PLoS ONE: Молоко сбраживается Propionibacterium freudenreichii вызывает апоптоз HGT-1 рака желудка человека Cells

Абстрактный

Фон

Рак желудка является одним из наиболее распространенных видов рака в мире. "Экономически развитые страны" стиль жизни, включая диету, представляет собой фактор риска в пользу этого рака. Диета модуляции может понизить пищеварительный заболеваемость раком. Среди перспективных компонентов пищи, молочных пропионибактерии было показано, чтобы вызвать апоптоз раковых клеток толстой кишки человека, с помощью выпуска с короткой цепью жирных кислот ацетат и пропионат.

Методология /Основные выводы
<р> кисломолочный , исключительно ферментируется P. freudenreichii
, недавно был разработан. В этой работе проапоптотического потенциал этого нового кисломолочного продукта была продемонстрирована на HGT-1 Клетки рака желудка человека. Кисломолочный надосадочную индуцированное типичные признаки апоптоза, включая конденсацию хроматина, формирование апоптотических телец, ДНК Лэддеринг, клеточного цикла и появление популяции subG1, экспозиция фосфатидилсерина на плазматической мембраны наружного листка, реактивным накоплением видов кислорода, митохондриального трансмембранного потенциального нарушения, каспазы активация и цитохром с высвобождением. Примечательно, что это новый кисломолочный молоко, содержащее P. freudenreichii
усиливает цитотоксичность камптотецина, препарат, который используется в химиотерапии рака желудка.

Выводы /Значение
<р> Такие новые пробиотических кисломолочных продуктов, таким образом, может быть полезным как часть профилактической диеты, предназначенная для предотвратить рак желудка и /или в качестве добавки к пище потенцировать рака терапевтическое лечение
<р> Цитирование:. Кузен FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Коркоса L, Ян G (2012) Молоко сбраживается Propionibacterium freudenreichii
индуцирует Апоптоз HGT-1 клеток человека рака желудка. PLoS ONE 7 (3): e31892. DOI: 10.1371 /journal.pone.0031892
<р> Редактор: Abbes Belkhiri, Университет Вандербильта медицинский центр, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 15 ноября 2011 года; Принято: 19 января 2012 года; Опубликовано: 19 марта, 2012
<р> Copyright: © 2012 Кузен и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа финансировался Conseil Régional Бретонской через DEVELOPPEMENT вызов CBB для проектов и Национальным центром Межпрофессиональным де l'Economie молочница (CNIEL) через Научным комитетом по Syndifrais вызова для проектов. Исследования в группе IRSET была поддержана грантами Ligue Nationale Contre ле Рак (Лазурного Armor, Иль и Вилен, Морбиан, Вандее и Sarthe), комитеты INSERM, Университет Ренне 1 и область Bretagne. ФЕОР получила грант от CNIEL (докторская стипендия). SJL была поддержана Ассоциацией пур ля Recherche сюр-ле-Рак (докторская стипендий). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение

Диета модулирует риск развития рака желудка
<р> Рак является главной причиной смертности в экономически развитых странах в результате рака ассоциированного образа жизни, включая курение, отсутствие физической активности, и "европеизированной" диета [ ,,,0],1]. Действительно, роль диеты в развитии рака активно поддерживается эпидемиологических исследований, в частности, в отношении раковых заболеваний желудочно-кишечного тракта. Рак желудка (GC) представляет собой третий тип смертельных раковых заболеваний для мужчин в мире. В 2008 году 640.600 случаи GC были оценены, в результате чего 464.400 человек во всем мире [1]. Это заболевание особенно часто встречается в Восточной Азии, а также в Центральной и Восточной Европе. Наиболее важные этиологические факторы, участвующие в желудочном канцерогенезе являются диета и хеликобактерной
инфекции. Существенные доказательства, в основном из исследований случай-контроль, предполагает, что риск заражения GC увеличивается на высокий уровень потребления соленых, маринованных или копченых продуктов традиционно, а также сушеной рыбы и мяса. Напротив, волокна, свежие овощи и фрукты, возможно, из-за их содержание витамина С, были найдены быть обратно связаны с риском GC [2], [3]. Влияние компонентов природной /пищевых на канцерогенез желудка, таким образом, были исследованы в течение последних нескольких десятилетий [4] - [6]. Среди них, пробиотиков и их способность ингибировать развитие рака привлекло научный интерес [7], [8]. Пробиотик, как правило, определяется как "живого микроорганизма, который при введении в достаточном количестве, предоставляющем пользу для здоровья хозяину" [9]. В то время как некоторые микроорганизмы, такие как H. пилори
может способствовать GC, другие могут иметь положительный эффект, предотвращая пищеварительные рака. В частности, выбранные штаммы пробиотических бактерий могут ограничить развитие рака на животных моделях канцерогенеза [10]. Об этом особенно свидетельствует для рака толстой кишки, тогда как меньше известно о возможном влиянии пробиотиков на GC. Возможное механистического объяснения такого защитного эффекта является <ЕМ> На месте
высвобождения антиканцерогенных метаболитов, таких как короткие цепи жирных кислот (КЦЖК).

короткоцепочечных жирных кислот индуцируют апоптоз раковых клеток
<р> SCFA, включая ацетат, пропионат и бутират, являются важными анионы кишечного содержимого и их концентрация может быть модулирована с помощью диеты. Они были показаны, чтобы играть ключевую роль в важных физиологических функций, в том числе модуляции пищеварительном эпителиальных клеток пролиферации /апоптоза баланса. Это включает в себя SCFA-опосредованного остановку клеточного цикла, гистонов ингибирование дезацетилазы и апоптозом стимуляцию в трансформированных клетках, но и стимуляции дифференцировки у здоровых клеток [11], [12]. Кроме того, было сообщено, что бутирата SCFAs и пропионат и индуцирует апоптоз в карциномы желудка клеточных линий человека [13] - [15]. Апоптоз является естественным физиологическим процессом позволяет регулирование количества клеток и представляет собой мишень для химиотерапии противоракового [16]. Апоптоз позволяет истощение раковых клеток в "чистой" манере. Раковые клетки фрагмент скоординированным цепной реакции и остатки поглощаются окружающими тканями и иммунной системы [17], [18]. Два основных пути апоптоза, были описаны: внешний путь, который опосредованного активацией рецепторов смерти и каспазы 8, и внутренний путь, в котором митохондрии и каспазы 9 вовлечены [16]. Как правило, в раковых клетках, апоптическая функция отсутствует, что может объяснить их устойчивого распространения и, следовательно, образование опухолей. Способность индуцировать апоптоз раковых клеток, таким образом, признается его терапевтический потенциал [16]. Поскольку молочные пропионибактерии способны производить полезные проапоптотического SCFAs, они могут оказаться полезными в профилактике или лечении рака.

Propionibacterium freudenreichii
может способствовать апоптический истощение пищеварительных раковых клеток
<р> Этот пробиотический молочный Propionibacterium было показано, чтобы вызвать гибель клеток различных клеточных линий рака толстой кишки человека путем индукции апоптоза, в совместных культурах [19]. Активные соединения, секретируется в среду, вызывают внутреннюю митохондриальную путь апоптоза в культуре человеческих клеток колоректального рака. В частности, КЦЖК ацетат и пропионат выпущен P. freudenreichii
индуцировать апоптоз путем воздействия на митохондриальный аденин нуклеотидов транслокатору, вызывая митохондрии деполяризации и permeabilisation, утечку цитохрома С и активации каспазы [19], [20]. Тем не менее, пропионово-кислых супернатанты еще более проапоптотического, чем ацетат и пропионат SCFAs, используемой при замере концентраций в супернатантах, предполагая, что другие соединения могут быть вовлечены в этот эффект. Отобранные штаммы P. freudenreichii
остаются жить и метаболически активными в кишечнике человека и микробиоты ассоциированных крыс человека, где они производят SCFAs [21], [22]. Соответственно, они были показаны для увеличения апоптоза в трансформированных толстой кишки эпителиальных клетках таких крыс, получавших канцероген 1,2-диметилгидразина (ДМГ), но не в состоянии контролировать здоровые [23]. Пропионибактериями могут представлять собой пробиотики, благоприятствующих профилактика рака толстой кишки, при условии, что они достигают цели живыми и метаболически активными. В этом контексте, вектор, или пробиотика доставки транспортного средства, было показано, чтобы определить пропионибактериями выживание и активность [21], [24], [25]. Сложные молочные продукты, такие как йогурт и сыр, в частности, защитить пропионибактериями от стресса, но содержат сложную смесь бактерий. Таким образом, не представляется возможным приписать благотворное влияние на конкретного штамма.

кисломолочный оценивали как доставка пропионибактерии автомобиля в этом контексте

В этом исследовании мы использовали новую пищевую кисломолочный, содержащий только P. freudenreichii
в качестве единственного микрофлоры. Поскольку этот продукт содержит как живые пропионибактериями и их активные метаболиты, он должен привести их в контакт со слизистой оболочкой желудка при заглатывании. Этот кисломолочный продукт был исследован в отношении Тушка-1 Клетки рака желудка человека индукции апоптоза. В самом деле, пропионибактерии, как известно, убивают раковые клетки толстой кишки человека, но их действие на желудочную раковых клеток неизвестна. Кисломолочный убит HGT-1 клеток в времени и зависимым от дозы образом. наблюдались типичные признаки процесса апоптоза, в том числе капли жизнеспособности, конденсацию хроматина, образование апоптотических тел, Лэддеринг ДНК, образование активных форм кислорода, митохондриального мембранного потенциала возмущения, активации каспазы, клеточного цикла и появление популяции subG1.

Результаты

P. freudenreichii
кисломолочный убивает желудка человека и раковые клетки толстой кишки

P. freudenreichii
ITG Р9 вырос в 72 ч при 30 ° С в дополненной молоке и дополненной молока ультрафильтрата для достижения конечной популяции из 9,43 журнала <суб> 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) /мл и 9.35 журнал <суб> 10 КОЕ /мл, соответственно. Концентрации SCFA были 26,21 мМ ацетат и 54,47 мМ пропионата (/ацетат соотношение 2,08 пропионат) в молоке ферментированного супернатанта, тогда как они были 24,00 мм и 53,32 мм (2,22 отношение) в кисломолочных ультрафильтрата супернатанта. Эти показатели, как ожидается, для пропионибактериями, которые обычно производят в два раза больше пропионата в виде ацетата [26]. Двенадцать других пищевые штаммы молочных пропионибактериями были также испытаны (смотри таблицу S1 и рисунок S1). Используя эти штаммы были получены двенадцать кисломолочных продуктов. Концентрации пропионата в диапазоне от 36 до 67 мм и пропионибактериями населения от 9,0 до 9,7 журнала <суб> 10 КОЕ /мл, для менее и для наиболее эффективного штамма соответственно.
<р> цитотоксический потенциал супернатантов получают из молока или молоко ультрафильтрата, как ферментированного P. freudenreichii
ITG Р9, был исследован. НТ-29 клеток рака толстой кишки человека и Тушка-1 рака желудка человека клетки обрабатывали этими супернатантов. испытывались различные разведения в пределах от ½ до. Кроме того, цитотоксичность смеси 15 мМ ацетата и 30 мМ пропионата тестировали при концентрациях, близких к ним ½ разведенных супернатантов. В качестве положительного контроля индукции апоптоза, препараты химиотерапии камптотецин (4 мкМ) и этопозид (100 мкМ) использовали для Тушка-1 и НТ-29 клеток, соответственно. Сравнивались три различных методов мониторинга гибели клеток. Как показано на рисунке S2, метиленовый синий, МТТ и трипанового синего анализы дали сходные кинетику смерти. Следовательно, метиленовый синий анализ использовали в этом исследовании для дальнейшей оценки жизнеспособности клеток. В неферментированного молочные продукты (молоко или молоко ультрафильтрата) не имели никакого эффекта, ни на HT-29, ни на жизнеспособность HGT-1 клеток (рис. 1 А, В). Надосадочную молока или молока ультрафильтрата ферментируется P. freudenreichii
индуцированное аналогичную цитотоксичность в зависимости от времени в НТ-29 и клетках HGT-1, и близко к цитотоксичности, индуцированной лекарственными средствами или с помощью ацетата /пропионата смеси. Полумаксимальной убийство клеток Тушка-1 произошла через 24 ч и 26 ч после обработки ферментированного молока и кисломолочные ультрафильтрата супернатантов соответственно, после 17 ч обработки камптотецина и через 24 ч лечения с SCFA смеси (рис. S3) , Кроме того, цитотоксичность ферментированных молочных продуктов супернатанты в клетках Тушка-1 в зависимости от дозы (фиг. 1С). Для каждого разведения тестируемого, снижение жизнеспособности Тушка-1 клеток, вызываемую Кисломолочный или кисломолочного ультрафильтрата была очень похожа (рис 1C &Amp;.. Рис S3). Вот почему следующие шаги исследования мы проводили только с Кисломолочный ультрафильтрата супернатанта. Взятые вместе, эти данные указывают на то, что пропионибактерии эффективно убить толстой кишки человека и клеток рака желудка, по крайней мере, частично, путем производства пропионат и ацетат (рис. 1). Некоторые другие ферментированные молочка, ферментированные различными штаммами молочных пропионибактериями, показали сходные цитотоксические эффекты на раковые клетки (Таблица S2). P. freudenreichii
ITG Р9 будучи известен своей метаболической активности В естественных условиях
[22], соответствующий кисломолочный дополнительно изучен.

P. freudenreichii
кисломолочный вызывает типичные следы апоптоза в клетках рака желудка человека
<р> Ядра морфология клеток Тушка-1, инкубированных в присутствии P. freudenreichii
кисломолочный ультрафильтрата анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии после того, как Hoechst 33342 окрашивание (фиг. 2А). Ядерная флуоресценция необработанных клеток (контрольных) оставались неизменными в течение времени ходе эксперимента с синим нормальным ядрами (время 0 ч, рис. 2А як). Во время лечения, клетки HGT-1 отображается на конденсированного хроматина и фрагментированные ядер характеристики апоптотических ядер (рис. 2ab, с), с последующим появлением апоптотических тел в 72 ч (рис. 2AD). Inter-нуклеосомная фрагментации ДНК в результате Лэддеринг ДНК, типичный знак апоптоза [27], также контролируется во время лечения ферментированного молока ультрафильтрата. фрагментация ДНК наблюдалась с 24 ч лечения с кисломолочного ультрафильтрата (фиг. 2В), и в меньшей степени с камптотецин (рис. S3). Содержание ДНК также количественно с помощью проточной цитометрии после мечения пропидийиодидом для изучения влияния кисломолочного ультрафильтрата на HGT-1 распределения клеточного цикла (рис. 2в). Необработанные клетки Тушка-1 представлено распределение клеточного цикла (рис. 2CA) без фазы subG1, которая остается неизменной в течение временного хода эксперимента (данные не показаны). Процент клеток в фазе subG1, свидетельствует об апоптозе процесса, значительно возрастает со временем, в течение ферментированной обработки молока ультрафильтрата (рис 2cb, Сс, Cd.): Через 24 ч (39,24 ± 4,87%), через 48 ч (91,63 ± 0,28 %), и через 72 ч (94,79 ± 0,45%). Через 48 ч и 72 ч обработки, все клетки находились в фазе subG1 клеточного цикла, что указывает на полную гибель клеток Тушка-1. В качестве контроля, камптотецин индуцированный подобные апоптотических клейма в Тушка-1 клеток (рис. S4).
<Р> Для подтверждения индукции апоптоза, phosphatdylserine транслокацию от внутренней к внешней листка плазматической мембраны оценивали путем окрашивания HGT- 1 клеток с комбинацией аннексина V-FITC (AV) и 7-AAD, с последующим анализом методом проточной цитометрии флуоресценции (рис. 3). Необработанные клетки (0 ч) представили высокую долю живых клеток (AV ^{- /7AAD -; 92%) и только 5% клеток окрашивались аннексина V (рис 3B.). Эти проценты, определенные в необработанных клетках не изменялась в течение временного хода эксперимента (данные не показаны). Во время обработки клеток Тушка-1 с половиной разбавленного кисломолочного ультрафильтрата в DMEMc, процент клеток, окрашенных только на 7-AAD (что указывает на некроз) была очень низкой (рис. 3В). Тем не менее, процентное содержание клеток, окрашенных с аннексина V значительно увеличена в зависимости от времени и достигает 80% при 72 ч (рис. 3, б). Следовательно, клетки HGT-1 подвергаются апоптозу после обработки P. freudenreichii
кисломолочный ультрафильтрата, характеризуется первым AV положительное окрашивание, указывающее воздействие фосфатидилсерина, а затем и А. В. и 7-ААР положительное окрашивание, что указывает на более поздней потере целостности мембраны. В качестве контроля, камптотецин индуцированный подобные апоптотических клейма (рис S5.)
<Р> Как SCFA действуют непосредственно на митохондрии, три важных митохондриальных параметры были также определены:. Внутренний мембранный потенциал ΔΨm, и генерация ROS, с использованием двух флуоресцентные зонды, DiOC (6) 3 (который ΔΨm чувствителен к регистру) и DHE (который обнаруживает O <суб> 2 - уровень), а также локализацию цитохрома с. Необработанные клетки (0 ч) проявляли высокую флуоресценцию (высокая ΔΨm) и низкую ДНЕ флуоресценции (низкое производство O <суб> 2 -) (. Фиг.4А, В). После обработки кисломолочного ультрафильтрата, зависящее от времени уменьшение включения DiOC6 (3) флуоресцентного зонда наблюдалось, обнажив потерю ΔΨm и, следовательно, митохондриальную деполяризацию мембраны (рис. 4, а). Процент клеток, обработанных Тушка-1 с пониженной внутренний потенциал мембраны увеличивался в зависимости от времени, чтобы достигнуть 96% от клеток через 72 часа. Лечение FCCP использовался в качестве положительного контроля митохондриальной деполяризации мембраны. Эта потеря ΔΨm была подтверждена характеристиками потерь в красной флуоресценции следующим JC-1 окрашивания (рис. 4, б). Что касается производства ROS в клетках HGT-1, кисломолочный лечение ультрафильтрата индуцированное накопление O <югу> 2 -, значительно через 48 ч и 72 ч лечения (рис. 4С). Это накопление РОС может быть частично предотвращено, если клетки предварительно обрабатывают с помощью поглотительного TEMPOL ROS (рис. S6). Цитохром с высвобождением из митохондрий в цитоплазму является ключевым событием клеточного апоптоза программы. Иммуноблоттинг экспертиза цитоплазмы обогащенного фракций на наличие цитохрома с подтвердили изменение его внутриклеточной локализации (рис. 4). Цитохром с был обнаружен в цитоплазме, обогащенной фракции от 24 часов лечения, что указывает на перемещение этого белка (фиг. 4D). Это релокализация цитохрома с в цитоплазму была подтверждена иммунным окрашиванием, показывая диффузное иммунное окрашивание по всей клетке после лечения, в то время как прерывистого окрашивания до начала лечения (рис. 4E).}

P. freudenreichii
кисломолочный активирует каспазы
<р> Чтобы подтвердить механизмы апоптоза, вызываемых кисломолочного ультрафильтрата в HGT-1 клеток, обработка каспаз 3, 8 и 9 анализировали с помощью Вестерн-блоттинга и соответствующего мониторинга ферментативных активностей в ХГТ -1 клеточные экстракты (рис. 5). Без кисломолочный ультрафильтрата не вызывает активацию каспазы в HGT-1 клеток: только proforms каспазы-3 и -9 были обнаружены на вестерн-блоттинга (. Фиг.5А) и никакой активности каспазы измеряли (рис 5B.). Кисломолочный ультрафильтрата супернатант, а также камптотецин или смесь пропионата и ацетата в мольном соотношении [2: 1], индуцированное расщепление про-каспазы 3 и генерацию активных форм каспазы-3, субъединицы P17 и P12 (рис. 5А). Активация каспазы-3, которая является эффекторные каспазы, подтвердили индукцию апоптоза. Кроме того, кисломолочный ультрафильтрата индуцированное расщепление прокаспазы-9, что приводит к 35 и 37 кДа, обработанных форм. Каспазы-8 не был обнаружен в контрольных необработанных клетках Тушка-1. Тем не менее, лечение с помощью пропионово-кислых супернатантах или C2 /C3 смеси привела к явному обнаружения 54 кДа проформы, с последующим его расщеплением через 48 ч после обработки
<р> Количественное каспазы-3, -8 и. - 9 ферментативные активности подтвердили активацию каспазы обоими пропионово-кислых метаболитов и камптотецина. Действительно, каспазы-9 и -3 были активированы на самых ранних стадиях лечения, в то время как каспазы-8, казалось, будут активированы позже (рис. 5В). Камптотецин и смесь SCFA активируются все три изученные каспазы. Эти данные подтвердили активацию внутреннего пути апоптоза ферментированной обработки молока ультрафильтрата, с ранней активации каспазы-9, а затем каспазы-3 и -8.

P. freudenreichii
кисломолочный увеличивает камптотецина цитотоксичность
<р> Campthotecin является цитотоксическим хинолина алкалоид, который ингибирует фермент ДНК-топоизомеразы I (Topo I) и широко используется в химиотерапевтического лечения GC. Выше мы показали, что метаболиты пропионово-кислых индуцирует апоптоз в HGT-1 клетки через митохондриальный путь смерти. Далее мы изучали апоптоз, индуцированный комбинацией обоих камптотецин и кисломолочного ультрафильтрата в клетках Тушка-1. Увеличение концентрации камптотецина (0, 0,25, 0,5, 1, 2 мкМ) в сочетании с повышенными концентрациями кисломолочного ультрафильтрата (0,, ⅛, ¼) тестировали на жизнеспособность Тушка-1 клеток и индуцированных, так потерей Тушка-1 жизнеспособности , в зависимости от дозы (фиг. 6). Кроме того, добавление кисломолочного ультрафильтрата значительно усиливается цитотоксичность камптотецина в клетках Тушка-1 (рис. 6). Например, 0,25 мкМ камптотецина и кисломолочный ультрафильтрата, разбавленный до ⅛ привело к потере жизнеспособности 8,6% и 18,6%, соответственно. Сочетание этих двух соединений привело к потере жизнеспособности клеток на 29,8% (рис. 6), что предполагает дополнительный цитотоксический эффект, когда камптотецин сочеталась с кисломолочного ультрафильтрата в клетках Тушка-1. Соответственно, индекс комбинации (CI), вычисленный как и ранее [28], имеет значение, равное 1, указывает на аддитивное действие камптотецина и кисломолочных продуктов, лечения ультрафильтрата.

Обсуждение
<р> Новый ферментированный молоко, содержащий P. freudenreichii
в качестве единственного бактерии, был разработан с целью дальнейшего изучения пробиотический потенциал этого молочного подготовки пропионибактериями (обзор в [29]). В данном исследовании мы сообщаем, что водная фаза этого кисломолочного продукта убивает человека толстой кишки и желудка раковые клетки с помощью метаболитов, включая пропионат и ацетат, выпущенным этой бактерии. Это понятие основано на наблюдаемых цитотоксических эффектов P. freudenreichii
супернатантов ферментированного молока на культивируемых НТ-29 и раковых клеток HGT-1. Этот эффект был получен с ультрацентрифугирования супернатантов, т.е. кисломолочного водной фазы, лишенного казеина и бактерий, показывая, что активные соединения секретируются, как описано ранее для пропионибактериями [19]. По этой причине большинство экспериментов в данной работе были выполнены с кисломолочного ультрафильтрата (рис. 1). Мы показали в первый раз, что P. freudenreichii
кисломолочный надосадочную индуцированный апоптоз HGT-1 клеток в времени и зависимым от дозы образом с появлением классических морфологических и биохимических признаков апоптоза (конденсируется и фрагментированной chromation, Лэддеринг ДНК и накопление клеток в цикле subG1 клеток фаза).
<р> Мы рассмотрели то, если клеточные механизмы, участвующие в HGT-1 гибели клеток пути были подобны митохондриальной смерти пути обусловленное в Сасо-2 и НТ-29 рака толстой кишки человека клетки от P. freudenreichii
DMEMc супернатанты культуры [19], [20]. Субклеточном и биохимические события, наблюдаемые в обработанных клетках HGT-1 с кисломолочного ультрафильтрата были сходными и включали, по крайней мере, митохондриальная потери ΔΨm, ROS (O <суб> 2 -) генерации, обработки каспазы и активации, цитохром C перемещение в цитоплазму (рис. 3, 4, 5). Кисломолочный надосадочную индуцированный обработку и активацию каспазы-8, в дополнение к каспаз -3 и -9. Кроме того, на рисунке 4A указывает на то, что каспазы-8 не обнаружен в контрольных необработанных клетках и в клетках, обработанных камптотецина или неиспользования кисломолочного ультрафильтрата, в соответствии с отсутствием его мРНК (C. Le Jossic-Коркоса, медицинский факультет, г. Брест , Франция, личное сообщение). Следует заметить, что очевидное расхождение существует между результатами ферментативных, предполагая, активность каспазы-8 в камптотецина обработанных клетках, в то время как не каспазы-8 не обнаружено в этих клетках с помощью вестерн-блоттинга. Это можно объяснить отсутствием специфичности субстрата Ас-IETD-AMC, который может быть обработан другими ферментами, такими как каспазы-3 и -10 или гранзимом, особенно если концентрация таких ферментов повышается [30], [31]. В отличие от этого, P. freudenreichii
ферментированного молока ультрафильтрата и смесь SCFA как вызванную экспрессию и активацию каспазы-8. Механизмы, участвующие здесь не выяснены; Тем не менее, активность каспазы-8, как известно, под экспрессируется в некоторых раковых клетках в результате метилирование ДНК [32], [33]. Его выражение может быть восстановлен на РНК и белка уровне с помощью деметилирующий агентами, такими как децитабина [34] и ингибиторы HDAC [35], в результате деметилирования регуляторной последовательности каспазы-8, увеличение каспазы-8 активности промотора и в ре -expression каспазы-8 [32]. SCFA, такие как пропионат, являются ингибиторами HDAC, что приводит к гиперацетилирования гистонов [36]. Это способствует транскрипцию за счет изменения ДНК конформации [37] и может восстанавливать экспрессию каспазы-8. Другие продукты питания новорожденных соединения уже показали восстановление экспрессии каспазы-8. Инъекционный экстракт Семён coicis
(родственник кукурузы) экстракта отображения противоопухолевую активность усиливает экспрессию каспазы 8 и индуцирует апоптоз в клетках HepG2 [38]. Diallyl дисульфид, найденный в чесноке, усиливает экспрессию каспазы-8, Fas и FasL в К562 лейкемии. Такое регулирование может быть, таким образом участвует в про-апоптотических эффектов молочных пропионибактериями и ферментированных продуктов, содержащих их. Вестерн-блоттинга свидетельствует восстановление экспрессии и затем поздней активации каспазы-8 в клетках пропионово-кислых метаболитов обработанных Тушка-1, которые могут возникнуть в результате активации каспазы-8 с помощью другого каспазы, такие как каспазы-9. Действительно, выход цитохрома с, часть митохондриального пути, было показано, чтобы активировать несколько каспазы в том числе 2, 3, 6, 7, 8 и 10 [39]. Кроме того, активация каспазы-9 был показан результат в нижнем течении каспазы-8 активации [40]. Соответственно, было показано каспазы-9 в пробирке
для активации каспазы-3, который в свою очередь активирует каспазы-6, ответственный за активацию каспазы-8 [41]. В целом, наши результаты подтверждают, что пропионово-кислых метаболитов, присутствующих в P. freudenreichii
кисломолочный вызывают несколько суб-клеточных механизмов, благоприятствующих апоптозу. Такая реактивация каспазы-8 экспрессии может привести к серьезному апоптотической реакции в HGT-1 клеток, обработанных мертвых рецепторов домена агонистов (например Trail или FAS).
<Р> Насколько нам известно, это первая работа, отчетность конкретных индукция клеток желудка апоптоза ферментированного молочного продукта. Кисломолочных продуктов, в том числе йогурт, было предложено, чтобы быть полезным в профилактике рака толстой кишки. Эпидемиологические данные о защитном действии молока и молочных продуктов на заболеваемость раком толстой кишки дали противоречивые результаты [42]. Молоко и молочные продукты всего потребления связано со снижением риска развития рака ободочной и прямой. Но это не верно для всех видов молочных продуктов и эффекты сильно различаются. Кисломолочные продукты могут представлять собой эффективные средства доставки для целевых защитных молекул или микроорганизмов для конкретных участков, таких как желудочно-кишечного эпителия [43]. Бычий лактоферрин, в состав молока, вызывает апоптоз толстой кишки [44] и желудка [45] раковых клеток. Отобранные штаммы микроорганизмов, присутствующих в кисломолочных продуктов, может также противодействовать канцерогенеза толстого кишечника. Соответственно, йогурт и молочнокислые бактерии выставлены противораковыми свойствами в животных моделях канцерогенеза толстого кишечника [46]. Тем не менее, мало работа была сосредоточена на ферментированных молочных продуктов и рака желудка. Наша работа предполагает, что P. freudenreichii
может играть определенную роль в этом контексте, как было бы обеспечить как живые пропионибактериями и проапоптотического метаболитов на слизистую оболочку желудка. В этом контексте следует отметить, что P. freudenreichii
прилипает к пищеварительным эпителиальных клеток и слизи [47], [48]. Было также показано, ингибирует адгезию возбудителя рака желудка Helicobacter Pylori
к пищеварительным эпителиальные клетки, а также H. Pylori
индуцированный повреждения [49]. Эти свойства указывают на роль P. freudenreichii
кисломолочных продуктов, в профилактике рака желудка.
<р> Наконец, наш кисломолочный potentialized на проапоптотического действие камптотецина наркотиков на клеток рака желудка. Соответственно, живые культуры пробиотических лактобацилл были ранее показали сенсибилизировать раковые клетки LS513 колоректальных до 5-фторурацила [50]. Тем не менее, в этом случае, пробиотики в одиночку не имели проапоптотический эффекта. В этой работе, низкие дозы камптотецина наркотиков, используемых в химиотерапии рака желудка были неэффективны в убийстве клеток рака желудка. Тем не менее, в присутствии низких доз P. freudenreichii
ферментированного молока, они эффективно уничтожает те же клетки (рис. 6). Пропионово-кислых метаболитов вызывает внутреннюю пути апоптоза, действуя непосредственно на митохондрии, в то время как камптотецин действует на уровне ДНК. Это согласуется с их кумулятивным потенциалом в индукции апоптоза, когда эти проапоптотического индукторы объединены. Кроме того, кисломолочный содержит SFCAs, известный как ингибиторы HDAC, способны модулировать апоптоз и клеточный цикл в клеток рака желудка [13], [51], а также экспрессию клеточного цикла, связанного и апоптотических белков в других клетках рака [52], [53]. Пробиотики уже использовались в клинических исследованиях, чтобы уменьшить побочные эффекты химиотерапии рака [54]. P. freudenreichii
может, по нашим результатам, можно использовать в таких клинических исследованиях. Его синергический эффект может помочь снизить дозу препарата и улучшить комфорт пациентов.
<Р> В заключение, новое молоко, исключительно ферментируется P. freudenreichii
, индуцированный апоптоз в Тушка-1 Клетки рака желудка человека. Кроме того, этот кисломолочный усиливает цитотоксичность активность камптотецина, наркотиков используется в химиотерапии рака желудка. Такой новый пробиотический кисломолочный может представлять интерес в качестве функционального питания, чтобы предотвратить рак желудка и /или суперпластификатора терапевтического лечения.

Материалы и методы

Химические вещества
<р> камптотецин, этопозид , TEMPOL, ацетат и пропионат соли натрия, и каспазы подложках Ac-DEVD-AMC (N-ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-7-амидо-4-метилкумарин), Ас-IETD-AMC (N-ацетил-Ile -Glu-Тре-Асп-7-амидо-4-метилкумарин) и Ас-LEHD-АФК (N-ацетил-Лей-Глу-His-Asp-7-амидо-4-trifluoromethylcoumarin) были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Saint -Quentin Fallavier, Франция). Камптотецин растворяли в ДМСО. Конечная концентрация ДМСО не превышала 0,01%, концентрацию, которая не вызывала каких-либо токсичности. РНКазы, ПИ (пропидий йодид), Хехст H33342, MitoTracker® Красный CMXRos, TO-PRO-3, х-1, йодид 3,3'-dihexyloxacarbocyanine (DiOC6 (3)) и dihydroethidium (ДНЕ) были получены из компании Invitrogen ( Сержи-Понтуаз, Франция). Решение аннексина V-FITC (AV) комплект и 7-aminoactinomycin-D (7-AAD) были предоставлены BD Biosciences (Пон-де-Кле, Франция). М.Б.

• PLoS ONE: E-кадгерина счета для дестабилизации патогенностью миссенс мутациями в наследственный диффузный рака ж…
• PLoS ONE: Идентификация сыворотки микроРНК в качестве новых неинвазивных биомаркеров для раннего выявления рака…