollmusene var mye høyere enn de i honokiol-behandlede mus. Kvantifiseringen av intensitet er vist i figur 3A. Intraperitoneal injeksjon av honokiol (5 mg /kg, to ganger /uke) i betydelig grad redusert de beregnede radioaktivitetstellinger og spesifikt opptak verdier (SUV) bestemt ved FDG-PET /CT i mus inokulert med magecancerceller (Fig. 3). Videre ble mange metastatiske noduler som finnes i det peritoneale hulrom (mesenteriet) av kontroll mus inokulert med MKN45 og SCM-1 (fig. 2) celler. I motsetning til dette, ble peritoneale tumorknuter observert sporadisk i mus behandlet med honokiol. Kvantifisering av knuter per felt er vist i figur 3B.}

Honokiol hemmet Angiogenese in vivo
, ex vivo
, og in vitro

Endotelceller er kritiske for den angiogene prosess, noe som er nødvendig for tumorvekst og metastase. Vi neste undersøkte angiogene effekten av honokiol hjelp av dama chorioallantoic membranen assay ( CAM
assay), Matrigel plugg analysen, aortic ring spirende analysen, og endotelceller tube formasjon. Som vist i figur 4A, honokiol effektivt hemmet neo-vaskulære dannelse i CAM
analysen uten noen synlig effekt på pre-eksisterende blodkar. Kvantitativ analyse viste at honokiol forårsaket en 2,5 gangers nedgang i antall nylig dannede blodkar sammenlignet med den for mediumkontroll.

I Matrigel pluggen analysen, Matrigel inneholdende VEGF (100 ng /ml gel) med eller uten honokiol (10 ug /ml) ble subkutant implantert i nakne mus. Etter 21 dagers implantering, ble de dannede Matrigel pluggene skåret ut og fotografert. Plugger med VEGF alene var markert stripete, vaskulær og rød i fargen. Plugger inneholdende VEGF og honokiol var blek, noe som indikerer ingen eller mindre blodkardannelse (Fig. 4B-a). Vi har også undersøkt skipet tetthet og fartøy morfologi i plug deler av H & E farging og immunhistokjemisk farging med et antistoff mot CD31, en endotelcelle markør. Den vaskularisering i honokiol + VEGF-gruppen ble betydelig redusert sammenlignet med den VEGF alene (Fig. 4B-b). Kvantifisering av vaskularisering ved å telle skip og som er presentert endotelceller viste at den vaskulære tettheten i honokiol-behandlede gruppen var signifikant redusert (fig. 4B-c og 4B-d).

Deretter endotelceller ble indusert å spire fra de isolerte rotte-aorta- ringer i nærvær av Matrigel og ECGM (endotelial cellevekstmedium) inneholdende angiogene cytokiner, så som VEGF og basisk fibroblast vekstfaktor. Omfattende endotel celleutvekst fra rotte-aorta-ring-eksplantater ble observert i kontrollgruppen (Fig. 5A). Honokiol behandling resulterte i en signifikant (~five gangers) reduksjon av endotel utvekst og spirende fra aorta-ringer (fig. 5A og 5C). Videre ble den morfologiske differensiering av endoteliale celle rør formasjon undersøkt ved anvendelse av en todimensjonal matrigel metode. Som vist i figur 5B, såing av HUVECs i matrigel førte til vaskulær rørliknende struktur formasjonen. Honokiol effektivt hemmet endotelceller tube formasjon ved å redusere tube-lignende struktur i lengde og bredde (fig. 5B og 5D).

Honokiol Abolished STAT-3 signale i Human Gastric kreftceller, HUVECs, og svulster

Tidligere studier har vist en sterk sammenheng mellom aktivert STAT-3 og angiogenic fenotype [11]. Vi belyst ytterligere virkningen av honokiol på fosforyleringen av STAT-3 i humane magecancerceller (MKN45 og AGS) og HUVECs. Som vist i figur 6, honokiol redusert tyrosin (Tyr705) fosforylering av STAT-3 på en tidsavhengig måte med omtrent en to-gangers nedgang i 1-2 timer i AGS-celler (Fig. 6A) og en 3 til 10- fold nedgang på 0,5 til 24 timer i MKN45 celler (fig. 6B). Overraskende, honokiol indusert STAT-3 defosforylering av Tyr705, men ikke Ser727, rester i disse menneskelige mage kreftceller. Men honokiol samtidig hemmet både Tyr705 og Ser727 fosforylering av STAT-3 i HUVECs (Fig. 6C). Kvantitativ analyse av proteinbånd i Western blot ved hjelp av Image-Pro Plus software er vist i figur 7. Resultatene av analysen med konfokalt mikroskop viste også at honokiol avskaffet tyrosin (Tyr705) fosforylering av STAT-3 i AGS celler og HUVECs (Fig . 8A).

Vi videre undersøkt STAT-3 fosforylering i peritoneal metastatiske svulster isolert fra nakne mus inokulert med MKN45 celler med eller uten honokiol (5 mg /kg) behandling. Immunhistokjemisk analyse viste at p-STAT-3-overekspresjon og akkumulering i tumor-regionen, inkludert kjerner og cytoplasma, ble betydelig reversert ved honokiol behandling (Fig. 8B). I Western blot-analyse, honokiol markert redusert akkumulering av p-STAT3 i tumorer sammenlignet med bærerkontroll (fig. 9A). Uttrykket av konstituerende STAT3 ble ikke påvirket. Videre er DNA-bindende aktivitet av STAT-3 ble ytterligere bekreftet ved hjelp av EMSA. Som vist i figur 9B, honokiol markert hemmet den økte DNA-bindende aktivitet av STAT-3 i humane magecancerceller. Honokiol også hemmet VEGF-økt STAT-3 DNA-bindende aktivitet i HUVECs (Fig. 9B).

Honokiol Induced SHP-1-regulerte STAT-3 Defosforylering i Gastric kreftceller, endotelceller, og svulster

SHP-1 er en ikke-trans PTP [12]. Vi neste undersøkt om honokiol kan regulere uttrykk og aktivitet av SHP-1. Som vist i figur 10A, honokiol forbedret protein ekspresjon av SHP-1, men ikke SHP-2, i HUVECs og AGS celler i en tidsavhengig måte. Farmakologisk PTP-inhibitor og SHP-1 siRNA transfeksjon effektivt opphevet honokiol-indusert STAT-3 defosforylering i HUVECs og AGS-celler (fig. 10B-a). Lignende resultater i SCM-1-celler og SV-40 udødelig mus mikrovaskulære endotelceller (SVECs) behandlet med honokiol er vist i figur 10B-b. Vi neste undersøkt om endogen SHP-1 er modulert av honokiol. Honokiol var i stand til å fremkaller SHP-1 aktivitet i magekreftceller, HUVECs og SVECs i en tidsavhengig måte (Fig. 11A). Honokiol også forbedret SHP-1 protein uttrykk i peritoneal metastatiske svulster isolert fra MKN45-inokulert mus som avslørt av immunhistokjemisk analyse (Fig. 11B). Vi videre undersøkt samspillet mellom SHP-1 og STAT-3 ved hjelp av metoder for co-immunoprecipitation og Western blotting. Som vist i figur 11C, ble SHP-1 spesifikt assosiert med STAT-3 i AGS celler og HUVECs i nærvær av honokiol sammenlignet med IgG-kontroll.

Honokiol Altered ER morfologi, indusert kalpain-II-regulert SHP -1-indusert STAT-3 Defosforylering, og Redusert VEGF Generation

Tidligere studier har antydet at eR stress spiller en viktig rolle i angiogenese [20], [21]. Vi neste undersøkt effekten av honokiol på ER mikro av transmisjonselektronmikroskopi. Som vist i figur 12A, ble ER utvidelse og fragmentering utstilt i honokiol behandlet SCM-1 mage kreftceller og HUVECs.

Vi ønsket også å finne ut om kalpain-II aktivering er nødvendig for SHP-1 aktivitet i honokiol behandlede celler. Farmakologisk kalpain inhibitor og kalpain-II siRNA transfeksjon effektivt redusert honokiol forbedret SHP-1 aktivitet i AGS celler og HUVECs (Fig. 12B). Celler ble behandlet med rekombinant kalpain-II, som en positiv kontroll, viste en 4 til 5 gangers økning i SHP-1-aktivitet (Fig. 12B). VEGF er kjent for å inneholde STAT-3-promoter-bindingssete. Vi neste undersøkt om honokiol kan regulere VEGF uttrykk. Honokiol betydelig redusert VEGF generasjon i AGS celler og HUVECs, og denne effekten ble reversert av SHP-1 siRNA transfeksjon (Fig. 12C). I tillegg transfeksjon av mutant-STAT-3-plasmidet inn i cellene også inhiberte VEGF generasjon. Kombinasjonen av honokiol med mutant-STAT-3-plasmid transfeksjon i celler synergistisk redusert VEGF-produksjon sammenlignet med behandling enten alene (figur 12C.). For ytterligere å bekrefte samspillet mellom kalpain-II og SHP-1, ble co-immunoprecipitation og Western blotting utført i magekreftceller. Som vist i figur 12D, ble kalpain-II spesifikt assosiert med SHP-1 i AGS-celler i nærvær av honokiol (20 uM) som sammenlignet med IgG-kontroll. Tilsvarende honokiol-indusert kalpain /SHP-en interaksjon ble også funnet i HUVECs (data ikke vist).

Diskusjoner

Honokiol er en viktig komponent i Magnolia officin
, som er en overgangs medisin i Asia [18]. Honokiol besitter anti-oksidative og anti-inflammatorisk effekt in vitro Hotell og in vivo product: [22] - [25]. Honokiol har vist seg å utvise sterk anti-proliferativ aktivitet mot endotelceller in vitro
og anti-tumor virkninger mot angiosarkom i nakne mus [26]. I denne studien demonstrerte vi for første gang at honokiol er en potent hemmer av angiogenese og metastase peritoneal av magekreft. Vår forskning har fokusert på effekter og mulige mekanismer for honokiol peritoneal metastase og angiogenese ved hjelp av PET /CT, CAM
analysen, Matrigel plugg analysen, aorta ring endotelceller spirende analysen, endotelceller tube-analysen, og in vitro
celleforsøk. Resultatene viste at honokiol kan undertrykke angiogenese og peritoneal formidling gjennom en kalpain-II-aktivert SHP-en aktivering signalkaskade. Aktivering av fosfatase SHP-1 ved honokiol ytterligere førte til nedregulering av STAT-3-aktivering og VEGF produksjon, noe som resulterer i inhibering av angiogenese og peritoneal metastasering. Imidlertid kan inhibering av angiogenese og inhibering av metastatisk potensiale av kreftceller ved honokiol være de separate deler, et vesen en effekt av honokiol på angiogenese direkte og en annen virkning av honokiol på kreftceller.

I løpet av de siste år, har en rekke studier indikerte at konstitutiv aktivering av STAT-familien, spesielt STAT-3, er assosiert med celleproliferasjon, angiogenese og metastase [10], [11], [27] - [30]. Økt aktivering av STAT-3-ekspresjon er blitt funnet i forskjellige tumor-avledede celler og prøver fra humane kreftvevet. Deregulert STAT-3-aktivering har blitt foreslått å spille en viktig rolle i overekspresjon av VEGF og økt angiogene fenotyper i magekreft, som kan bidra til magekreft utvikling og progresjon [11]. I denne studien fant vi at honokiol effektivt kan hemme fosforyleringen av STAT-3 i HUVECs (både Tyr705 og Serine727 nettsteder), menneskelige mage kreftceller (Tyr705 språk), og peritoneal metastatiske svulster (Tyr705 språk). Som onkogene aktivering av tyrosin kinaser er en vanlig funksjon i kreft, har vi fokusert på rollen til Tyr705 fosforylering av STAT-3.

SHP-en besitter en potensiell tumor suppressor funksjon og er en negativ regulator av JAK /STAT signalveien [15]. Det har også blitt vist at SHP-1 fosfatase kan binde seg til den fosforylerte Y1173 domene, noe som fører til EGFR defosforylering [31]. Y429 i det cytoplasmatiske domene av erytropoietinreseptoren er blitt foreslått å være det bindingssete for protein-tyrosin fosfatase-SH-PTP1, som kan spille en viktig rolle i å terminere proliferative signaler [32]. SHP-1 har også vist seg å være en antagonist av vekstfaktor-signalering i epitel og hematopoetiske celler [15]. SHP-1 ble spesielt fremhevet som en potensiell fysiologisk antagonist av VEGFR signale [33]. I endotelceller, er SHP-1 er fysisk forbundet med VEGFR2 og er også nødvendig for både TNFa-mediert og vev-inhibitor of metalloproteinases (TIMP) -mediert inhibering av angiogenese [31]. Dermed kan SHP-en aktiverings har viktige konsekvenser for regulering av spredning og angiogenese. I denne studien fant vi at honokiol spesielt forbedret uttrykk for SHP-en, men ikke SHP-2, magekreftceller, endotelceller, og peritoneal metastatiske svulster. Disse funnene antyder at honokiol kan inhibere endotelcelle angiogenese og metastase kreftcelle, som kan være gjennom en SHP-1-indusert STAT-3 nedregule bane.

Tidligere studier har foreslått en viktig rolle for ER stress i den molekylære mekanisme av angiogenese og kreftcellevekst [16], [20], [21]. Koyama og kolleger har også foreslått at ER stress-indusert kalsium avbrudd kan være involvert i induksjonen av amyloid β akkumulering og angiogen faktor ekspresjon i retinalt pigmentepitel [34]. En fersk studie har vist at ER stress-regulert IRE-1α signale besitter en viktig funksjon i placenta utvikling og embryonale levedyktighet, fremhever forholdet mellom ER stress, og angiogenese i morkaken under svangerskapet [35]. Kim og kolleger har vist at både SHP-1 og SHP-2 er endogene substrater for kalpain, som er involvert i sammenheng med Entamoeba histolytica
indusert verts celledød [36]. Spesielt calpainer blir aktive når den intracellulære kalsium ([Ca ^{2 +] i) konsentrasjonen er forhøyet; m-kalpain (calpain II) krever [Ca 2 +] i på en millimolar område, men mikromolare konsentrasjoner av [Ca 2 +] i er tilstrekkelig for aktivering av μ-kalpain (calpain I) [37 ], [38]. Det har vist seg at et høyt nivå av [Ca 2 +] i hemmer protein tyrosin kinase aktivitet som et resultat av kalpain-aktivering ved stimulering av ionofor i blodplater [39]. Honokiol var i stand til å fremkalle [Ca 2 +] i mobilisering i nerveceller [40]. Nylig har tunicamycin blitt rapportert å hemme angiogenese in vivo
. Vår tidligere studie har vist at honokiol induserer human magekreft celle apoptose og hemmer tumordannelse gjennom en kalpain-mediert glukoseregulerte protein-94 cleavage [16]. I denne studien har vi oversiktlig vist at ER ble utvidet og fragmentert i honokiol behandlet magekreftceller og HUVECs. Videre farmakologisk hemmer av kalpain og kalpain-II siRNA transfeksjon effektivt redusert honokiol forbedret SHP-1 aktivitet i magekreftceller og HUVECs. Spesielt våre resultater for første gang vist at kalpain /SHP-en interaksjon er direkte utløst av honokiol hemming av STAT-3 fosforylering i magekreftceller. Disse resultatene indikerer at honokiol kan indusere ER stress og utløse kalpain-II-aktivert SHP-1-aktivitet i magekreftceller og endotelceller.}

Som konklusjon, resultatene av denne undersøkelsen tilveie in vivo , ex vivo Hotell og in vitro
bevis for hemming av angiogenese og peritoneal formidling av magekreftceller ved honokiol og molekylære grunnlaget for dens effekter. Disse dataene markere involvering av ER kalpain og protein tyrosin fosfatase SHP-en signalisering i honokiol-hemmet STAT-3-aktivering og VEGF produksjon i mage kreftceller og endotelceller (Fig. 13). Disse funnene tyder også på at nedregulering av STAT-3 og VEGF signale indusert av kalpain /SHP-1 kan være et lovende terapeutisk strategi for magekreft behandling.

Materialer og metoder

Cells og kultur

Menneskelige mage kreft cellelinjer, inkludert en kaukasisk cellelinje (AGS, moderat /dårlig (blandet) differensierte adenokarcinomceller) og asiatiske cellelinjer (MKN45 og SCM-1, udifferensierte adenokarcinomceller) ble innhentet fra cellen bank av Taipei Veterans General Hospital (Taiwan). Celler ble opprettholdt i RPMI1640 medium inneholdende 10% FCS og streptomycin /penicillin i en fuktet 5% CO _{2 atmosfære.}

HUVECs ble oppnådd fra navlestreng vener ved kollagenase behandling som tidligere beskrevet [41]. Denne studien er i samsvar med prinsippene for bruk av menneskelige vev som er skissert i Helsinkideklarasjonen. Studien protokollen ble godkjent av etikk Review Board of Taichung Veterans General Hospital, Taichung, Taiwan (godkjent dokument TCVGH-C0062-1). HUVECs på tredje passering ble brukt. Effektiviteten av transfeksjon (mer enn 80%) av Lipofectin-reagens (Invitrogen) ble bestemt ved den tredje passasje. I noen eksperimenter, SV-40 udødelig mus mikrovaskulære endotelceller (SVECs) dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin. SVEC cellelinjen ble velvillig Gitt av Dr. KH Lan (Cancer Center, Taipei Veterans General Hospital, Taiwan).

Honokiol ble innhentet fra Wako Chemical Company (Osaka, Japan), og det ble fastslått å være minst 99% rent ved HPLC. Forskjellige konsentrasjoner av honokiol ble anvendt i denne studien, avhengig av medikamentsensitivitet indikert med IC50-verdier (20 uM i AGS, 40 uM i MKN45 og SCM-1). MKN45 og SCM-1 celler, men ikke AGS celler, har vist seg å effektivt indusere svulster i et xenograft tumor musemodell.

Dyr

Alle dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer ble godkjent og utført av komiteen for dyreforsøk National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan (godkjent dokument Nchu-100-26). Fire til seks uker gamle BALB /c nakne mus ble kjøpt fra NLAC (Taipei, Taiwan). Musene ble avlet og holdt under spesifikke patogen-frie forhold, utstyrt med sterilisert mat og vann ad libitum Hotell og ligger i en barriere anlegg med en 12 timers lys /mørke syklus.

Xenotransplantat Tumor Mouse Model

for å evaluere peritoneal metastase, dyrkede humane mage kreftceller (4~5 × 10 ^{6 celler) ble inokulert i bukhulen av BALB /c naken mus [42]. Peritoneale tumorer i nakne mus ble etablert i 7 dager etter injeksjon av mage kreft celler, hvori tumorene ble kontrollert av PET /CT-overvåking. Deretter ble musene injisert intraperitonealt med honokiol (5 mg /kg /to ganger per uke) i 28 dager. Effekten av honokiol på peritoneal formidling ble evaluert av PET /CT. En uttalelse /bilde av metastase situasjon ble beskrevet i figur 1. Deretter ble musene avlivet under bedøvelse (pentobarbital) og undersøkt makroskopisk for nærvær av peritoneal metastasering. Svulstene ble kuttet, skåret i blokker, fiksert i 10% formalin, og innebygd i parafinblokker eller snap-frosset i flytende nitrogen.}

Positron Emission Tomography /computertomografi (PET /CT) skanning

Etter minst 6 timer med faste, ble musene gitt en 7,4 MBq (0,2 mCi) dose på ^{18F-FDG oralt før spyling med 1 ml vann. Musene ble bedøvet med en isofluran vaporizer før hver skanning. Eksperimenter for små dyr bildebehandling ble utført med en kombinert PET /CT-skanner (Discovery ST, GE Medical Systems). En multidetector rekke spiralformede CT-skanneren, ble anvendt. Tekniske parametere i CT delen av PET /CT var som følger: CT-scan-type med en 0,5 sekunders fullstendig spiralformede scan, en detektor rad konfigurasjon av 16 x 1,25 mm, et intervall plass av 2,75 mm, en skivetykkelse på 1,25 mm , en stigning på 1.75:1 (høykvalitetsmodus), en hastighet på 17,5 mm per rotasjon, et stort felt-of-view (FOV), spenning på 120 kVp og strøm på 200 mA. Tekniske parametere for PET delen av PET /CT var som følger: 10,0 min i hver seng, FOV valgt for avbildning rekonstruksjon var 20 cm og PET-oppløsningen var omkring 4,5 mm i full bredde ved halve maksimum (FWHM). Rekonstruktiv parametrene var typen 3D iterasjon som 21 undergrupper og 2 iterasjoner. For å evaluere kvantifisering evne til PET /CT-scanner i små dyr avbildning, ble en region av interesse (ROI) som er plassert på mindre FOV transaksialtomografiscanner PET-bilder til fullstendig omgir de områder av FDG opptak i de observerte vevet samtidig unngå nærliggende vev. Gjennomsnittet av hver piksel aktivitet verdi innenfor hvert ROI ble tatt opp og uttrykt som Bq /ml.}

Chick Chorioallantoic Membran analysen ( CAM
analyse)

For å undersøke in vivo
angiogen aktivitet, en modifisert chick hel dyr CAM
analysen ble gjennomført som beskrevet tidligere [43]. Befruktede egg chick ble inkubert i en kontinuerlig fuktet egg oppdretter ved 37 ° C. Ved 3 dagers inkubasjon, ble kyllingembryo overført til en kulturskål. Tyve ul honokiol innesluttet i type I kollagen blanding ble påført på belegg disker og polymerisert ved oppvarming. Skivene ble lastet på CAM
av seks dager gamle embryoer. Etter 24 timers inkubering, ble området rundt lastet disk fotografert med et Nikon digitalkamera, og antallet nydannede fartøyer ble telt av to observatører i en dobbeltblind måte. Analyser for hver testprøve ble utført ved anvendelse av 10-13 egg.

Matrigel Plug-analysen

Nakne mus eller C57BL /6 mus ble injisert subkutant med 0,6 ml av Matrigel som inneholder den angitte mengde av kapsaicin 100 ng av VEGF, og 10 enheter av heparin. Den injiserte matrigel raskt dannet en enkelt, solid gel plugg. Etter 7-21 dager ble huden på mus lett trekkes tilbake for å eksponere Matrigel plugg, som forble intakt. Hemoglobin ble målt ved anvendelse av Drabkins fremgangsmåte og et reagenssett Drabkins 525 (Sigma, St. Louis, MO) for kvantifisering av blodkardannelse. Konsentrasjonen av hemoglobin ble beregnet ut fra en kjent mengde hemoglobin analysert i parallell. Bildene ble fotografert med et Nikon digitalkamera, og antallet nydannede mikro fartøyer ble telt.

Ex Vivo
aortic Ring analysen

Aorta ble isolert fra 6 -week gamle Sprague-Dawley-rotter. Plater (48-brønn) ble belagt med 120 mL av matrigel. Aorta isolert fra mus ble renset for periadventitial fett og bindevev, og kutt i ~ 1 mm lang til 1,5 mm lange ringer. Etter å ha blitt vasket fem ganger med endotelial cellebasert medium, ble Aorta plassert på Matrigel-dekket brønner og dekket med ytterligere 100 ul av matrigel. Honokiol eller vehikkel ble tilsatt til brønnene i et sluttvolum på 250 ul av medium.

• PLoS ONE: Forholdet mellom negative og positive lymfeknuter er egnet for Evaluering Prognose av magekreft Pasienter med positive metastaser
• PLoS ONE: Høy γ-stråling Følsomhet er assosiert med økt Gastric Cancer Risk i en kinesisk Han Befolkning: A Case-Control Analysis