PLoS ONE: latte fermentato da Propionibacterium freudenreichii induce l'apoptosi di HGT-1 umano cancro gastrico cellule

Astratto

Sfondo

cancro gastrico è uno dei tumori più comuni nel mondo. Il "paesi economicamente sviluppati" stile di vita, tra cui la dieta, costituisce un fattore di rischio che favorisce questo tipo di tumore. modulazione dieta può ridurre l'incidenza del cancro dell'apparato digerente. Tra componenti alimentari promettenti, propionibatteri lattiero-caseari sono stati mostrati per innescare l'apoptosi delle cellule tumorali di colon umano, tramite il rilascio di catena corta acidi grassi acetato e propionato.

Metodologia /Principali risultati

Un latte fermentato , fermentato in esclusiva da P.
freudenreichii, è stato recentemente progettato. In questo lavoro, il potenziale pro-apoptotico di questo nuovo latte fermentato è stato dimostrato su cellule umane di cancro gastrico HGT-1. Fermentato surnatante latte indotto caratteristiche tipiche di apoptosi tra cui condensazione della cromatina, la formazione di corpi apoptotici, frammentazione del DNA, arresto del ciclo cellulare e l'emergere di una popolazione subG1, l'esposizione fosfatidilserina al foglietto esterno della membrana plasmatica, ossigeno accumulo di specie reattive, transmembrana mitocondriale potenziale interruzione, caspasi attivazione e rilascio di citocromo c. Sorprendentemente, questo nuovo latte fermentato contenente P. freudenreichii
potenziata la citotossicità della camptotecina, un farmaco usato nella chemioterapia cancro gastrico.

Conclusioni /Significato

Tale nuovo latte fermentato probiotici può quindi essere utile come parte di una dieta preventiva progettato per prevenire il cancro gastrico e /o come integratore alimentare per potenziare il cancro trattamenti terapeutici

Visto:. cugino FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, Jan G (2012) latte fermentato da Propionibacterium freudenreichii
induce l'apoptosi di HGT-1 umano cancro gastrico cellule. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10.1371 /journal.pone.0031892

Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 15 novembre 2011; Accettato: 19 gennaio 2012; Pubblicato: 19 marzo 2012

Copyright: © 2012 Cugino et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato finanziato dal Conseil Régional de Bretagne attraverso la chiamata Développement CBB per i progetti e dal Centro nazionale interprofessionale de l'Économie Laitière (CNIEL) attraverso dal Comitato scientifico di Syndifrais invito a presentare progetti. La ricerca nel gruppo IRSET è stata sostenuta da sovvenzioni dal Ligue Nationale Contre le Cancer (Costa d'Armor, Ille et Vilaine, Morbihan, Vandea e Sarthe COMITATI), INSERM, Università di Rennes 1 e la Regione Bretagne. FJC ha ricevuto una borsa di studio CNIEL (dottorato). SJL è stato sostenuto dalla Associazione pour la Recherche sur le Cancer (dottorato). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

dieta modula il rischio di sviluppare il cancro gastrico

il cancro è la principale causa di morte nei paesi economicamente sviluppati derivanti da scelte di vita di cancro-associata, tra cui il fumo, l'inattività fisica, e "occidentalizzato" dieta [ ,,,0],1]. In effetti, il ruolo della dieta nello sviluppo del cancro è fortemente supportata da studi epidemiologici, in particolare per quanto riguarda i tumori del tratto digerente. cancro gastrico (GC) rappresenta il terzo tipo di tumori letali per gli uomini nel mondo. Nel 2008, sono stati stimati 640.600 casi di CG, causando 464.400 morti in tutto il mondo [1]. Questa malattia è particolarmente frequente in Asia orientale, e in Europa centrale e orientale. I più importanti fattori eziologici coinvolti nella carcinogenesi gastrica sono dieta e Helicobacter pylori
infezione. prove sostanziali, soprattutto da studi caso-controllo, suggerisce che il rischio di contrarre GC è aumentato di alta assunzione di cibi salati, in salamoia o affumicati tradizionalmente, così come pesce essiccato e carne. Al contrario, le fibre, frutta e verdura fresca, forse a causa del loro contenuto di vitamina C, sono risultati essere inversamente associato al rischio GC [2], [3]. L'impatto di componenti naturali /alimentari sulla carcinogenesi dello stomaco è così studiata negli ultimi decenni [4] - [6]. Tra questi, probiotici e la loro capacità di inibire lo sviluppo del cancro hanno attratto l'interesse scientifico [7], [8]. Un probiotico è generalmente definito come "un microrganismo vivo che, quando somministrati in quantità adeguate, conferisce un vantaggio sanitario all'host" [9]. Mentre alcuni microrganismi come H. pylori
può favorire GC, altri possono avere un effetto benefico per la prevenzione dei tumori digestivi. In particolare, i ceppi selezionati di batteri probiotici possono limitare lo sviluppo del cancro in modelli animali di cancerogenesi [10]. Ciò è stato particolarmente evidenziato per il cancro del colon, mentre meno si sa sui possibili effetti dei probiotici in GC. Una possibile spiegazione meccanicistica di un tale effetto protettivo è il in situ
rilascio di metaboliti anti-cancerogene come gli acidi grassi a catena corta (SCFA).

acidi grassi a catena corta indurre l'apoptosi delle cellule tumorali

SCFA, tra cui l'acetato, propionato e butirrato, sono importanti anioni del contenuto intestinale e la loro concentrazione possono essere modulati dalla dieta. Essi hanno dimostrato di svolgere un ruolo chiave in importanti funzioni fisiologiche, tra cui la modulazione delle cellule epiteliali equilibrio proliferazione /apoptosi digestivo. Si tratta di SCFA mediata l'arresto del ciclo cellulare, l'inibizione deacetilasi degli istoni e la stimolazione apoptosi nelle cellule trasformate, ma anche la stimolazione della differenziazione nelle cellule sane [11], [12]. È stato inoltre riportato che il SCFAs butirrato e propionato sia indurre apoptosi nelle linee cellulari di carcinoma gastrico umano [13] - [15]. L'apoptosi è un regolazione naturale processo fisiologico che consente numero di cellule e costituisce un obiettivo per la chemioterapia anti-cancro [16]. L'apoptosi permette deplezione delle cellule tumorali in modo "pulito". Le cellule tumorali frammentano in una reazione a catena e coordinato i residui vengono assorbiti dai tessuti adiacenti e del sistema immunitario [17], [18]. Sono stati descritti due principali vie apoptotiche: via estrinseca, che è mediata da attivazione di recettori di morte e caspasi 8, e la via intrinseca, in cui sono coinvolti i mitocondri e caspasi 9 [16]. Generalmente, nelle cellule tumorali, la funzione apoptotica è carente, che può spiegare la loro proliferazione sostenuta e di conseguenza la formazione di tumori. La capacità di indurre l'apoptosi delle cellule tumorali così riconosciuta suo potenziale terapeutico [16]. Dal momento che propionibatteri lattiero-caseari sono in grado di produrre benefici SCFAs pro-apoptotici, che possono rivelarsi utili nella prevenzione o nel trattamento del cancro.

Propionibacterium freudenreichii
può favorire l'esaurimento apoptosi delle cellule tumorali digestivi

Questo Propionibacterium caseificio probiotico ha dimostrato di indurre la morte delle cellule di diverse linee cellulari tumorali di colon umano attraverso l'induzione di apoptosi, in co-colture [19]. I composti attivi, secreti nel mezzo, innescano l'intrinseca via apoptotica mitocondriale nelle cellule di cancro del colon-retto umane in coltura. In particolare, i SCFAs acetato e propionato di liberati da P. freudenreichii
indurre apoptosi agendo sul mitocondriale translocator nucleotide adenina, causando la depolarizzazione mitocondri e permeabilizzazione, fuoriuscita di citocromo c e attivazione delle caspasi [19], [20]. Tuttavia, surnatanti propionibacterial sono ancora più pro-apoptotica che l'acetato di SCFAs e propionato, usato alle concentrazioni misurate in surnatanti, suggerendo che altri composti possono essere coinvolti in questo effetto. ceppi di P selezionati. freudenreichii
rimanere vivo e metabolicamente attiva all'interno dell'intestino degli esseri umani e di ratti microbiota associato-umane dove si producono SCFAs [21], [22]. Di conseguenza, sono stati dimostrato di aumentare l'apoptosi nelle cellule epiteliali del colon trasformate di tali ratti alimentati con l'agente cancerogeno 1,2-dimetilidrazina (DMH), ma non in quelli sani di controllo [23]. Propionibatteri potrebbe costituire probiotici favoriscono la profilassi del cancro del colon, a condizione che raggiungano il loro obiettivo vivo e metabolicamente attiva. In questo contesto, il vettore, o veicolo di consegna probiotico, è stato mostrato per determinare la sopravvivenza propionibatteri e l'attività [21], [24], [25]. latticini complessi, come yogurt e formaggio, in particolare, proteggono propionibatteri dallo stress, ma contengono una miscela complessa di batteri. Non è dunque possibile attribuire l'effetto benefico per un particolare ceppo.

Un latte fermentato è stato valutato come veicolo di consegna propionibatteri in questo contesto

In questo studio, abbiamo utilizzato una nuova categoria alimentare latte fermentato contenente solo P. freudenreichii
come unica microflora. Poiché il prodotto contiene sia propionibatteri vivi e loro metaboliti attivi, li dovrebbe portare a contatto con la mucosa gastrica quando ingerita. Questo latte fermentato è stato studiato rispetto al HGT-1 gastrica cellule tumorali all'apoptosi induzione umana. Infatti, propionibatteri sono noti per uccidere le cellule tumorali di colon umano, ma il loro effetto sulle cellule di cancro gastrico è sconosciuta. Il latte fermentato ucciso HGT-1 cellule in maniera tempo e dose-dipendente. sono state osservate le caratteristiche tipiche del processo di apoptosi, tra cui goccia fattibilità, la condensazione della cromatina, la formazione di corpi apoptotici ', frammentazione del DNA, la produzione di ROS, potenziale di membrana mitocondriale perturbazione, attivazione delle caspasi, arresto del ciclo cellulare e l'emergere di una popolazione subG1.

Risultati

P. latte fermentato freudenreichii
uccide gastrico umano e le cellule tumorali del colon

P. freudenreichii
ITG P9 è cresciuto in 72 ore a 30 ° C nel latte integrato e completato ultrafiltrato latte per raggiungere la popolazione finale di 9,43 log 10 unità formanti colonie _{(CFU) /ml e 9,35 log 10 ufc /ml, rispettivamente. Le concentrazioni SCFA erano 26.21 mM acetato e 54.47 mM propionato (2.08 propionato /rapporto di acetato) nel latte fermentato surnatante mentre erano 24,00 mm e 53,32 mm (2.22 ratio) nel surnatante latte ultrafiltrato fermentato. Questi rapporti sono attesi per propionibatteri, che generalmente producono il doppio di quanto propionato come acetato [26]. Dodici altri ceppi latticini propionibatteri per alimenti sono stati testati (vedi Tabella S1 e Figura S1). L'utilizzo di questi ceppi, dodici latti fermentati sono stati ottenuti. Le concentrazioni propionato variava da 36 a 67 mm e propionibatteri popolazioni 9,0-9,7 log 10 ufc /ml, per i meno e per il ceppo più efficiente, rispettivamente.}

Il potenziale citotossico dei surnatanti ottenuti da latte o latte ultrafiltrato, sia fermentato per P. freudenreichii
ITG P9, è stato indagato. -29 HT cellule tumorali umane del colon e HGT-1 le cellule di cancro gastrico umano sono stati trattati con questi surnatanti. Diverse diluizioni che vanno da ½ a sono stati testati. Inoltre, la citotossicità di una miscela di 15 mM acetato 30 mM propionato è stato testato a concentrazioni intorno a supernatanti questi ½ diluiti. Come controllo positivo di induzione di apoptosi, la camptotecina farmaci chemioterapici (4 micron) ed etoposide (100 micron) sono stati utilizzati per le cellule HGT-1 e HT-29, rispettivamente. sono stati confrontati tre distinti metodi di monitoraggio morte cellulare. Come mostrato nella Figura S2, blu di metilene, MTT e trypan blue saggi esclusione dato cinetiche simili di morte. Di conseguenza, metilene dosaggio blue stato utilizzato in questo studio per valutare ulteriormente la vitalità cellulare. I latticini non fermentati (latte o ultrafiltrato latte) non ha avuto effetto, né su HT-29, né HGT-1 vitalità cellulare (Fig. 1 A, B). Il surnatante di latte o latte ultrafiltrato fermentato da P.
freudenreichii indotto una citotossicità simile in un modo dipendente dal tempo in HT-29 e cellule HGT-1, e vicino alla citotossicità indotta da farmaci o dalla miscela acetato /propionato. uccisione di mezza massimo HGT-1 le cellule si è verificato dopo 24 ore e 26 ore di trattamento con il latte fermentato e latte fermentato ultrafiltrato surnatanti rispettivamente, dopo 17 ore di trattamento con camptotecina e dopo 24 ore di trattamento con miscela SCFA (Fig. S3) . Inoltre, la citotossicità dei surnatanti prodotto caseario fermentato in HGT-1 cellule era dose-dipendente (Fig. 1C). Per ogni diluizione testata, il calo HGT-1 vitalità cellulare indotta dal latte fermentato o ultrafiltrato latte fermentato era molto simile (Fig 1C &. Fig. S3). È per questo che i prossimi passi dello studio che abbiamo effettuato solo con il surnatante latte ultrafiltrato fermentato. Presi insieme, questi dati indicano che propionibatteri uccidono efficiente colon umano e cellule di cancro gastrico, almeno in parte attraverso la produzione di propionato e acetato (Fig. 1). Alcuni altri latti fermentati, fermentati da ceppi diversi prodotti lattiero-caseari propionibatteri, hanno mostrato effetti citotossici simili sulle cellule tumorali (Tabella S2). P. freudenreichii
ITG P9 essere conosciuto per la sua attività metabolica in vivo
[22], il latte fermentato corrispondente è stato ulteriormente studiato.

P. latte fermentato freudenreichii
induce segni tipici di apoptosi nelle cellule di cancro gastrico umano

morfologia Nucleo di HGT-1 cellule incubate in presenza di P. freudenreichii
ultrafiltrato latte fermentato è stato analizzato al microscopio a fluorescenza dopo Hoechst 33342 colorazione (Fig. 2A). La fluorescenza nucleare di cellule non trattate (controllo) è rimasto invariato nel corso del tempo l'esperimento con nuclei normale blu (tempo 0 h, Fig. 2 bis bis). Durante il trattamento, le cellule HGT-1 visualizzati i cromatina e nuclei frammentati caratteristiche condensati di nuclei apoptotici (Fig. 2 bis ter, c), seguiti dalla comparsa di corpi apoptotici a 72 ore (Fig. 2ad). Inter-nucleosomal frammentazione del DNA con conseguente frammentazione del DNA, un segno tipico di apoptosi [27], è stata monitorata anche durante il trattamento del latte ultrafiltrato fermentato. frammentazione del DNA è stata osservata da 24 ore di trattamento con fermentato ultrafiltrato latte (Fig. 2B), e, in misura minore, con camptotecina (Fig. S3). contenuto di DNA è stato quantificato anche in citometria a flusso dopo l'etichettatura ioduro di propidio per studiare l'impatto di ultrafiltrato latte fermentato in HGT-1 di distribuzione del ciclo cellulare (Fig. 2C). Non trattati cellule HGT-1 hanno presentato una distribuzione del ciclo cellulare (Fig. 2Ca) senza fase subG1, che è rimasto invariato nel corso momento dell'esperimento (dati non riportati). La percentuale di cellule in fase di subG1, indicativo di un processo apoptotico, significativamente aumentata con il tempo durante fermentato trattamento del latte ultrafiltrato (Fig 2Cb, Cc, Cd.): A 24 h (39,24 ± 4,87%), a 48 h (91,63 ± 0,28 %) e dopo 72 h (94,79 ± 0,45%). A 48 he 72 h di trattamento, tutte le cellule erano in fase di ciclo cellulare subG1, indicando la morte completa di HGT-1 cellule. Come controllo, camptotecina indotto simili caratteristiche apoptotici in HGT-1 le cellule (Fig. S4).

Per confermare l'induzione di apoptosi, phosphatdylserine traslocazione dal interna al foglietto esterno della membrana plasmatica è stata valutata dalla colorazione HGT- 1 le cellule con una combinazione di annessina V-FITC (AV) e 7-AAD, seguita da analisi di citometria a flusso di fluorescenza (Fig. 3). cellule non trattate (0 h) ha presentato una elevata percentuale di cellule vive (AV ^{- /7AAD -; 92%) e solo il 5% delle cellule sono state colorate con annessina V (Fig 3B.). Queste percentuali determinate in cellule non trattate non sono cambiati nel corso dell'esperimento, (dati non mostrati). Durante il trattamento di HGT-1 cellule con ½ diluita ultrafiltrato latte fermentato in DMEMc, la percentuale di cellule colorato solo del 7-AAD (necrosi indicando) era molto bassa (Fig. 3B). Tuttavia, le percentuali di cellule colorate con Annessina V aumentato in modo significativo in un modo dipendente dal tempo e ha raggiunto 80% a 72 ore (Fig. 3B). Quindi, le cellule HGT-1 sono stati sottoposti apoptosi dopo il trattamento con P. freudenreichii
latte fermentato ultrafiltrato, caratterizzato da prima colorazione positiva AV, che indica l'esposizione fosfatidilserina, e quindi sia AV e 7-AAD colorazione positiva, indicando una perdita successiva di integrità della membrana. Come controllo, camptotecina indotto simili apoptotici caratteristiche (Fig S5.)}

Come SCFA agire direttamente sui mitocondri, sono stati anche determinati tre importanti parametri mitocondriali:. Il potenziale di membrana interna ΔΨm, e la generazione di ROS, utilizzando due sonde fluorescenti, DiOC (6) 3 (che è ΔΨm-sensitive) e DHE (che rileva O _{2 ^{- livello), e la localizzazione del citocromo c. cellule non trattate (0 h) hanno mostrato una elevata fluorescenza (alta ΔΨm) e una a fluorescenza a basso DHE (bassa produzione di O 2 -) (Fig. 4A, B). Dopo il trattamento con ultrafiltrato latte fermentato, una diminuzione dipendente dal tempo in incorporazione di DiOC6 (3) sonda fluorescente è stato osservato, rivelando una perdita di ΔΨm e depolarizzazione della membrana mitocondriale quindi (Fig. 4A). Le percentuali di trattati HGT-1 cellule con diminuzione del potenziale di membrana interna aumentata in modo dipendente dal tempo per raggiungere il 96% di cellule a 72 h. trattamento FCCP è stato utilizzato come controllo positivo di depolarizzazione della membrana mitocondriale. Questa perdita di ΔΨm stata confermata dalla perdita caratteristica fluorescenza rossa seguente JC-1 colorazione (Fig. 4B). Per quanto riguarda la produzione di ROS in HGT-1 le cellule, latte fermentato trattamento ultrafiltrato indotta accumulo di O 2 -, in modo significativo dopo 48 ore e 72 ore di trattamento (Fig 4C.). Questo accumulo ROS può essere parzialmente evitato se le cellule vengono pre-trattati dalla scavenger TEMPOL ROS (Fig. S6). Citocromo c rilascio dai mitocondri nel citoplasma è un evento chiave cellulare del programma apoptotico. Immunoblotting esame delle frazioni citoplasma arricchita per la presenza di citocromo c confermato un cambiamento nella sua localizzazione subcellulare (Fig. 4D). Citocromo c è stato rilevato nella frazione citoplasma arricchita da 24 ore di trattamento, che indica il trasferimento di questa proteina (Fig. 4D). Questa rilocalizzazione del citocromo c nel citoplasma è stata confermata da immunocolorazione, mostrando immunostaining diffusa in tutta la cellula dopo il trattamento, mentre la colorazione punteggiati prima del trattamento (Fig. 4E).}}

P. freudenreichii
latte fermentato attiva caspasi

Per confermare i meccanismi apoptotici indotti da ultrafiltrato latte fermentato in HGT-1 le cellule, l'elaborazione delle caspasi 3, 8 e 9 è stata analizzata mediante western blotting e corrispondente monitoraggio attività enzimatiche in HGT estratti cellulari -1 (Fig. 5). L'ultrafiltrato latte non fermentato non ha indotto l'attivazione delle caspasi in HGT-1 le cellule: solo i proforms di caspasi-3 e -9 sono stati rilevati su Western Blot (Fig. 5a) e nessuna attività è stata misurata caspasi (Fig 5B.). Il surnatante fermentato latte ultrafiltrato, nonché la camptotecina o la miscela di propionato e acetato in una [2: 1] rapporto molare, indotto la scissione del pro-caspasi 3 e la generazione delle forme attive di caspasi-3, le subunità p17 e p12 (Fig. 5A). L'attivazione della caspasi-3, che è un effettore caspasi, ha confermato l'induzione dell'apoptosi. Inoltre, fermentato ultrafiltrato latte indotto scissione di procaspase-9, che porta a 35 e 37 kDa forme trasformati. Caspase-8 non è stato rilevato nel controllo non trattati HGT-1 le cellule. Tuttavia, il trattamento con surnatanti propionibacterial o miscela C2 /C3 ha portato ad una chiara individuazione del 54 kDa PROFORM, seguito dalla sua scissione dopo 48 ore di trattamento

La quantificazione della caspasi-3, -8 e. - 9 attività enzimatiche confermato l'attivazione delle caspasi da entrambi i metaboliti propionibacterial e camptotecina. Infatti, caspasi-9 e -3 sono stati attivati ​​nelle prime fasi del trattamento, mentre la caspasi-8 sembrava attivato in seguito (Fig. 5B). Camptothecin e la miscela SCFA attivate tutte le tre caspasi studiate. Questi dati hanno confermato l'attivazione della via intrinseca di apoptosi mediante trattamento latte ultrafiltrato fermentato, con una precoce attivazione della caspasi-9 e quindi della caspasi-3 e -8.

P. latte fermentato freudenreichii
aumenta la citotossicità camptotecina

Campthotecin è un alcaloide chinolina citotossico che inibisce la topoisomerasi enzima DNA I (topo I) ed è ampiamente utilizzato nel trattamento chemioterapico di GC. Abbiamo dimostrato in precedenza che i metaboliti propionibacterial inducono l'apoptosi in HGT-1 le cellule attraverso il percorso di morte mitocondriale. Abbiamo poi studiato apoptosi indotta dalla combinazione di entrambi camptotecina e fermentato ultrafiltrato latte HGT-1 cellule. L'aumento delle concentrazioni di camptotecina (0, 0.25, 0.5, 1, 2 micron) in combinazione con un aumento delle concentrazioni di ultrafiltrato latte fermentato (0,, ⅛, ¼) sono stati testati su HGT-1 la vitalità delle cellule e sia la perdita indotta HGT-1 viabilità , in modo dose-dipendente (Fig. 6). Inoltre, l'aggiunta di ultrafiltrato latte fermentato migliorato significativamente la citotossicità della camptotecina in HGT-1 cellule (Fig. 6). Ad esempio, 0,25 mM camptotecina e fermentato ultrafiltrato latte diluite a ⅛ comportato una perdita redditività del 8,6% e 18,6% rispettivamente. La combinazione di questi due composti portato a una perdita di vitalità cellulare 29,8% (Fig. 6), suggerendo un effetto citotossicità aggiunta quando camptotecina è stato combinato con ultrafiltrato latte fermentato in HGT-1 cellule. Di conseguenza, l'indice di combinazione (CI), calcolato come in precedenza [28], ha un valore di 1, indicando un effetto additivo della camptotecina e fermentato trattamenti ultrafiltrato latte.

Discussione

Una nuova fermentato latte, contenente P. freudenreichii
come un unico batterio, è stato sviluppato al fine di indagare ulteriormente il potenziale probiotico di questa preparazione casearia di propionibatteri (rivisto in [29]). In questo studio, si segnala che la fase acquosa di questo latte fermentato uccide colon umano e cellule di cancro gastrico attraverso metaboliti, tra cui propionato e acetato, rilasciati da questo batterio. Questo concetto si basa sugli effetti citotossici osservati di P. freudenreichii
fermentato surnatanti latte su colta HT-29 e HGT-1 le cellule tumorali. Questo effetto è stato ottenuto con supernatanti ultracentrifugazione, ossia la fase acquosa latte fermentato, privi di caseine e di batteri, che mostra che i composti attivi sono secreti, come precedentemente descritto per propionibatteri [19]. Per questo motivo, la maggior parte degli esperimenti in questo lavoro sono stati eseguiti con ultrafiltrato latte fermentato (Fig. 1). Abbiamo dimostrato per la prima volta che P. freudenreichii
fermentato apoptosi indotta latte surnatante di HGT-1 le cellule in maniera tempo e dose-dipendente, con la comparsa di caratteristiche classiche morfologiche e biochimiche di apoptosi (condensato e chromation frammentato, frammentazione del DNA e l'accumulo di cellule nel ciclo cellulare subG1 fase).

Abbiamo guardato allora se i meccanismi cellulari coinvolti nella HGT-1 percorso di morte cellulare erano simili al percorso di morte mitocondriale innescato in Caco-2 e HT-29 cellule tumorali di colon umano di P. freudenreichii
sovranatanti DMEMc [19], [20]. Gli eventi sub-cellulari e biochimiche osservate in trattati HGT-1 le cellule con ultrafiltrato latte fermentato erano simili e compresi, almeno, la perdita ΔΨm mitocondriale, ROS (O _{2 ^{-) generazione, trasformazione caspasi e l'attivazione, il citocromo c trasferimento nel citoplasma (Fig. 3, 4, 5). Fermentato surnatante latte indotta trasformazione e attivazione della caspasi-8, oltre a caspasi -3 e -9. Inoltre, la Figura 4A indica che caspasi-8 non viene rilevato in cellule non trattate di controllo e in cellule trattate con camptotecina o non fermentati ultrafiltrato latte, in linea con la mancanza del suo mRNA (C. Le Jossic-Corcos, Facoltà di Medicina, Brest , Francia, comunicazione personale). Si noti che esiste un'evidente discrepanza tra i risultati enzimatiche, suggerendo l'attività della caspasi-8 in cellule trattate camptotecina, mentre nessun caspasi-8 viene rilevato in queste cellule mediante western blotting. Questo può essere spiegato dalla mancanza di specificità del substrato Ac-IETD-AMC, che può essere elaborato da altri enzimi come la caspasi -3 e -10 o granzyme B, soprattutto se la concentrazione di tali enzimi è elevata [30], [31]. Al contrario, P. freudenreichii
fermentato ultrafiltrato latte e la miscela di SCFA sia causato espressione e l'attivazione della caspasi-8. I meccanismi coinvolti qui non vengono chiariti; tuttavia, caspase-8 si caratterizza per essere sotto-espressi in alcune cellule tumorali come risultato di metilazione del DNA [32], [33]. La sua espressione può essere ripristinato a livello di RNA e proteine ​​da agenti demetilanti come decitabine [34] e inibitori HDAC [35], con conseguente demetilazione della sequenza regolatrice di caspasi-8, un aumento della caspasi-8 promotore attività e in re -expression di caspasi-8 [32]. SCFA, quali propionato, sono inibitori HDAC, portando a hyperacetylation degli istoni [36]. Ciò favorisce la trascrizione attraverso un cambio di conformazione DNA [37] e potrebbe ripristinare l'espressione caspasi-8. Altri composti alimentari di origine sono stati già mostrati per ripristinare la caspasi-8 espressione. Un estratto iniettabile di Semen Coicis
(un parente di mais) estratto la visualizzazione di attività anti-tumorale aumenta l'espressione di caspasi 8 e induce apoptosi nelle cellule HepG2 [38]. Disolfuro di diallile, trovato in aglio, aumenta l'espressione di caspasi-8, Fas e FasL nelle cellule K562 leucemia. Tale regolamento può quindi essere coinvolta negli effetti pro-apoptotici di propionibatteri latte e dei prodotti fermentati che li contengono. Western Blotting evidenziato ripristinato espressione ed attivazione poi tardiva di caspasi-8 in propionibacterial HGT-1 cellule metaboliti-trattati, che possono verificarsi a seguito di caspasi-8 di attivazione da un altro caspasi come caspasi-9. Infatti, l'uscita del citocromo c, parte della via mitocondriale, ha dimostrato di attivare più caspasi cui 2, 3, 6, 7, 8 e 10 [39]. Inoltre, caspasi-9 di attivazione è stato mostrato risultato nel down-stream caspasi-8 di attivazione [40]. Di conseguenza, è stato mostrato caspasi-9 in vitro
per attivare caspasi-3 che a sua volta attiva la caspasi-6, responsabile della caspasi-8 di attivazione [41]. Complessivamente, i nostri risultati confermano che i metaboliti propionibacterial presenti in P. freudenreichii
latte fermentato induce diversi meccanismi sub-cellulari che favoriscono l'apoptosi. Tale riattivazione di caspasi-8 espressione potrebbe portare ad una importante risposta apoptotica in HGT-1 le cellule trattate con morte recettori dominio agonisti (ad esempio Trail o Fas).}}

A nostra conoscenza, questo è il primo lavoro di reporting specifica induzione di apoptosi gastrico delle cellule tumorali da un prodotto lattiero-caseario fermentato. latti fermentati, tra cui yogurt, sono stati proposti per essere utile nella prevenzione del cancro al colon. I dati epidemiologici sugli effetti protettivi del latte e dei prodotti lattiero-caseari sul tasso di cancro al colon hanno dato risultati contrastanti [42]. Latte e prodotti lattiero-caseari di consumo totale è associato ad una riduzione del rischio di cancro del colon-retto. Ma questo non è vero per tutti i tipi di prodotti lattiero-caseari e gli effetti variano notevolmente. prodotti lattiero-caseari fermentati possono costituire veicoli di consegna efficienti per indirizzare molecole protettive o microrganismi a siti specifici, come l'epitelio digestivo [43]. lattoferrina bovina, un costituente del latte, induce apoptosi di colon [44] e gastrici cellule [45] cancro. ceppi selezionati di microrganismi presenti nel latti fermentati possono anche contrastare la carcinogenesi del colon. Di conseguenza, yogurt e acido lattico batteri esposti proprietà anti-cancro in modelli animali di carcinogenesi del colon [46]. Tuttavia, poco lavoro si è concentrato sui prodotti lattiero-caseari fermentati e cancro gastrico. Il nostro lavoro suggerisce che P. freudenreichii
potrebbe svolgere un ruolo in questo contesto, in quanto sarebbe fornire sia propionibatteri live e metaboliti pro-apoptotici per la mucosa gastrica. In questo contesto, si noti che P. freudenreichii
aderisce digestivi cellule epiteliali e di muco [47], [48]. E 'stato anche dimostrato di inibire l'adesione dell'agente eziologico del cancro gastrico Helicobacter pylori
per digestivi cellule epiteliali, così come H. pylori
danni -indotta [49]. Queste proprietà suggeriscono un ruolo di P. freudenreichii
latte fermentato nella profilassi del cancro gastrico.

Infine, il nostro latte fermentato potentialized l'azione pro-apoptotica della camptotecina farmaco su cellule di cancro gastrico. Di conseguenza, colture vive di lattobacilli probiotici sono stati precedentemente dimostrato di sensibilizzare le cellule tumorali del colon-retto LS513 a 5-fluorouracile [50]. Tuttavia, in questo caso, i probiotici da sola non ha avuto effetto proapoptotico. In questo lavoro, basse dosi di camptotecina farmaco usato nella chemioterapia cancro gastrico erano inefficienti nell'uccidere le cellule del cancro gastrico. Tuttavia, in presenza di basse dosi di P. freudenreichii
latte fermentato, hanno ucciso le stesse cellule in modo efficiente (Fig. 6). metaboliti Propionibacterial inducono l'apoptosi pathway intrinseco agendo direttamente sui mitocondri, mentre camptotecina agisce a livello del DNA. Ciò è coerente con il loro potenziale cumulato in apoptosi quando questi induttori pro-apoptotici sono combinati. Inoltre, il latte fermentato contiene SFCAs, noti come inibitori HDAC grado di modulare l'apoptosi e ciclo cellulare in cellule di cancro gastrico [13], [51] e l'espressione del ciclo cellulare inerenti e proteine ​​apoptotiche in altre cellule tumorali [52], [53]. I probiotici sono stati già utilizzati negli studi clinici per ridurre gli effetti collaterali della chemioterapia cancro [54]. P.
freudenreichii può, secondo i nostri risultati, essere utilizzato in questi studi clinici. Il suo effetto sinergico può aiutare a diminuire la dose di droga e migliorare il comfort dei pazienti.

In conclusione, un nuovo latte, fermentato in esclusiva da P.
freudenreichii, l'apoptosi indotta in HGT-1 le cellule di cancro gastrico umano. Inoltre, questo latte fermentato migliorato l'attività citotossica camptotecina, farmaco usato nella chemioterapia del cancro gastrico. Tale nuovo latte fermentato probiotici potrebbe essere di interesse come un alimento funzionale per prevenire il cancro gastrico e /o di potenziare i trattamenti terapeutici.

Materiali e Metodi

Sostanze chimiche

Camptothecin, etoposide , TEMPOL, acetato, propionato sali di sodio, e caspasi substrati Ac-DEVD-AMC (N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-ammido-4-metil), Ac-IETD-AMC (N-acetil-Ile -Glu-Thr-Asp-7-Amido-4-metil) e Ac-LEHD-AFC (N-acetil-Leu-Glu-His-Asp-7-ammido-4-trifluoromethylcoumarin) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (San -Quentin Fallavier, Francia). Camptotecina è stato sciolto in DMSO. La concentrazione finale di DMSO non ha superato lo 0,01%, una concentrazione che non induce alcuna tossicità. RNasi A, PI (ioduro di propidio), Hoechst H33342, MitoTracker® Rosso CMXRos, TO-PRO-3, JC-1, 3,3'-dihexyloxacarbocyanine ioduro (DiOC6 (3)) e dihydroethidium (DHE) sono stati ottenuti da Invitrogen ( Cergy-Pontoise, Francia). soluzione annessina V FITC-(AV) kit e 7-aminoactinomycin-D (7-AAD) sono stati forniti da BD Biosciences (Pont-de-Claix, Francia).

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