PLOS ONE: Lait fermenté par Propionibacterium freudenreichii Induit Apoptose de HGT-1 Human Cancer gastrique Cells

Résumé

Contexte

Le cancer gastrique est l'un des cancers les plus fréquents dans le monde. Le "pays économiquement développés" style de vie, y compris l'alimentation, constitue un facteur de risque favorisant ce cancer. modulation de régime alimentaire peut réduire l'incidence du cancer digestif. Parmi les composants alimentaires prometteurs, propioniques laitières ont été présentés pour déclencher l'apoptose des cellules cancéreuses du côlon humain, par l'intermédiaire de la sortie de chaîne courte acides gras acétate et propionate.

Un lait fermenté
Méthodologie /Principaux résultats , exclusivement fermenté par P.
freudenreichii, a récemment été conçu. Dans ce travail, le potentiel pro-apoptotique de ce nouveau lait fermenté a été démontrée sur des cellules cancéreuses gastriques humaines HGT-1. Fermentée surnageant de lait induit des caractéristiques typiques de l'apoptose, y compris la condensation de la chromatine, la formation de corps apoptotiques, ADN échelonnage, arrêt du cycle cellulaire et de l'émergence d'une population subG1, l'exposition de phosphatidylsérine à la membrane plasmique feuillet externe, réactive oxygène accumulation d'espèces, mitochondrial transmembranaire perturbation potentielle, caspase activation et libération du cytochrome c. Remarquablement, ce nouveau lait fermenté contenant P. freudenreichii
amélioré la cytotoxicité de la camptothécine, un médicament utilisé dans la chimiothérapie du cancer gastrique.

Conclusions /Importance

Ce nouveau lait fermenté probiotique peut donc être utile dans le cadre d'un régime préventif visant à prévenir le cancer gastrique et /ou en tant que complément alimentaire pour potentialiser les traitements thérapeutiques du cancer

Citation:. cousin FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, Jan G (2012) de lait fermenté par Propionibacterium freudenreichii
Induit apoptose de HGT-1 cellules de cancer gastrique humain. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10.1371 /journal.pone.0031892

Editeur: Abbés Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Etats-Unis d'Amérique

Reçu 15 Novembre 2011; Accepté le 19 Janvier 2012; Publié: 19 Mars, 2012 |

Droit d'auteur: © 2012 cousin et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été financé par le Conseil Régional de Bretagne à travers le Développement appel CBB pour les projets et par le Centre national interprofessionnel de l'Économie Laitière (CNIEL) par le biais de l'appel du Comité scientifique de Syndifrais pour les projets. La recherche dans le groupe IRSET a été soutenu par des subventions de la Nationale Contre le Cancer Ligue le (la Côte d'Armor, Ille et Vilaine, Morbihan, Vendée et Sarthe Comités), INSERM, Université de Rennes 1 et la région Bretagne. FJC a reçu une subvention de CNIEL (bourse de doctorat). SJL a été soutenu par l'Association pour la Recherche de Cancer le (en bourse de doctorat). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

régime modulant le risque de développer un cancer gastrique

le cancer est la principale cause de décès dans les pays économiquement développés résultant de choix de style de vie associés au cancer, y compris le tabagisme, l'inactivité physique, et "occidentalisé" régime [ ,,,0],1]. En effet, le rôle de l'alimentation dans le développement du cancer est fortement soutenue par des études épidémiologiques, en particulier en ce qui concerne les cancers de l'appareil digestif. Le cancer gastrique (GC) représente le troisième type de cancers mortels pour les hommes dans le monde. En 2008, 640.600 cas de GC ont été estimés, provoquant 464.400 décès dans le monde [1]. Cette maladie est particulièrement fréquente en Asie orientale et en Europe centrale et orientale. Les facteurs étiologiques les plus importants impliqués dans la carcinogenèse gastrique sont le régime alimentaire et infection
Helicobacter pylori. Des preuves substantielles, principalement des études cas-témoins, donne à penser que le risque de contracter GC est augmentée par un apport élevé de salés, marinés ou fumés traditionnellement les aliments, ainsi que du poisson séché et de la viande. Au contraire, les fibres, les légumes frais et des fruits, peut-être en raison de leur teneur en vitamine C, ont été trouvés à être inversement associée au risque de GC [2], [3]. L'impact des composants naturels /alimentaires sur la cancérogenèse de l'estomac a ainsi été étudiée au cours des dernières décennies [4] - [6]. Parmi ceux-ci, les probiotiques et de leur capacité à inhiber le développement du cancer ont suscité un intérêt scientifique [7], [8]. Un probiotique est généralement défini comme "un micro-organisme vivant qui, lorsqu'il est administré en quantités suffisantes, confère un avantage de santé à l'hôte» [9]. Alors que certains micro-organismes comme H. pylori
peut favoriser GC, d'autres peuvent avoir un effet bénéfique en empêchant les cancers digestifs. En particulier, des souches sélectionnées de bactéries probiotiques peuvent limiter le développement du cancer dans des modèles animaux de la carcinogenèse [10]. Cela a été particulièrement mis en évidence pour le cancer du côlon alors on en sait moins sur les effets possibles des probiotiques sur GC. Une possible explication mécaniste d'un tel effet protecteur est le dans la libération in situ des métabolites anti-cancérigènes tels que les acides gras à chaîne courte (AGCC).

des acides gras à chaîne courte induire l'apoptose des cellules cancéreuses

SCFA, y compris l'acétate, le propionate et le butyrate, sont des anions importants du contenu intestinal et leur concentration peuvent être modulées par le régime alimentaire. Ils ont été montrés à jouer un rôle clé dans les fonctions physiologiques importantes, y compris la modulation de la prolifération des cellules épithéliales équilibre /apoptose digestive. Cela implique des SCFA à médiation par arrêt du cycle cellulaire, l'inhibition de l'histone déacétylase et de la stimulation de l'apoptose dans les cellules transformées, mais aussi la stimulation de la différenciation dans les cellules saines [11], [12]. Il a également été rapporté que le butyrate et le propionate AGCC à la fois d'induire l'apoptose dans des lignées cellulaires de carcinome gastrique humain [13] - [15]. L'apoptose est un processus physiologique naturel règlement permettant de nombre de cellules et constitue une cible pour la chimiothérapie anti-cancer [16]. L'apoptose permet déplétion des cellules cancéreuses de façon "propre". Les cellules cancéreuses fragment dans une réaction en chaîne coordonnée et les résidus sont absorbés par les tissus adjacents et le système immunitaire [17], [18]. Deux principales voies apoptotiques ont été décrites: la voie extrinsèque, qui est médiée par l'activation des récepteurs de mort et de la caspase 8, et la voie intrinsèque, dans lequel les mitochondries et de la caspase 9 sont impliqués [16]. Généralement, dans les cellules cancéreuses, la fonction apoptotique fait défaut, ce qui peut expliquer leur prolifération soutenue et par conséquent la formation de tumeurs. La capacité à induire l'apoptose des cellules cancéreuses est ainsi reconnue pour son potentiel thérapeutique [16]. Depuis propioniques laitières sont en mesure de produire des AGCC pro-apoptotiques bénéfiques, ils peuvent se révéler utiles dans la prévention ou le traitement du cancer.

Propionibacterium freudenreichii
peut favoriser l'épuisement apoptotique des cellules cancéreuses digestifs

Ce Propionibacterium laitier probiotique a été montré pour induire la mort des cellules de différentes lignées cellulaires de cancer du côlon humain par induction de l'apoptose dans les co-cultures [19]. Les substances actives sécrétées dans le milieu, déclenchent la voie apoptotique intrinsèque mitochondriale dans des cellules cultivées de cancer colorectal humain. En particulier, les AGCC acétate et propionate libérés par P. freudenreichii
induire l'apoptose en agissant sur la mitochondrie adénine nucléotides translocateur, ce qui provoque une dépolarisation mitochondries et perméabilisation, les fuites de cytochrome c et l'activation des caspases [19], [20]. Cependant, les surnageants propionibacterial sont encore plus pro-apoptotique de l'acétate et le propionate AGCC, utilisé aux concentrations mesurées dans les surnageants, ce qui suggère que d'autres composés peuvent être impliqués dans cet effet. souches de P sélectionnés. freudenreichii
restent en direct et métaboliquement active dans l'intestin des humains et des rats microbiote humaines associées où ils produisent AGCC [21], [22]. sains En conséquence, ils ont été montré pour augmenter l'apoptose dans les cellules épithéliales du côlon transformées de ces rats nourris avec le carcinogène 1,2-diméthylhydrazine (DMH), mais pas dans le contrôle [23]. Propionibacteria pourrait constituer des probiotiques favorisant la prophylaxie du cancer du côlon, à condition qu'ils atteignent leur cible vivante et métaboliquement active. Dans ce contexte, le vecteur ou véhicule de livraison probiotique, a été montré pour déterminer la survie propioniques et l'activité [21], [24], [25]. produits laitiers complexes comme le yogourt et le fromage, en particulier, protéger propioniques du stress, mais contiennent un mélange complexe de bactéries. Il est donc impossible d'attribuer l'effet bénéfique d'une souche particulière.

Un lait fermenté a été évaluée comme véhicule de livraison de Propionibacterium dans ce contexte

Dans cette étude, nous avons utilisé une nouvelle qualité alimentaire lait fermenté contenant uniquement P. freudenreichii
comme seule microflore. Comme ce produit contient les bactéries propioniques vivants et de leurs métabolites actifs, il convient de les mettre en contact avec la muqueuse gastrique lors de l'ingestion. Ce lait fermenté a été étudié par rapport à HGT-1 humain gastrique cellules cancéreuses induction de l'apoptose. En effet, propioniques sont connus pour tuer les cellules cancéreuses du côlon humain, mais leur effet sur les cellules de cancer gastrique est inconnue. Le lait fermenté a tué HGT-1 des cellules d'une manière en temps et dose-dépendante. Les caractéristiques typiques du processus de l'apoptose ont été observés, y compris la chute de la viabilité, de la condensation de la chromatine, la formation de corps apoptotiques, l'ADN échelonnage, la production de ROS, mitochondrial membrane perturbation potentielle, l'activation des caspases, arrêt du cycle cellulaire et de l'émergence d'une population de subG1.

P Résultats. lait freudenreichii
fermenté tue gastrique humain et les cellules cancéreuses du côlon

P. freudenreichii
ITG P9 a grandi dans 72 h à 30 ° C dans le lait complété et complété ultrafiltrat de lait pour atteindre la population finale de 9,43 log _{10 unités formant des colonies (ufc) /ml et 9,35 log 10 ufc /mL, respectivement. Les concentrations ont été SCFA 26,21 mM d'acétate et de propionate 54,47 mM (2,08 propionate /acétate de rapport) dans le lait fermenté surnageant alors qu'ils étaient 24,00 mM et 53,32 mM (rapport 2,22) dans le surnageant de l'ultrafiltrat de lait fermenté. Ces ratios sont attendus pour propioniques, qui produisent généralement deux fois plus que l'acétate propionate [26]. Douze autres souches de bactéries propioniques laitières de qualité alimentaire ont également été testés (voir le tableau S1 et la figure S1). L'utilisation de ces souches, douze laits fermentés ont été obtenus. Les concentrations de propionate variaient entre 36 pour les populations 67 mM et propionibactéries 9,0 à 9,7 log 10 ufc /mL, pour le moins et pour la souche, respectivement le plus efficace.}

Le potentiel cytotoxique des surnageants préparés à partir de lait ou ultrafiltrat de lait, à la fois fermenté par P. freudenreichii
ITG P9, a été étudiée. -29 HT cellules humaines du côlon et du cancer HGT-1 des cellules cancéreuses gastriques humaines ont été traités avec ces surnageants. Différentes dilutions allant de ½ à été testées. En outre, la cytotoxicité d'un mélange de 15 mM d'acétate et propionate de 30 mM a été testée à des concentrations proches de celles-ci surnageants dilués ½. A titre de témoins positifs de l'induction de l'apoptose, les médicaments de chimiothérapie camptothécine (4 pM) et l'étoposide (100 uM) ont été utilisés pour les cellules HGT-1 et HT-29, respectivement. Trois méthodes distinctes de surveillance de la mort cellulaire ont été comparés. Comme on le voit sur la figure S2, le bleu de méthylène, le MTT et trypan dosages d'exclusion au bleu ont une cinétique similaire de la mort. Par conséquent, le dosage de bleu de méthylène a été utilisé dans cette étude pour mieux évaluer la viabilité des cellules. Les produits laitiers non fermenté (lait ou de lait ultrafiltré) n'a eu aucun effet, ni sur HT-29, ni sur HGT-1 viabilité des cellules (Fig. 1 A, B). Le surnageant de lait ou de lait fermenté par ultrafiltrat P.
freudenreichii a induit une cytotoxicité similaire d'une manière dépendante du temps dans le HT-29 et HGT-1 des cellules, et à proximité de la cytotoxicité induite par des médicaments ou par le mélange acétate /propionate. mise à mort demi-maximale de HGT-1 des cellules a eu lieu après 24 h et 26 h de traitement avec le lait fermenté et le lait fermenté surnageants de ultrafiltrat respectivement, après 17 h de traitement par la camptothécine et après 24 h de traitement avec le mélange de SCFA (Fig. S3), . En outre, la cytotoxicité des surnageants de produits laitiers fermentés dans HGT-1 des cellules était dose-dépendante (Fig. 1C). Pour chaque dilution testée, la chute HGT-1 viabilité cellulaire induite par le lait fermenté ou l'ultrafiltrat de lait fermenté était très similaire (figure 1C &.. La figure S3). Voilà pourquoi les prochaines étapes de l'étude, nous avons effectué uniquement avec le surnageant de ultrafiltrat de lait fermenté. Pris ensemble, ces données indiquent que les bactéries propioniques tuent efficacement le côlon humain et des cellules de cancer de l'estomac, au moins en partie par la production de propionate et l'acétate (Fig. 1). Certains autres laits fermentés, fermentés par différentes souches de bactéries propioniques laitières, ont montré des effets cytotoxiques similaires sur les cellules cancéreuses (Tableau S2). P. freudenreichii
ITG P9 étant connu pour son activité métabolique in vivo
[22], le lait fermenté correspondant a également été étudiée.

P. lait freudenreichii
fermenté induit des marques typiques de l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques humaines

morphologie Nucleus de HGT-1 cellules incubées en présence de P. freudenreichii
ultrafiltrat de lait fermenté a été analysé par microscopie à fluorescence après coloration de Hoechst 33342 (fig. 2A). La fluorescence nucléaire des cellules non traitées (contrôle) est resté inchangé au cours de la durée de l'expérience avec des noyaux normale bleu (temps 0 h, Fig. 2Aa). Pendant le traitement, HGT-1 cellules affichent les caractéristiques de la chromatine et noyaux fragmentés condensés de noyaux apoptotiques (Fig. 2AB c,), suivie par l'apparition de corps apoptotiques à 72 h (Fig. 2AD). fragmentation de l'ADN inter-nucléosomale résultant en échelonnage d'ADN, une marque typique de l'apoptose [27], a également été surveillée pendant le traitement fermenté de ultrafiltrat de lait. la fragmentation de l'ADN a été observée à partir de 24 h de traitement avec du lait fermenté ultrafiltrat (Fig. 2B) et, dans une moindre mesure, avec la camptothécine (Fig. S3). la teneur en ADN a également été quantifiée par cytométrie de flux après marquage d'iodure de propidium pour étudier l'impact de la fermentation ultrafiltrat de lait sur HGT-1 distribution du cycle cellulaire (Fig. 2C). Les cellules non traitées HGT-1 ont présenté une distribution du cycle cellulaire (Fig. 2 Ca) sans phase de subG1, qui est demeurée inchangée au cours du temps de l'expérience (résultats non représentés). Le pourcentage de cellules en phase subG1, indicative d'un processus apoptotique, augmenté de façon significative avec le temps au cours de fermentation traitement de l'ultrafiltrat de lait (fig 2Cb, Cc, Cd.) À 24 h (39,24 ± 4,87%) à 48 h (91,63 ± 0,28 %) et à 72 h (94,79 ± 0,45%). A 48 h et 72 h de traitement, toutes les cellules étaient dans la phase de cycle cellulaire subG1, ce qui indique la mort complète des cellules HGT-1. En tant que témoin, camptothécine induit caractéristiques apoptotiques similaires dans HGT-1 cellules (Fig. S4).

Pour confirmer induction de l'apoptose, phosphatdylserine translocation de l'intérieur vers le feuillet externe de la membrane plasmique a été évaluée par coloration HGT- 1 des cellules avec une combinaison de l'annexine V-FITC (AV) et 7-AAD, suivie par l'analyse des flux de fluorescence par cytométrie (fig. 3). Des cellules non traitées (0 h) présentent une forte proportion de cellules vivantes (AV ^{- /7AAD -; 92%) et seulement 5% des cellules ont été colorées avec l'annexine V (figure 3B.). Ces pourcentages déterminés dans les cellules non traitées n'a pas changé au cours de la durée de l'expérience (données non présentées). Pendant le traitement de HGT-1 des cellules avec ½ fermenté dilué ultrafiltrat de lait dans DMEMc, le pourcentage de cellules colorées uniquement par 7-AAD (nécrose indiquant) était très faible (Fig. 3B). Cependant, le pourcentage de cellules colorées avec l'annexine V significativement augmenté d'une manière dépendante du temps et a atteint 80% au bout de 72 h (Fig. 3B). Par conséquent, HGT-1 cellules ont subi l'apoptose après traitement avec P. freudenreichii
fermentée ultrafiltrat de lait, caractérisé par un premier AV coloration positive, ce qui indique l'exposition de phosphatidylsérine, puis les deux AV et une coloration positive 7-AAD, ce qui indique une perte ultérieure de l'intégrité de la membrane. En tant que témoin, camptothécine induit apoptotiques caractéristiques similaires (Fig S5.)}

Comme SCFA agissent directement sur les mitochondries, trois paramètres mitochondriaux importants ont également été déterminés:. Le potentiel de membrane interne ΔΨm, et la génération de ROS, en utilisant deux sondes fluorescentes, DIOC (6) 3 (qui est ΔΨm sensible) et DHE (qui détecte O _{2 ^{- niveau), et la localisation du cytochrome c. Des cellules non traitées (0 h) présentaient une fluorescence élevée (haute ΔΨm) et une fluorescence de DHE faible (faible production de O 2 -) (Fig. 4A, B). Après traitement avec du lait fermenté ultrafiltrat, soit une diminution dépendant du temps dans l'incorporation de DiOC6 (3) sonde fluorescente a été observée, indiquant une perte de ΔΨm mitochondriale et donc dépolarisation de la membrane (Fig. 4A). Les pourcentages des traités HGT-1 des cellules avec une diminution du potentiel de membrane interne accrue d'une manière dépendant du temps pour atteindre 96% des cellules à 72 h. le traitement FCCP a été utilisé comme témoin positif de la mitochondrie dépolarisation de la membrane. Cette perte de ΔΨm a été confirmée par la perte de fluorescence rouge caractéristique suivante JC-1 coloration (Fig. 4B). En ce qui concerne la production de ROS dans HGT-1 cellules, traitement ultrafiltrat de lait accumulation induite fermenté de O 2 -, de façon significative après 48 h et 72 h de traitement (figure 4C.). Cette accumulation ROS peut être partiellement évités si les cellules sont pré-traités par le ROS piégeur TEMPOL (Fig. S6). Cytochrome c libération des mitochondries dans le cytoplasme est un événement cellulaire clé du programme apoptotique. Examen immunotransfert des fractions cytoplasmiques enrichie pour la présence de cytochrome c a confirmé un changement de sa localisation sous-cellulaire (Fig. 4D). Cytochrome c a été détectée dans la fraction enrichie cytoplasme de 24 h de traitement, indiquant la relocalisation de cette protéine (Fig. 4D). Cette relocalisation du cytochrome c dans le cytoplasme a été confirmée par immunocoloration, montrant immunocoloration diffuse dans toute la cellule après le traitement, tandis que la coloration ponctué avant le traitement}}

(Fig. 4E). P. freudenreichii
lait fermenté active caspases

Pour confirmer les mécanismes apoptotiques induits par fermentation ultrafiltrat de lait dans HGT-1 cellules, traitement des caspases 3, 8 et 9 a été analysé par western blot et correspondant des activités enzymatiques surveillance HGT des extraits de cellules -1 (Fig. 5). L'ultrafiltrat de lait non fermenté n'a pas induit l'activation des caspases dans HGT-1 des cellules: seules les proformes de la caspase-3 et -9 ont été détectés sur Western blot (Fig. 5A) et aucune activité caspase a été mesurée (figure 5B).. Le surnageant fermenté ultrafiltrat de lait, ainsi que la camptothécine ou le mélange de propionate et acétate d'éthyle dans un rapport molaire [2: 1], induite par le clivage de la pro-caspase 3 et la génération des formes actives de la caspase-3, les sous-unités p17 et p12 (Fig. 5A). L'activation de la caspase-3, qui est une caspase effectrice, a confirmé l'induction de l'apoptose. En outre, le lait fermenté ultrafiltrat induit le clivage de la procaspase-9, ce qui conduit à des formes traitées 35 kDa et 37. n'a pas été détectée Caspase-8 dans les cellules témoins non traitées HGT-1. Cependant, le traitement avec des surnageants propionibacterial ou mélange C2 /C3 conduit à une détection claire de la 54 kDa proform, suivie par son clivage après 48 h de traitement

La quantification de la caspase-3, -8 et. - 9 activités enzymatiques ont confirmé l'activation des caspases par les deux métabolites propionibacterial et par la camptothécine. En effet, les caspases-9 et -3 ont été activés dès les premières étapes du traitement, tandis que la caspase-8 semblait activé plus tard (Fig. 5B). Camptothécine et le mélange SCFA activés tous les trois caspases étudiés. Ces données confirment l'activation de la voie intrinsèque de l'apoptose par fermentation traitement ultrafiltrat de lait, avec une activation précoce de la caspase-9, puis de la caspase-3 et -8.

P. lait freudenreichii
fermenté augmente camptothécine cytotoxicité

Campthotecin est une quinoléine alcaloïde cytotoxique qui inhibe la topoisomérase enzyme ADN I (topo I) et est largement utilisé dans le traitement chimiothérapeutique du GC. Nous avons montré plus haut que les métabolites propionibacterial induisent l'apoptose dans les cellules HGT-1 via la voie de la mort mitochondriale. Nous avons ensuite étudié l'apoptose induite par la combinaison des deux camptothécine et fermenté ultrafiltrat de lait dans HGT-1 cellules. Des concentrations accrues de camptothécine (0, 0,25, 0,5, 1, 2 uM) en combinaison avec des concentrations accrues de ultrafiltrat de lait fermenté (0, ⅛, ¼) ont été testés sur HGT-1 la viabilité des cellules et à la fois la perte induite de HGT-1 viabilité d'une manière dose-dépendante (Fig. 6). De plus, l'ajout de lait fermenté ultrafiltrat amélioré significativement la cytotoxicité de la camptothécine dans HGT-1 des cellules (Fig. 6). Par exemple, la camptothécine et 0,25 uM fermenté ultrafiltrat de lait dilué à ⅛ conduit à une perte de 8,6% et 18,6%, respectivement la viabilité. La combinaison de ces deux composés conduit à une perte de viabilité cellulaire de 29,8% (Fig. 6), ce qui suggère un effet cytotoxique ajouté lorsque la camptothécine a été combinée avec du lait fermenté ultrafiltrat dans HGT-1 cellules. En conséquence, l'indice de combinaison (IC), calculé comme indiqué précédemment [28], a une valeur de 1, ce qui indique un effet additif de la camptothécine et fermentée traitements ultrafiltrat de lait.

Discussion

Une nouvelle fermentée lait, contenant P. freudenreichii
comme une seule bactérie, a été développé afin d'étudier davantage le potentiel probiotique de cette préparation laitière de propioniques (revue dans [29]). Dans cette étude, nous rapportons que la phase aqueuse de ce lait fermenté tue côlon humain et les cellules de cancer gastrique par métabolites, y compris le propionate et l'acétate, libérés par cette bactérie. Cette notion est basée sur les effets cytotoxiques observés de P. freudenreichii
de lait fermenté surnageants de culture sur HT-29 et HGT-1 des cellules cancéreuses. Cet effet a été obtenu avec les surnageants d'ultracentrifugation, à savoir la phase aqueuse du lait fermenté, dépourvu de caséines et de bactéries, montrant que les composés actifs sont sécrétées, comme décrit précédemment pour propioniques [19]. Pour cette raison, la plupart des expériences dans ce travail ont été effectuées avec du lait fermenté ultrafiltrat (fig. 1). Nous avons démontré pour la première fois que P. freudenreichii
fermenter l'apoptose surnageant de lait induite par HGT-1 des cellules d'une manière en temps et dépendante de la dose avec l'apparition des caractéristiques classiques morphologiques et biochimiques de l'apoptose (condensé et chromatation fragmenté, l'ADN échelonnage et l'accumulation des cellules dans le cycle cellulaire subG1 phase).

Nous avons examiné ensuite si les mécanismes cellulaires impliqués dans HGT-1 voie de mort cellulaire étaient semblables à la voie de la mort mitochondrial déclenchée dans Caco-2 et HT-29 cellules de cancer du côlon humain par P. freudenreichii de les surnageants de culture DMEMc [19], [20]. Les événements des sous-cellulaires et biochimiques observées dans les traités HGT-1 des cellules avec fermentée ultrafiltrat de lait étaient similaires et inclus au moins mitochondriale perte de ΔΨm, ERO (O _{2 ^{-) génération caspases le traitement et l'activation, le cytochrome c relocalisation dans le cytoplasme (fig. 3, 4, 5). Surnageant de lait fermenté traitement et l'activation de la caspase-8 induite, en plus des caspases -3 et -9. En outre, la figure 4A indique que la caspase-8 n'a pas été détectée dans les cellules non traitées de contrôle et dans les cellules traitées avec la camptothécine ou non fermenté ultrafiltrat de lait, en ligne avec l'absence de son ARNm (C. Le Jossic-Corcos, Faculté de médecine, Brest , France, communication personnelle). Il faut remarquer qu'un écart apparent existe entre les résultats enzymatiques, ce qui suggère une activité caspase-8 dans les cellules traitées par la camptothécine, alors qu'aucun caspase-8 est détectée dans ces cellules par transfert de Western. Ceci peut être expliqué par l'absence de spécificité du substrat Ac-IETD-AMC, qui peut être traité par d'autres enzymes telles que des caspases -3 et -10 granzyme B ou, en particulier si la concentration de ces enzymes est élevée [30], [31]. En revanche, P. freudenreichii
fermentée ultrafiltrat de lait et le mélange de SCFA à la fois provoqué l'expression et l'activation de la caspase-8. Les mécanismes impliqués ici ne sont pas élucidées; Cependant, la caspase-8 est connu pour être sous-exprimé dans certaines cellules cancéreuses en raison de méthylation de l'ADN [32], [33]. Son expression peut être rétablie au niveau de l'ARN et des protéines par des agents de déméthylation tels que décitabine [34] et des inhibiteurs de HDAC [35], ce qui entraîne une déméthylation de la séquence régulatrice de la caspase-8, une augmentation de la caspase-8 activité de promoteur et re -expression de la caspase-8 [32]. AGCC, tel que le propionate, sont des inhibiteurs de HDAC, conduisant à une hyperacétylation des histones [36]. Cela favorise la transcription par un changement dans l'ADN conformation [37] et pourrait restaurer l'expression de la caspase-8. D'autres composés alimentaires d'origine ont déjà été présentés pour restaurer caspase-8 expression. Un extrait injectable de Semen coicis
(un parent de maïs) extract présentant une activité anti-tumorale augmente l'expression de la caspase 8 et induit l'apoptose dans les cellules HepG2 [38]. Le disulfure de diallyle, trouvée dans l'ail, augmente l'expression de la caspase-8, Fas et FasL dans les cellules K562 de leucémie. Un tel règlement peut donc être impliqué dans les effets pro-apoptotiques de Propionibacterium laitiers et de produits fermentés les contenant. Western blot témoigne restauré l'expression et l'activation puis la fin de la caspase-8 dans propionibacterial métabolites-traités HGT-1 cellules, qui peuvent survenir à la suite de la caspase-8 activation par un autre caspase tels que la caspase-9. En effet, la sortie du cytochrome c, une partie de la voie mitochondriale, a été montré pour activer plusieurs caspases, notamment 2, 3, 6, 7, 8 et 10 [39]. En outre, la caspase-9 activation a été montré résultat en aval de la caspase-8 activation [40]. En conséquence, a été montré caspase-9 in vitro Comment faire pour activer la caspase-3 qui à son tour active caspase-6, responsable de la caspase-8 activation [41]. Au total, nos résultats confirment que les métabolites propionibacterial présents dans P. freudenreichii
lait fermenté induit plusieurs mécanismes sous-cellulaires favorisant l'apoptose. Une telle réactivation de la caspase-8 expression pourrait conduire à une réponse apoptotique majeure dans HGT-1 des cellules traitées avec des récepteurs morts de domaine (par exemple des agonistes Trail ou Fas).}}

À notre connaissance, ceci est la première œuvre de rapports spécifiques l'induction de l'apoptose gastrique des cellules cancéreuses d'un produit laitier fermenté. des laits fermentés, y compris le yaourt, ont été proposés pour être utiles dans la prévention du cancer du côlon. Les données épidémiologiques sur les effets protecteurs du lait et des produits laitiers sur le taux de cancer du côlon ont donné des résultats contradictoires [42]. Le lait et les produits laitiers totaux consommation est associée à une réduction du risque de cancer colorectal. Mais cela ne vaut pas pour toutes sortes de produits et les effets laitiers varient considérablement. Les produits laitiers fermentés peuvent constituer des véhicules de livraison efficaces pour cibler les molécules protectrices ou des micro-organismes à des sites spécifiques tels que l'épithélium digestif [43]. lactoferrine bovine, un constituant du lait, induit l'apoptose des colon [44] et les cellules [45] de cancer gastrique. Les souches sélectionnées de micro-organismes présents dans les laits fermentés peuvent également contrecarrer la cancérogenèse colique. Par conséquent, le yaourt et d'acide lactique, les bactéries présentent des propriétés anti-cancéreuses dans des modèles animaux de la carcinogenèse du côlon [46]. Cependant, peu de travaux ont porté sur les produits laitiers fermentés et le cancer gastrique. Notre travail suggère que P. freudenreichii
pourrait jouer un rôle dans ce contexte, car il livrerait les deux propioniques vivants et métabolites pro-apoptotiques de la muqueuse gastrique. Dans ce contexte, il convient de noter que P. freudenreichii
adhère à l'épithélium digestif et les cellules à mucus [47], [48]. Il a également été montré pour inhiber l'adhérence de l'agent causal du cancer gastrique Helicobacter pylori
dans digestive des cellules épithéliales, ainsi que H. dommages induites par des pylori [49]. Ces propriétés suggèrent un rôle de P. freudenreichii
lait fermenté dans la prophylaxie du cancer gastrique.

Enfin, notre lait fermenté potentialise l'action pro-apoptotique de la camptothécine de médicaments sur les cellules de cancer gastrique. Par conséquent, les cultures vivantes de lactobacilles probiotiques ont déjà été présentés pour sensibiliser les cellules cancéreuses colorectales LS513 à 5-fluorouracyle [50]. Cependant, dans ce cas, les probiotiques seuls avaient aucun effet pro-apoptotique. Dans ce travail, de faibles doses de la camptothécine de médicament utilisé dans la chimiothérapie du cancer de l'estomac étaient inefficaces pour tuer les cellules de cancer gastrique. Cependant, en présence de faibles doses de P. freudenreichii
lait fermenté, ils ont tué efficacement les mêmes cellules (Fig. 6). métabolites Propionibacterial induisent la voie de l'apoptose intrinsèque en agissant directement sur les mitochondries, tandis que la camptothécine agit au niveau de l'ADN. Ceci est cohérent avec leur potentiel cumulé de l'apoptose par induction lorsque ces inducteurs pro-apoptotiques sont combinés. De plus, le lait fermenté contient SFCAs, connu sous le nom d'inhibiteurs de HDAC capables de moduler l'apoptose et le cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses gastriques [13], [51], ainsi que l'expression du cycle cellulaire liée et apoptotiques dans d'autres cellules cancéreuses [52], [53]. Les probiotiques ont déjà été utilisées dans des études cliniques pour réduire les effets secondaires de la chimiothérapie du cancer [54]. P.
freudenreichii peut, selon nos résultats, être utilisé dans ces études cliniques. Son effet synergique peut aider à réduire la dose de médicament et d'améliorer le confort des patients.

En conclusion, un nouveau lait, exclusivement fermenté par P.
freudenreichii, l'apoptose induite dans HGT-1 des cellules cancéreuses gastriques humaines. En outre, ce lait fermenté augmenté l'activité cytotoxique des camptothécines, des médicaments utilisés dans la chimiothérapie du cancer gastrique. Ce nouveau lait fermenté probiotique pourrait être d'intérêt comme un aliment fonctionnel pour prévenir le cancer gastrique et /ou pour potentialiser les traitements thérapeutiques.

Matériel et méthodes

Produits chimiques

camptothécine, étoposide , TEMPOL, l'acétate et le propionate de sels de sodium, et la caspase substrates Ac-DEVD-AMC (N-acétyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-méthylcoumarine), Ac-IETD-AMC (N-acétyl-Ile Glu-Thr-Asp-7-amido-4-méthylcoumarine) et Ac-LEHD-AFC (N-acétyl-Leu-Glu-His-Asp-7-amido-4-trifluorométhylcoumarine) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Saint -Quentin Fallavier, France). Camptothécine a été dissous dans du DMSO. La concentration finale de DMSO ne dépassait pas 0,01%, une concentration qui n'a induit aucune toxicité. ARNase A, PI (iodure de propidium), Hoechst H33342, MitoTracker® rouge CMXRos, TO-PRO-3, JC-1, l'iodure de 3,3'-dihexyloxacarbocyanine (DiOC6 (3)) et dihydroethidium (DHE) ont été obtenus auprès de Invitrogen ( Cergy-Pontoise, France). Annexin V-FITC (AV) kit et 7-aminoactinomycine-D (7-AAD) solution ont été fournies par BD Biosciences (Pont-de-Claix, France).

• PLOS ONE: E-cadhérine Comptes Déstabilisation de la pathogénicité des mutations faux-sens dans Hereditary Cancer Diffuse gastrique
• PLOS ONE: Identification du sérum microARN comme Biomarkers Novel non invasif pour le dépistage précoce du cancer gastrique