PLOS ONE: fermenterad mjölk från Propionibacterium freudenreichii inducerar apoptos av HGT-1 Human Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Bakgrund

Gastric cancer är en av de vanligaste cancerformerna i världen. Den "ekonomiskt utvecklade länder" livsstil, bland annat kost, utgör en riskfaktor gynnar denna cancer. Diet modulation kan sänka mag cancerincidens. Bland lovande livsmedelskomponenter, var mejeri propionibakterier visat sig utlösa apoptos av humana koloncancerceller via frisättningen av kortkedjiga fettsyrorna acetat och propionat.

Metodik /viktigaste resultaten

En fermenterad mjölk uteslutande fermenteras av P. freudenreichii
, nyligen utformade. I detta arbete, var pro-apoptotiska potentialen hos denna nya fermenterad mjölk visade på HGT-1 humana gastriska cancerceller. Fermenterad mjölk supernatant inducerad typiska drag för apoptos, inklusive kromatinkondensation bildning av apoptotiska kroppar, DNA laddering, cellcykelstopp och framväxten av en subG1 befolkning, fosfatidylserin exponeringen vid plasmamembranet yttre information, reaktiva syreradikaler ackumulation, mitokondriell membranpotential störningar, kaspas aktivering och cytokrom c release. Anmärkningsvärt, denna nya fermenterad mjölk som innehåller P. freudenreichii
förbättrade cytotoxiciteten hos kamptotecin, ett läkemedel som används i gastrisk cancerkemoterapi.

Slutsatser /Signifikans

En sådan ny probiotisk fermenterad mjölk kan således vara användbara som del av ett förebyggande diet avsedd att förebygga magcancer och /eller som ett kosttillskott för att förstärka cancer terapeutiska behandlingar

Citation. Cousin FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, jan G (2012) fermenterad mjölk av Propionibacterium freudenreichii
inducerar apoptos av HGT-1 Human Gastric cancerceller. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10.1371 /journal.pone.0031892

Redaktör: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA

Mottagna: 15 november 2011. Accepteras: 19 januari 2012, Publicerad: 19 mars 2012 |

Copyright: © 2012 Cousin et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete finansierades av Conseil régional de Bretagne genom CBB développement uppmaning till projekt och det nationella centret Interprofessionnel de l'Économie laitière (CNIEL) igenom av vetenskapliga kommitté Syndifrais uppmaning till projekt. Forskning inom IRSET gruppen stöddes av bidrag från Ligue Nationale Contre le Cancer (Côte d'Armor, Ille et Vilaine, Morbihan, Vendée och Sarthe Comittees), INSERM, Rennes universitet 1 och regionen Bretagne. FJC fått ett bidrag från CNIEL (doktorandtjänst). SJL stöddes av Association pour la Recherche sur le Cancer (doktorandtjänst). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

diet modulerar risk att utveckla magcancer

cancer är den främsta dödsorsaken i ekonomiskt utvecklade länder till följd av cancerassocierade livsstilsval, inklusive rökning, fysisk inaktivitet, och "västerländska" diet [ ,,,0],1]. I själva verket är den roll av diet i cancerutveckling starkt stöd från epidemiologiska studier, särskilt när det gäller cancer i mag-tarmkanalen. Magcancer (GC) representerar den tredje typen av dödliga cancer för män i världen. Under 2008 var 640.600 fall av GC uppskattas orsaka 464.400 dödsfall i världen [1]. Sjukdomen är särskilt vanligt i östra Asien, och i centrala och östra Europa. De viktigaste etiologiska faktorer som gastric cancer är kost och Helicobacter pylori
infektion. Betydande bevis, främst från fall-kontrollstudier, tyder på att risken att insjukna i GC ökar med högt intag av saltade, inlagd eller rökt traditionellt livsmedel, liksom torkad fisk och kött. Tvärtom, fibrer, färska grönsaker och frukt, kanske på grund av sin C-vitaminhalten, befanns vara omvänt samband med GC risk [2], [3]. Effekterna av naturliga /livsmedelskomponenter på cancer i magen har därför undersökts under de senaste decennierna [4] - [6]. Bland dessa, probiotika och deras förmåga att hämma utvecklingen av cancer lockade vetenskapligt intresse [7], [8]. En probiotisk definieras allmänt som "en levande mikroorganism, som, när de administreras i tillräckliga mängder, ger en hälsomässig fördel för värden" [9]. Medan vissa mikroorganismer som H. pylori
kan gynna GC, andra kan ha en positiv effekt genom att förhindra cancer i matsmältningsapparaten. I synnerhet kan utvalda stammar av probiotiska bakterier begränsa utvecklingen av cancer i djurmodeller för cancer [10]. Detta var särskilt tydligt för tjocktarmscancer, medan mindre är känt om de möjliga effekterna av probiotika på GC. En möjlig mekanistisk förklaring av en sådan skyddande effekt är den in situ
frisättning av anti-cancerogena metaboliter såsom kortkedjiga fettsyror (SCFA).

kortkedjiga fettsyror inducera apoptos av cancerceller

SCFA, inklusive acetat, propionat och butyrat, är viktiga anjoner av tarminnehållet och deras koncentration kan moduleras genom dieten. De visade sig spela en viktig roll i viktiga fysiologiska funktioner, inklusive modulering av matsmältnings epitelceller spridning /apoptos balans. Detta innebär SCFA-medierad cellcykelstopp, histondeacetylas hämning och apoptos stimulering i transformerade celler, men också stimulering av differentiering i friska celler [11], [12]. Det har också rapporterats att SCFA butyrat och propionat både inducera apoptos i humana gastriska karcinom-cellinjer [13] - [15]. Apoptos är en naturlig fysiologisk process tillåter mobilnummer reglering och utgör ett mål för cytostatikabehandling [16]. Apoptos kan utarmning av cancerceller i en "ren" sätt. Cancerceller fragment i en samordnad kedjereaktion och resterna absorberas av intilliggande vävnader och immunsystem [17], [18]. Två huvudsakliga apoptotiska reaktionsvägar har beskrivits: den yttre vägen, som förmedlas genom aktivering av dödsreceptorer och kaspas 8, och inre vägen, i vilka mitokondrier och kaspas 9 är inblandade [16]. I allmänhet, i cancerceller, är den apoptotiska funktionen saknas, vilket kan förklara deras ihållande proliferation och följaktligen bildandet av tumörer. Förmågan att inducera apoptos av cancerceller är således känt för sin terapeutiska potential [16]. Eftersom mjölk propionibakterier kan producera nyttiga pro-apoptotiska SCFA kan de vara till nytta för att förebygga eller behandla cancer.

Propionibacterium freudenreichii
kan gynna apoptotiska utarmning av matsmältningscancerceller

Denna probiotiska mjölk Propionibacterium visades inducera celldöd av olika humana koloncancercellinjer genom apoptos induktion, i samodlingar [19]. De aktiva föreningarna, som utsöndras i mediet, utlösa den inneboende mitokondriell apoptotiska vägen i odlade humana kolorektala cancerceller. I synnerhet SCFA acetat och propionat släpptes av P. freudenreichii
inducera apoptos genom att agera på den mitokondriella adeninnukleotid transloka, orsakar mitokondrier depolarisation och permeabilisering, läckage av cytokrom c och kaspasaktivering [19], [20]. Men propionibacterial supernatanter är ännu mer pro-apoptotiska än SCFA acetat och propionat, som används vid de koncentrationer som uppmätts i supernatanterna, vilket tyder på att andra föreningar kan vara inblandade i denna effekt. Utvalda stammar av P. freudenreichii
förbli levande och metaboliskt aktiva i tarmen hos människor och normalflora associerade råttor där de producerar SCFA [21], [22]. Följaktligen var de visat sig öka apoptos i transformerade kolon epitelceller i sådana råttor som matats med cancerframkallande 1,2-dimetylhydrazin (DMH), men inte i kontroll friska [23]. Propionibacteria skulle kunna utgöra probiotika gynnar tjocktarmscancer profylax, under förutsättning att de når sina mål i livet och metaboliskt aktiva. I detta sammanhang, vektorn, eller probiotiska leveransfordon, visade sig avgöra propionibakterier överlevnad och aktivitet [21], [24], [25]. Komplexa mejeriprodukter såsom yoghurt och ost, i synnerhet skydda propionibakterier från stress, men innehåller en komplex blandning av bakterier. Det är därför inte möjligt att tillskriva den gynnsamma effekten till en speciell stam.

En fermenterad mjölk utvärderades som propionibakterier leveransfordon i detta sammanhang

I denna studie använde vi en ny livsmedelskvalitet fermenterad mjölk innehållande endast P. freudenreichii
som enda mikroflora. Eftersom denna produkt innehåller både levande propionibakterier och deras aktiva metaboliter, bör det ta dem i kontakt med magslemhinnan vid förtäring. Detta fermenterad mjölk undersöktes med avseende på HGT-en mänsklig gastric cancerceller apoptos induktion. I själva verket är propionibakterier kända för att döda humana koloncancerceller, men deras effekt på gastriska cancerceller är okänd. Den fermenterade mjölken dödade HGT-1-celler på ett tids- och dosberoende sätt. Typiska egenskaper hos apoptosprocessen observerades, inklusive lönsamhet droppe, kromatinkondensation, apoptotiska kroppar "formation, DNA laddering, ROS produktion, mitokondriell membranpotential störning, kaspasaktivering, cellcykelstopp och framväxten av en subG1 befolkning.

Resultat

P. freudenreichii
fermenterad mjölk dödar mänskliga mag- och koloncancerceller

P. freudenreichii
ITG P9 växte i 72 timmar vid 30 ° C i kompletterat mjölk och kompletteras mjölk ultrafiltrat att nå en slutlig befolkning på 9,43 log _{10 kolonibildande enheter (cfu) /ml och 9,35 log 10 cfu /ml, respektive. SCFA-koncentrationer var 26,21 mM acetat och 54,47 mM propionat (2,08 propionat /acetat förhållande) i mjölken jästa supernatanten medan de var 24,00 mM och 53,32 mM (2,22 ratio) i den fermenterade mjölk ultrafiltratet vätskan. Dessa förhållanden förväntades för propionibakterier, som i allmänhet producerar dubbelt så mycket propionat som acetat [26]. Tolv andra livsmedelskvalitet mejeri Propionibacteria stammar testades också (se tabell S1 och figur S1). Med användning av dessa stammar har tolv fermenterade mjölk erhålles. Propionat koncentrationer varierade från 36 till 67 mm och Propionibacteria populationer 9,0-9,7 log 10 cfu /ml, för de mindre och för den mest effektiva stammen, respektive.}

Den cytotoxiska potential supernatanter framställts av mjölk eller mjölk ultrafiltrat, både jäst av P. freudenreichii
ITG P9, undersöktes. HT-29 humana koloncancerceller och HGT-1 humana gastriska cancerceller behandlades med dessa supernatanter. Olika utspädningar från ½ till testades. Dessutom var cytotoxiciteten av en blandning av 15 mM acetat och 30 mM propionat testas vid koncentrationer som ligger nära dessa ½ utspädda supernatanter. Som positiva kontroller av apoptosinduktion, var den cytostatika camptotecin (4 ^ iM) och etoposid (100 ^ M) som används för HGT-1 och HT-29-celler, respektive. Tre olika metoder för celldöd övervakning jämfördes. Såsom visas i figur S2, metylenblått, MTT och trypanblåexklusion analyser gav liknande kinetik för döden. Följaktligen metylenblått analys som användes i denna studie för att ytterligare bedöma cellviabilitet. De icke-fermenterade mejeriprodukter (mjölk eller mjölk ultrafiltrat) hade ingen effekt, vare sig på HT-29, och inte heller på HGT-1 cellviabilitet (fig. 1 A, B). Supernatanten av mjölk eller mjölk ultrafiltrat fermenteras av P. freudenreichii
inducerade en liknande cytotoxicitet på ett tidsberoende sätt i HT-29 och HGT-1-celler, och i närheten av cytotoxicitet inducerad av läkemedel eller av-acetat /propionat-blandningen. Halv-maximal avdödning av HGT-1-celler skedde efter 24 h och 26 h från behandlingen med den fermenterade mjölken och fermenterade mjölk ultrafiltrat supernatanter respektive efter 17 h av behandling med kamptotecin och efter 24 h av behandling med SCFA-blandning (Fig. S3) . Dessutom cytotoxiciteten av fermenterade mejeriprodukter supernatanter i HGT-1-celler var dosberoende (Fig. 1C). För varje testad utspädning, nedgången i HGT-1 cellviabiliteten induceras av den fermenterade mjölken eller fermenterad mjölk ultrafiltratet var mycket lika (Fig 1C &. Fig. S3). Det är därför nästa steg i studien vi endast utföras med den fermenterade mjölk ultrafiltratet vätskan. Sammantaget indikerar dessa data att propionibakterier dödar effektivt mänsklig kolon och gastric cancerceller, åtminstone delvis via produktionen av propionat och acetat (fig. 1). Några andra jästa mjölk, jästa av olika mejeri Propionibacteria stammar, visade liknande cytotoxiska effekter på cancerceller (Tabell S2). P. freudenreichii
ITG P9 är känd för sin metaboliska aktivitet In vivo
[22], motsvarande fermenterade mjölken studerades ytterligare.

P. freudenreichii
fermenterad mjölk inducerar typiska markerar av apoptos i humana gastriska cancerceller

Nucleus morfologin hos HGT-1-celler inkuberade i närvaro av P. freudenreichii
fermenterad mjölk ultrafiltratet analyserades med fluorescensmikroskopi efter Hoechst 33342 färgning (Fig. 2A). Kärnkrafts fluorescens av obehandlade celler (kontroll) var oförändrad under tidsförloppet av experimentet med blå normal kärnor (tid 0 h, Fig. 2AA). Under behandlingen, HGT-1-celler uppvisade kondense kromatin och fragmenterade kärnor egenskaper apoptotiska kärnor (Fig. 2AB, c), följt av uppkomsten av apoptotiska kroppar på 72 timmar (Fig. 2AD). Inter-nukleosomal DNA-fragmentering resulterar i DNA laddering, en typisk märke apoptos [27], även övervakas under fermenterad mjölk ultrafiltrat behandling. DNA-fragmentering observerades från 24 h av behandling med fermenterad mjölk ultrafiltrat (fig. 2B), och i mindre utsträckning med kamptotecin (Fig. S3). DNA-innehållet var också kvantifieras genom flödescytometri efter propidiumjodid märkning för att studera effekterna av fermenterad mjölk ultrafiltrat på HGT-1 cellcykelfördelning (fig. 2C). Obehandlade HGT-1-celler fram ett cellcykelfördelning (Fig. 2Ca) utan subG1 fas, som var oförändrad under tidsförloppet av experimentet (data visas ej). Den procentuella andelen celler i subG1 fasen, indikativ för en apoptotisk process, ökade signifikant med tiden under fermenterad mjölk ultrafiltrat behandling (Fig 2C-B, Cc, Cd.): Vid 24 h (39,24 ± 4,87%), vid 48 h (91,63 ± 0,28 %) och vid 72 h (94,79 ± 0,45%). Vid 48 h och 72 h behandling alla celler var i subG1 cellcykeln fas, vilket indikerar fullständig död HGT-1-celler. Som en kontroll, kamptotecin inducerade liknande apoptotiska kännetecken i HGT-1-celler (Fig. S4).

För att bekräfta apoptosinduktion, phosphatdylserine translokering från den inre till den yttre bipacksedel av plasmamembranet utvärderades genom färgning HGT- 1-celler med en kombination av Annexin V-FITC (aV) och 7-AAD, följt av flödescytometri fluorescensanalys (Fig. 3). Obehandlade celler (0 h) presenteras en hög andel av levande celler (AV ^{- /7AAD -; 92%) och endast 5% av cellerna färgades med Annexin V (fig 3B.). Dessa procentsatser som fastställs i obehandlade celler förändrades inte under tidsförloppet av experimentet (data visas ej). Under behandlingen av HGT-1-celler med ½ späddes fermenterad mjölk ultrafiltrat i DMEMc, procentandelen celler färgades endast av 7-AAD (indikerande nekros) var mycket låg (Fig. 3B). Men de procentsatser av celler färgade med Annexin V ökat markant under en tidsberoende sätt och nådde 80% vid 72 h (Fig. 3B). Därför, HGT-1-celler genomgick apoptos efter behandling med P. freudenreichii
fermenterad mjölk ultrafiltrat, kännetecknad av första AV positiv färgning, vilket indikerar fosfatidylserin exponering, och sedan både AV- och 7-AAD positiv färgning, vilket tyder på en senare förlust av membranintegritet. Som en kontroll, kamptotecin inducerade liknande apoptotiska kännetecken (Fig S5.) Katalog}

som SCFA verka direkt på mitokondrier ades tre viktiga mitokondriella parametrar bestämdes också:. Det inre membranpotential ΔΨm, och generering av ROS, med användning av två fluorescerande prober, DiOC (6) 3 (som är ΔΨm känslig) och DHE (som detekterar O _{2 ^{- nivå), och lokalisering av cytokrom c. Obehandlade celler (0 h) uppvisade en hög fluorescens (hög ΔΨm) och en låg DHE fluorescens (låg produktion av O 2 -) (Fig. 4A, B). Efter behandling med fermenterad mjölk ultrafiltrat, en tidsberoende minskning i införlivandet av DiOC6 (3) som är fluorescerande proben observerades, avslöjar en förlust av ΔΨm och därmed mitokondriemembranet depolarisation (Fig. 4A). Procenthalterna av behandlade HGT-1-celler med minskad innermembranpotential ökade på ett tidsberoende sätt för att nå 96% av cellerna vid 72 timmar. FCCP behandling användes som en positiv kontroll av mitokondriell membrandepolarisering. Denna förlust av ΔΨm bekräftades med den karaktäristiska förlusten i röd fluorescens efter JC-1-färgning (fig. 4B). Beträffande ROS-produktionen i HGT-1-celler, fermenterad mjölk ultrafiltrat behandling inducerad ackumulering av O 2 - avsevärt efter 48 h och 72 h behandling (figur 4C.). Denna ROS ackumulering kan delvis förhindras om cellerna förbehandlats genom ROS renhållare TEMPOL (Fig. S6). Cytokrom c-frisättning från mitokondrier till cytoplasman är en viktig cellulär händelse av apoptotiska programmet. Immunoblotting undersökning av cytoplasman berikade fraktioner med avseende på förekomst av cytokrom c bekräftade en förändring i dess subcellulära lokalisering (Fig. 4D). Cytokrom c detekterades i cytoplasman berikade fraktion från 24 timmarna av behandling, vilket indikerar omlokalisering av detta protein (Fig. 4D). Denna relocalization av cytokrom c i cytoplasman bekräftades genom immunofärgning, visar diffus immunofärgning hela cellen efter behandling, medan avbrutna färgning före behandling (Fig. 4E).}}

P. freudenreichii
fermenterad mjölk aktiverar kaspaser

För att bekräfta de apoptotiska mekanismer inducerade av fermenterad mjölk ultrafiltrat i HGT-1 celler, behandling av kaspaser 3, 8 och 9 analyserades med western blotting och motsvarande enzymatiska aktiviteter övervakning HGT -1-cellextrakt (fig. 5). Den icke-fermenterad mjölk ultrafiltrat inducerade inte kaspasaktivering i HGT-1-celler: endast proforms av kaspas-3 och -9 upptäcktes på western blöt (Fig. 5A) och ingen kaspas-aktivitet mättes (figur 5B).. Den fermenterade mjölk ultrafiltrat supernatanten, liksom den kamptotecin eller blandningen av propionat och acetat i en [2: 1] molförhållande, inducerade klyvningen av pro-kaspas 3 och genereringen av de aktiva formerna av kaspas-3, subenheterna p17 och p12 (fig. 5A). Aktiveringen av kaspas-3, som är en effektor kaspas bekräftade apoptosinduktion. Dessutom fermenterad mjölk ultrafiltrat inducerad klyvning av procaspase-9, vilket leder till de 35 och 37 kDa bearbetade former. Kaspas-8 detekterades inte i kontroll obehandlade HGT-1-celler. Men behandling med propionibacterial supernatanter eller C2 /C3 blandning ledde till en tydlig detektion av kDa proformen 54, följt av klyvning efter 48 h behandling

kvantifiering av kaspas-3, -8 och. - 9 enzymatiska aktiviteter bekräftade kaspasaktivering både propionibacterial metaboliter och kamptotecin. I själva verket var kaspaser-9 och -3 aktiveras vid de tidigaste stadierna av behandlingen, medan kaspas-8 verkade aktiveras senare (Fig. 5B). Kamptotecin och SCFA blandning aktiverat alla tre studerade kaspaser. Dessa data bekräftar aktiveringen av den inre vägen för apoptos genom fermenterad mjölk ultrafiltrat behandling, med en tidig aktivering av kaspas-9 och sedan av kaspas-3 och -8.

P. freudenreichii
fermenterad mjölk ökar kamptotecin cytotoxicitet

Campthotecin är ett cytotoxiskt kinolin alkaloid, som inhiberar DNA-enzymet topoisomeras I (Topo I) och används ofta i den kemoterapeutiska behandlingen av GC. Vi har visat ovan att propionibacterial metaboliter inducera apoptos i HGT-1 celler via mitokondriell dödsvägen. Vi studerade nästa apoptos inducerad av kombinationen av både kamptotecin och fermenterad mjölk ultrafiltratet i HGT-1-celler. Ökade koncentrationer av kamptotecin (0, 0,25, 0,5, 1, 2 | iM) i kombination med ökade koncentrationer av fermenterad mjölk ultrafiltrat (0,, ⅛, ¼) testades på HGT-1 cellviabilitet och båda inducerad förlust av HGT-en viabilitet , på ett dos-beroende sätt (Fig. 6). Dessutom tillsatsen av fermenterad mjölk ultrafiltrat ökade signifikant cytotoxiciteten hos kamptotecin i HGT-1-celler (Fig. 6). Till exempel, 0,25 pM kamptotecin och fermenterad mjölk ultrafiltrat utspätt till ⅛ ledde till en viabilitet förlust av 8,6% och 18,6%, respektive. Kombinationen av dessa två föreningar ledde till en cellviabilitet förlust av 29,8% (fig. 6), vilket tyder på en tillsatt cytotoxicitet effekt när kamptotecin kombinerades med fermenterad mjölk ultrafiltrat i HGT-1-celler. Följaktligen kombinationsindex (Cl), beräknat som tidigare [28], har ett värde av 1, vilket indikerar en additiv effekt av kamptotecin och fermenterade mjölk ultrafiltrat behandlingar.

Diskussion

Ett nytt fermenterad mjölk, innehållande P. freudenreichii
som en enda bakterie, har utvecklats för att ytterligare undersöka den probiotiska potentialen hos denna mejeriberedning av propionibakterier (översikt i [29]). I denna studie rapporterar vi att vattenfasen av detta fermenterad mjölk dödar mänskliga kolon och mag cancerceller via metaboliter, inklusive propionat och acetat, som släpptes av denna bakterie. Detta begrepp är baserad på de observerade cytotoxiska effekterna av P. freudenreichii
fermenterad mjölk supernatanter på odlade HT-29 och HGT-1 cancerceller. Denna effekt erhölls med ultracentrifugerings supernatanter, dvs den fermenterade mjölken vattenfasen, som saknar av kaseiner och av bakterier, som visar att de aktiva föreningarna utsöndras, som tidigare beskrivits för propionibakterier [19]. Av denna anledning är de flesta av experimenten i detta arbete utfördes med fermenterad mjölk ultrafiltrat (fig. 1). Vi visade för första gången att P. freudenreichii
fermenterad mjölk supernatant inducerad apoptos hos HGT-1-celler på ett tids- och dosberoende sätt med utseendet på klassiska morfologiska och biokemiska egenskaper hos apoptos (kondenserad och fragmenterad chromation, DNA laddering och ackumulering av celler i subG1 cellcykeln fas).

Vi tittade sedan om de cellulära mekanismer som är involverade i HGT-1 celldöd vägen liknade den mitokondriella dödsvägen utlöses i Caco-2 och HT-29 human koloncancerceller från P. freudenreichii
DMEMc odlingssupernatanter [19], [20]. Under cellulära och biokemiska händelser som konstaterats hos behandlade HGT-1-celler med fermenterad mjölk ultrafiltrat liknade och ingår, åtminstone, mitokondriell ΔΨm förlust, ROS (O _{2 ^{-) generation, kaspaser bearbetning och aktivering, cytokrom c omlokalisering in i cytoplasman (Fig. 3, 4, 5). Fermenterad mjölk supernatanten inducerad bearbetning och aktivering av kaspas-8, förutom att kaspaser -3 och -9. Dessutom visar figur 4A att kaspas-8 inte detekteras i kontroll obehandlade celler och i celler som behandlats med kamptotecin eller icke-fermenterad mjölk ultrafiltrat, i linje med bristen på dess mRNA (C. Le Jossic-Corcos, Medicinska fakulteten, Brest , Frankrike, personlig kommunikation). Det bör noteras att en uppenbar brist på överensstämmelse mellan enzymatiska resultat, vilket tyder på kaspas-8-aktivitet i kamptotecin-behandlade celler, medan ingen kaspas-8 detekteras i dessa celler genom western blotting. Detta kan förklaras genom avsaknaden av specificitet hos Ac-IETD-AMC-substrat, som kan behandlas av andra enzymer såsom kaspaser -3 och -10 eller granzym B, särskilt om koncentrationen av sådana enzymer är förhöjd [30], [31]. Däremot P. freudenreichii
fermenterad mjölk ultrafiltrat och blandningen av SCFA både orsakade uttryckning och aktivering av kaspas-8. De mekanismer som är involverade här är inte klar; emellertid är kaspas-8 kända för att vara under-uttryckt i vissa cancerceller som ett resultat av DNA-metylering [32], [33]. Dess expression kan återställas på RNA- och proteinnivå genom demetylering medel såsom Decitabin [34] och inhibitorer HDAC [35], vilket resulterar i demetylering av den regulatoriska sekvensen av kaspas-8, en ökning av kaspas-8-promotoraktivitet och i re -expression av kaspas-8 [32]. SCFA, såsom propionat, är HDAC-hämmare, vilket leder till hyperacetylering av histoner [36]. Detta gynnar transkription via en förändring i DNA-konformation [37] och kunde återställa kaspas-8 uttryck. Andra livsmedels födda föreningar redan visat att återställa kaspas-8 uttryck. En injicerbar extrakt av Sperma coicis
(en släkting till majs) extrakt visar antitumöraktivitet ökar uttrycket av kaspas 8 och inducerar apoptos i HepG2-celler [38]. Diallyl disulfid, som finns i vitlök, ökar uttrycket av kaspas-8, Fas och FasL i leukemi K562-celler. En sådan reglering kan således vara involverad i de pro-apoptotiska effekterna av mejeri propionibakterier och av jästa produkter som innehåller dessa. Western blotting framgår restaurerade uttryck och sedan sent aktivering av kaspas-8 i propionibacterial metaboliter-behandlade HGT-1-celler, som kan uppstå till följd av kaspas-8-aktivering av en annan kaspas såsom kaspas-9. I själva verket, utförsel av cytokrom c, en del av den mitokondriella vägen, visade sig aktivera flera kaspaser varav 2, 3, 6, 7, 8 och 10 [39]. Vidare kaspas-9-aktivering visas resultatet i nedströms kaspas-8-aktivering [40]. Följaktligen var kaspas-9 visas In vitro
att aktivera kaspas-3 som i sin tur aktiverar kaspas-6, som ansvarar för kaspas-8-aktivering [41]. Sammantaget bekräftar våra resultat som propionibacterial metaboliter som förekommer i P. freudenreichii
fermenterad mjölk inducera flera sub-cellulära mekanismer som gynnar apoptos. En sådan reaktivering av kaspas-8 uttryck kan leda till en större apoptotiska gensvar i HGT-1-celler som behandlats med döda domän receptorer agonister (t.ex. Trail eller FAS).}}

Så vitt vi vet är detta den första arbete rapporterar specifik induktion av magcancer cell apoptos genom en fermenterad mejeriprodukt. Fermenterade mjölk, inklusive yoghurt, föreslogs att vara användbara vid förebyggande av koloncancer. Epidemiologiska uppgifter om de skyddande effekterna av mjölk och mjölkprodukter på tjocktarmscancer hastighet gav motstridiga resultat [42]. Mjölk och totala mjölkprodukter konsumtion är associerad med en minskning av kolorektal cancerrisken. Men detta är inte sant för alla typer av mejeriprodukter och effekterna varierar kraftigt. Fermenterade mejeriprodukter kan utgöra effektiva leveransfordon att rikta skydds molekyler eller mikroorganismer till specifika platser såsom matsmältnings epitel [43]. Bovint laktoferrin, en beståndsdel i mjölk, inducerar apoptos hos kolon [44] och gastriska [45] cancerceller. Utvalda stammar av mikroorganismer som finns i fermenterade mjölk kan också motverka kolon cancer. Följaktligen yoghurt och mjölksyrabakterier uppvisade anti-canceregenskaper i djurmodeller av kolon cancer [46]. Men fokuserade lite arbete på jästa mejeriprodukter och magcancer. Vårt arbete visar att P. freudenreichii
skulle kunna spela en roll i detta sammanhang, eftersom det skulle ge både levande propionibakterier och pro-apoptotiska metaboliter magslemhinnan. I detta sammanhang bör det noteras att P. freudenreichii
följer att mag epitelceller och slem [47], [48]. Det visade sig också inhibera vidhäftning av det orsakande medlet av magcancer Helicobacter pylori
att mag epitelceller, samt H. pylori
inducerade skador [49]. Dessa egenskaper tyder på en roll P. freudenreichii
fermenterad mjölk i profylax av magcancer.

Slutligen potentialized vår fermenterad mjölk pro-apoptotiska verkan av läkemedlet kamptotecin på gastric cancerceller. Följaktligen levande kulturer av probiotiska lactobaciller tidigare visat sig sensibilisera LS513 kolorektal cancerceller till 5-fluorouracyl [50]. Men i detta fall är de probiotika enbart hade ingen proapoptotisk effekt. I detta arbete, låga doser av läkemedlet kamptotecin används i magcancer kemoterapi var ineffektiva i att döda gastric cancerceller. Emellertid i närvaro av låga doser av P. freudenreichii
fermenterad mjölk, de dödade samma celler effektivt (Fig. 6). Propionibacterial metaboliter inducerar den inneboende apoptos vägen genom att verka direkt på mitokondrier, medan kamptotecin verkar på DNA-nivå. Detta överensstämmer med deras samlade potential i apoptosinduktion när dessa pro-apoptotiska inducerare kombineras. Dessutom innehåller den fermenterade mjölken SFCAs, kallad HDAC-inhibitorer som kan modulera apoptos och cellcykeln i gastric cancerceller [13], [51], liksom uttrycket av cellcykeln relaterade och apoptotiska proteiner i andra cancerceller [52], [53]. Probiotika redan använts i kliniska studier för att minska biverkningarna av cancerkemoterapi [54]. P. freudenreichii
kan enligt våra resultat, användas i sådana kliniska studier. Dess synergistisk effekt kan hjälpa till att sänka läkemedelsdosen och förbättra komforten för patienterna.

Sammanfattningsvis en ny mjölk, exklusivt fermenteras av P. freudenreichii
, apoptos i HGT-1 humana gastriska cancerceller. Dessutom förstärks denna fermenterad mjölk kamptotecin cytotoxicitet aktivitet, läkemedel som används vid magsäckscancer kemoterapi. En sådan ny probiotisk fermenterad mjölk kan vara av intresse som en funktionell mat för att förhindra magcancer och /eller att potentialize terapeutiska behandlingar.

Material och metoder

Kemikalier

Kamptotecin, etoposid , TEMPOL, acetat och propionat natriumsalter, och kaspas substrat Ac-DEVD-AMC (N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-metylkumarin), Ac-IETD-AMC (N-acetyl-Ile -Glu-Thr-Asp-7-amido-4-metylkumarin) och Ac-LEHD-AFC (N-acetyl-Leu-Glu-His-Asp-7-amido-4-trifluormetylkumarin) köptes från Sigma-Aldrich (Saint -Quentin Fallavier, Frankrike). Kamptotecin löstes i DMSO. Den slutliga koncentrationen av DMSO inte överskred 0,01%, en koncentration som inte inducerade någon toxicitet. RNAse A, PI (propidiumjodid), Hoechst H33342, MitoTracker® Red CMXRos, TO-PRO-3, JC-1, 3,3'-dihexyloxacarbocyanine jodid (DiOC6 (3)) och dihydroethidium (DHE) erhölls från Invitrogen ( Cergy-Pontoise, Frankrike). Annexin V-FITC (AV) kit och 7-aminoactinomycin-D (7-AAD) lösning tillhandahölls av BD Biosciences (Pont-de-Claix, Frankrike).

• PLOS ONE: E-cadherin destabilisering konton för sjukdomsalstrande missensmutationer i ärftlig Diffus Gastric Cancer
• PLOS ONE: Identifiering av serum MicroRNAs som ny icke-invasiva Biomarkers för tidig upptäckt av ventrikelcancer