Plos ONE: fermentirano mleko s Propionibacterium freudenreichii inducira apoptozo HGT-1 Human želodca Rak Cells

Povzetek

Ozadje

raka želodca, je eden od najpogostejših rakavih obolenj na svetu. Za "gospodarsko razvite države" način življenja, vključno s hrano, predstavlja dejavnik tveganja, ki daje prednost tega raka. Diet modulacija lahko zniža incidenco raka prebavnega. Med obetavnimi sestavin živil, so mlečni propionibacteria izkazalo, da sproži apoptozo človeških celic raka kolona, ​​po izpustitvi kratke verige maščobnih kislin acetat in propionat.

metodologija /glavnih ugotovitev

A fermentirano mleko , fermentirani izključno P. freudenreichii
, je bil pred kratkim oblikovan. V tem delu je bila pro-apoptotično potencial tega novega fermentiranega mleka je pokazala na človeške želodčne rakave celice HGT-1. Fermentirano mleko supernatant povzroča tipične značilnosti apoptoze, vključno kromatina kondenzacija, nastanek apoptotska organov, DNA laddering, ustavitev celičnega cikla in nastanek prebivalstva subG1, izpostavljenost Fosfatidilserin na plazemske membrane zunanjo uporabo, reaktivno kisikovo kopičenja vrst, mitohondrijske transmembranski morebitnih motenj, kaspaze aktivacija in sprostitev citokroma c. Zanimivo je, da ta nova fermentirano mleko, ki vsebuje P. freudenreichii
povečala citotoksičnost kamptotecina, zdravilo, ki se uporablja v želodcu kemoterapiji raka.

Sklepi /Pomen

Takšno novo probiotično fermentirano mleko lahko tako koristen kot del preventivne prehrane namenjena preprečevanje raka na želodcu in /ali kot prehransko dopolnilo, katere povzroča raka terapevtske tretmaje

Navedba. Cousin FJ, Jouan-Lanhouet s, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, Jan G (2012), fermentirano mleko z Propionibacterium freudenreichii
inducira apoptozo HGT-1 Human želodca rakavih celic. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10,1371 /journal.pone.0031892

Urednik: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 15. november 2011; Sprejeto: 19. januar 2012; Objavljeno: 19. marec 2012

Copyright: © 2012 Cousin et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bil financiran z Conseil Régional de Bretagne skozi développement razpisa CBB za projekte in Centre National interprofessionnel de l'Economie LAITIERE (CNIEL) skozi z razpisom Znanstveni odbor za Syndifrais za projekte. Raziskave v skupini IRSET je podprta s sredstvi iz Ligue Nationale contre le raka (Côte d'Armor, Ille et Vilaine, Morbihan, Vendée in Sarthe ODBOROV), INSERM Univerze v Rennesu 1 in regiji Bretagne. FJC prejela donacijo CNIEL (doktorsko štipendijo). Fl je podprlo združenje pour la Recherche sur le rak (doktorsko štipendijo). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Diet modulira tveganje za nastanek želodčne raka

Rak je glavni vzrok smrti v gospodarsko razvitih državah, ki so posledica izbire življenjskega sloga, povezanimi z rakom, vključno s kajenjem, telesna nedejavnost, in na "zahodni" dieti [ ,,,0],1]. Dejansko je vloga prehrane pri razvoju raka močno podprt z epidemiološkimi raziskavami, zlasti glede raka prebavnega trakta. Rak želodca (GC) predstavlja tretjo vrsto smrtonosnih rakavih obolenj pri moških na svetu. Leta 2008 je bilo po ocenah 640.600 primerov GC, ki povzročajo 464.400 smrtnih žrtev po vsem svetu [1]. Ta bolezen je še posebej pogoste v vzhodni Aziji ter v srednji in vzhodni Evropi. Najpomembnejši etiološki dejavniki, vpleteni v želodčnem kancerogenosti so prehrana in Helicobacter pylori
okužba . Tehtni dokazi, predvsem iz študije primera nadzora, kažejo, da je tveganje za naročnika GC povečala z visokim vnosom soljenih, kisle ali dimljeno tradicionalno živil, kot tudi posušene ribe in meso. Ravno nasprotno, vlakna, sveže zelenjave in sadja, morda zaradi njihove vsebnosti vitamina C, je bilo ugotovljeno, da je obratno povezana z GC tveganja [2], [3]. Vpliv sestavin naravnega /hrane na karcinogenezo želodca je torej raziskovali v zadnjih nekaj desetletjih [4] - [6]. Med njimi, probiotikov in njihovo sposobnost, da zavira razvoj raka pritegnila znanstveni interes [7], [8]. Probiotično je na splošno opredeljena kot "živi mikroorganizmi, ki, če ga dajemo v ustreznih količinah, daje koristi za zdravje gostitelja" [9]. Medtem ko nekatere mikroorganizme, kot so H. pylori
lahko vzpodbudi GC, drugi imajo lahko pozitivno vpliva s preprečevanjem prebavne raka. Zlasti lahko izbrane sevi probiotičnih bakterij omejila razvoj raka na živalskih modelih karcinogeneze [10]. To je še posebej razvidno za rak debelega črevesa pa je manj znano o možnih učinkih probiotikov na GC. Možna mehanistični razlaga takega zaščitnega učinka je in situ
sproščanje anti-rakotvornih metabolitov, kot so kratke verige maščobnih kislin (SCFAs).

Kratka verige maščobnih kislin povzroči apoptozo rakavih celic

SCFA, vključno acetat, propionat in butirat, so pomembni anione črevesne vsebine in njihova koncentracija se lahko spremeni s prehrano. Bili so pokazale, da igrajo ključno vlogo pri pomembnih fizioloških funkcij, vključno z modulacijo prebavnega epitelijskih celic ravnotežje orožja /apoptoze. To vključuje SCFA posredovanega aretacijo celičnega cikla, histona zaviranje deacetilaze in apoptozo stimulacije v transformiranih celic, temveč tudi spodbujanje diferenciacije pri zdravih celic [11], [12]. Ugotovljeno je bilo tudi, da je SCFAs butirata in propionatna tako inducira apoptozo v človeškem želodcu karcinom celičnih linij [13] - [15]. Apoptoza je ureditev naravni fiziološki proces, ki omogoča število celic in predstavlja cilj za kemoterapije za zdravljenje raka [16]. Apoptoza omogoča izločanje rakavih celic v "čisti" način. Rakave celice razdrobili na usklajen verižno reakcijo in ostanki se absorbira v sosednja tkiva in imunski sistem [17], [18]. Opisane so tudi dve glavni apoptotske poti: v ekstrinzični pot, ki je posredovana z aktivacijo smrtnih receptorjev in kaspaze 8 in notranjo pot, v katerih so vpleteni mitohondriji in kaspazne 9 [16]. Na splošno na rakavih celicah, se apoptotske funkcija primanjkuje, kar lahko pojasni njihovo trajno širjenje in posledično nastanek tumorjev. Sposobnost za indukcijo apoptoze rakavih celic tako znan po svoji terapevtski potencial [16]. Ker so mlečni propionibacteria sposobni proizvajati koristne pro-apoptotičnih SCFAs, se lahko izkaže za koristno pri preprečevanju ali zdravljenju raka.

Propionibacterium freudenreichii
lahko podpirajo apoptotske izločanje prebavnih rakavih celic

Ta probiotična mlečna Propionibacterium je pokazalo, da inducira celično smrt različnih rak debelega črevesa humanih celičnih linijah s pomočjo indukcije apoptoze v pomožnih kulturah [19]. Aktivne spojine, izločajo v mediju sproži notranjo mitohondrijske apoptotske poti v gojenih človeških kolorektalnih rakavih celic. Še posebej, SCFAs acetat in propionat sprosti P. freudenreichii
inducira apoptozo, ki deluje na mitohondrijske adenin nukleotidov translocator, ki povzroča mitohondriji depolarizacijo in permeabilisation, uhajanje citokroma c in aktivacije kaspaze [19], [20]. Vendar propionibacterial supernatante so vedno bolj pro-apoptotično od SCFAs acetat in propionat, ki se uporabljajo v koncentracij, izmerjenih v supernatantih, kar kaže, da se tudi druge spojine lahko vključi v ta namen. Izbrano seve P. freudenreichii
ostanejo živi in ​​metabolično aktivna v črevesju ljudi in-mikrobiote povezana podganah človekovih kjer proizvajajo SCFAs [21], [22]. Zato so bili prikazani za povečanje apoptozo v transformiranih epitelnih celic debelega takšnih podgan, krmljenih z rakotvorne 1,2-dimetilhidrazina (DMH), ne pa tudi pri nadzoru zdravi tisti, [23]. Propionibacteria lahko predstavljajo probiotiki, ki spodbujajo profilakso raka debelega črevesa, pod pogojem, da dosežejo svojo ciljno živ in metabolično aktivna. V zvezi s tem, vektorju, ali probiotični dostavno vozilo, se je izkazalo za določitev propionibacteria preživetje in aktivnosti [21], [24] [25]. Kompleksni mlečni proizvodi, kot so jogurt in sir, zlasti zaščito propionibacteria od stresa, vendar vsebuje kompleksno mešanico bakterij. Zato ni mogoče pripisati ugoden učinek na določen sev.

A fermentirano mleko je bila ocenjena kot dobave propionibacteria vozila v zvezi s tem

V tej študiji smo uporabili novo hrano-razred fermentirano mleko, ki vsebuje le P. freudenreichii
kot edini mikroflore. Ker ta izdelek vsebuje tako žive propionibacteria in njihovih aktivnih metabolitov, naj bi jih privede v stik z želodčne sluznice, kadar jo zaužije. To fermentirano mleko smo raziskali glede na HGT-1 želodca rakavih celic indukcijo apoptoze prehrano. Dejansko so propionibacteria znano, da bi ubil človeške rakave celice kolona vendar je njihov učinek na želodcu rakavih celic ni znan. Fermentirano mleko ubitih celic HGT-1 v časovno in odvisnosti od odmerka način. Opazili so tipične značilnosti procesa apoptoze, vključno s padcem upravičenosti, kromatina kondenzacija, nastanek Apoptotsko karoserij, DNA laddering, proizvodnjo ROS, mitohondrijske membrane potencialne motnje, aktivacije kaspaze, ustavitev celičnega cikla in nastanek prebivalstva subG1.

Rezultati

P. freudenreichii PODJETJA
fermentirano mleko ubija ljudi želodca in rakave celice debelega črevesa

P. freudenreichii
ITG P9 zrasel v 72 urah pri 30 ° C v dopolnjenem mleka in dopolnjena mleka ultrafiltrata, da bi dosegli končni prebivalstva za 9,43 log _{10 enot, tvorijo kolonije (CFU) /ml in 9.35 dnevnik 10 cfu /ml oz. Koncentracije SCFA bilo 26,21 mM acetat in 54.47 mM propionat (2.08 propionat /acetat razmerje) v fermentirano mleko supernatanta pa so bili 24.00 mm in 53.32 mm (razmerje 2,22) v fermentiranih mlečnih ultrafiltratni supernatant. Ta razmerja so se pričakuje propionibacteria, ki na splošno proizvajajo dvakrat toliko propionat kot acetat [26]. Testirali smo tudi dvanajst drugih živil razreda sevi mlečni propionibacteria (glej tabelo S1 in slika S1). Uporabo teh sevov, smo pridobili dvanajst fermentirani mleko. koncentracije propionata v razponu od 36 do 67 mm in propionibacteria populacije od 9,0 do 9,7 log 10 cfu /ml, za manj in za najbolj učinkovito seva oz.}

citotoksično potencial supernatantih pripravimo iz mleka ali mleko Ultrafiltrat, tako fermentirana z P. freudenreichii
ITG P9, raziskovali. HT-29 humane črevesne rakave celice in HGT-1 človeške želodčne rakave celice smo obdelali s temi supernatantih. Različne razredčitve, od pol do so bili testirani. Poleg tega smo testirali citotoksičnost zmesi 15 mM acetatnega in 30 mM propionata v koncentracijah, ki so blizu njih in pol razredčenimi supernatantih. Kot pozitivno kontrolo indukcije apoptoze je kamptotecin zdravila za kemoterapijo (4 m) in etopozid (100NM), so bili uporabljeni za celice HGT-1 in HT-29 oz. smo primerjali tri različne metode spremljanja celične smrti. Kot je prikazano na sliki S2, metilenmodrega, MTT in trypan modre izključitev teste dala podobne kinetiko smrti. Zato je metilen modro test uporabljen v tej študiji nadalje oceniti sposobnost preživetja celic. Ne-fermentirani mlečni izdelki (mleko ali mleko ultrafiltratni) ni imela nobenega vpliva, niti na HT-29, niti za preživetje HGT-1 celic (sl. 1 A, B). Supernatant mleka ali mlečnih Ultrafiltrat fermentirana z P. freudenreichii
povzročil podoben citotoksičnost v odvisnosti od časa način v HT-29 in celic HGT-1, in blizu citotoksičnosti z zdravili ali z mešanico acetat /propionata inducirane. Pol maksimalnega ubijanje celic HGT-1 pojavile po 24 urah in 26 urah zdravljenja s fermentirano mleko in fermentirani mlečni ultrafiltratni supernatantov vsakokrat po 17 urah zdravljenja z kamptotecina in po 24 urah zdravljenja z SCFA zmesi (sl. S3) . Poleg tega je bila citotoksičnosti fermentiranih supernatantih mlečnih izdelkov v celicah HGT-1 odvisna od odmerka (sl. 1C). Za vsako preskusno redčenju, je bil padec v HGT-1 celice preživetja, ki jih je fermentiranega mleka ali fermentiranega mleka ultrafiltrata inducirane zelo podobni (slika 1C &.. Slika S3). Zato so naslednji koraki študije smo izvedli samo s fermentirano mleko ultrafiltratni supernatant. Skupaj ti podatki kažejo, da propionibacteria učinkovito ubije človeškega debelega črevesa in želodca rakave celice, vsaj delno preko proizvodnji propionata in acetat (sl. 1). Nekatere druge fermentirane mleko, različni sevi mlečni propionibacteria fermentirane, je pokazala podobne citotoksične učinke na rakave celice (tabela S2). P. freudenreichii
ITG P9 je znana po svoji aktivnosti metabolizma in vivo
[22], je ustrezno fermentirano mleko dodatno preučiti.

P. freudenreichii PODJETJA
fermentirano mleko povzroča značilne oznake apoptoze v človeške želodčne rakavih celic

Jedro morfologija celic HGT-1 inkubiranih v prisotnosti P. freudenreichii
fermentirano mleko Ultrafiltrat smo analizirali s fluorescenčno mikroskopijo po Hoechst 33342 barvanja (sl. 2A). Jedrska fluorescenca neobdelanih celic (kontrola) v časovnem poteku poskusa z modro normalno jeder (čas 0 h, sl. 2aa) ostala nespremenjena. Med zdravljenjem, celice HGT-1 prikazali kondenziranega kromatina in razdrobljene jedra značilnosti apoptotičnih jeder (sl. 2ab, c), ki mu sledi pojav apoptotska organi na 72 ur (sl. 2Ad). Inter-nucleosomal razdrobljenost DNA povzroči laddering DNK, tipičen znak apoptoze [27], so opazovali tudi med fermentirane zdravljenjem mleko ultrafiltratni. fragmentacije DNK smo opazili od 24 urah zdravljenja z fermentiranega mleka ultrafiltrata (sl. 2B), ter v manjši meri s kamptotecina (sl. S3). vsebnost DNA je količinsko tudi s pretočno citometrijo po označevanju propidijevim jodidom za preučevanje učinka fermentirane mlečne ultrafiltrata na HGT-1 distribucije celičnega ciklusa (sl. 2C). Neobdelane celice HGT-1 predstavljena porazdelitev celičnega ciklusa (sl. 2Ca) brez subG1 fazo, ki je ostala v časovnem poteku poskusa nespremenjeni (podatki niso prikazani). Odstotek celic v subG1 fazi, kaže na apoptoze, med fermentirano mleko ultrafiltratni zdravljenja (. Slika 2CB, Cc, Cd) bistveno povečala s časom: na 24 ur (39,24 ± 4,87%), na 48 ur (91,63 ± 0,28 %) in po 72 urah (94,79 ± 0,45%). Po 48 urah in 72 urah zdravljenja so bile vse celice v fazi cikla subG1 celic, kar kaže na popolno smrt celic HGT-1. Kot kontrolo kamptotecin inducira podobne apoptotične značilni v HGT-1 celic (sl. S4).

Za potrditev apoptozo indukcija, phosphatdylserine translokacijo iz notranje na zunanjo navodilu za plazemske membrane je bila ocenjena z obarvanjem HGT- 1 celic s kombinacijo aneksinom v-FITC (AV) in 7-AAD, ki mu sledi analiza za pretočno citometrijo fluorescence (sl. 3). Neobdelanih celic (0 h) predstavila velik delež živih celic (AV ^{- /7AAD -; 92%) in le 5% celic, smo obarvali z aneksinom V (slika 3B.). Ti odstotki določeni v nezdravljenih celicah ni spremenila med časovnim potekom eksperimenta (podatki niso prikazani). Med zdravljenjem HGT-1 celic s pol razredčenih fermentiranega mleka ultrafiltrata v DMEMc, odstotek celic, obarvanih samo s 7-AAD (kaže nekroza) je bila zelo nizka (sl. 3B). Vendar odstotki celic, obarvanih z aneksinom V v odvisnosti od časa način znatno povečal in po 72 h (sl. 3B) dosegla 80%. Zato celice HGT-1 doživel apoptozo po zdravljenju z P. freudenreichii PODJETJA
fermentirano mleko Ultrafiltrat, označena s prvim AV pozitivni obarvanjem, kar kaže izpostavljenost fosfatidilserin, nato pa sta AV in 7-AAD pozitivno obarvanje, kar kaže na poznejši izgube celovitosti membrane. Kot kontrolo kamptotecin povzroča podobne apoptotične zaznamovano (slika S5.)}

Kot SCFA akt neposredno na mitohondrije, smo določili tri pomembne mitohondrijski parametri tudi:. V ΔΨm notranji membranski potencial, in generacija ROS, z uporabo dveh fluorescentne sonde, DiOC (6), 3 (ki je ΔΨm občutljiv) in DHE (ki zazna o _{2 ^{- stopnja) in lokalizacije citokroma c. Neobdelanih celic (0 h) so pokazali visoko fluorescenco (visoka ΔΨm) in nizko dhe fluorescence a (nizko proizvodnjo O 2 -) (. Slika 4A, B). Po obdelavi z fermentiranega mleka ultrafiltrata, (3) fluorescentne sonde opazili časovno odvisnega zmanjšanje vključitvijo DiOC6, razkrivajo izgubo ΔΨm in s tem mitohondrijske membrane depolarizacijo (sl. 4A). Odstotki obdelanih celic HGT-1 z zmanjšano notranji membranski potencial povečal v odvisnosti od časa način, da se doseže 96% celic po 72 urah. Zdravljenje FCCP smo uporabili kot pozitivno kontrolo mitohondrijske membrane depolarizacijo. Ta izguba ΔΨm bila potrjena z značilno izgube rdeče fluorescence naslednjem JC-1 barvanjem (sl. 4B). Pri proizvodnji ROS v celicah HGT-1, fermentirano mleko zdravljenje Ultrafiltrat povzroča kopičenje O 2 -, precej po 48 h in 72 h zdravljenja (slika 4C.). To kopičenje ROS je mogoče delno preprečiti, če celice so predhodno obdelati z ROS smetar TEMPOL (sl. S6). Citokrom c izpustitev iz mitohondrijev v citoplazmi je ključni celični dogodek apoptoze programa. Imunoblot pregled-citoplazmi obogaten frakcij za prisotnost citokroma c potrdili spremembo v svojem subcelično lokalizacije (sl. 4D). Citokrom c bila odkrita v-citoplazemskim obogatene frakcije iz 24 urah zdravljenja, kar kaže na selitev tega proteina (sl. 4D). Ta relocalization citokroma c v citoplazmi je bila potrjena z imunskim barvanjem, ki prikazuje razpršeno imunskim barvanjem po vsej celici po obdelavi, medtem ko prekinjajo obarvanje pred zdravljenjem (sl. 4E).}}

P. freudenreichii
fermentirano mleko aktivira kaspaze

Za potrditev apoptotične mehanizmov, fermentiranega mleka ultrafiltrata nastajajo v celicah HGT-1, je predelava kaspaze 3, 8 in 9 analizirali s zahodni blot in ustrezno spremljanje encimske aktivnosti v HGT ekstrakte -1 celic (sl. 5). non-fermentirano mleko Ultrafiltrat sedaj ni povzroči aktivacijo kaspazo v celicah HGT-1: samo proforms kaspaze-3 in -9 so odkrili na zahodni blot (. slika 5A) in ni kaspazne aktivnosti je bila izmerjena (slika 5B.). Fermentirano mleko Ultrafiltrat Supernatant, kot tudi kamptotecin ali zmes propionata in acetata v molarnem razmerju [2: 1], inducirano cepitev pro-kaspaze 3 in generacijo aktivnih oblik kaspaze-3, podenot P17 in P12 (sl. 5A). Aktivacija kaspaze-3, ki je efektorska kaspaza potrdil indukcijo apoptoze. Poleg tega fermentirano mleko Ultrafiltrat inducirano cepitev procaspase-9, ki vodi do 35 in 37 kDa predelane oblike. Kaspaze-8 ni bil odkrit v neobdelanih celicah nadzora HGT-1. Vendar pa je zdravljenje z propionibacterial supernatantih ali C2 /C3 mešanice privedla do očitnega odkrivanje kDa predobliki 54, sledi njegov cepitvijo po 48 urah zdravljenja

Količinska opredelitev kaspaze-3, -8 in. - 9 encimski aktivnosti potrdili aktivacijo kaspazo obe propionibacterial metabolitov in kamptotecina. Dejansko so kaspaze-9 in -3 aktivira v najzgodnejših fazah zdravljenja, kaspaze-8, medtem ko je bilo videti aktivira kasneje (sl. 5B). Kamptotecin in zmes SCFA aktivira vse tri študiral kaspazi s. Ti podatki so potrdili aktiviranje intrinzične poti apoptoze ga fermentiranega obdelavo mleka ultrafiltratni z zgodnji aktivaciji kaspaze-9 in nato še kaspaze-3 in -8.

P. freudenreichii PODJETJA
fermentirano mleko povečuje kamptotecina citotoksičnost

Campthotecin je citotoksična kino! alkaloid, ki inhibira DNA encima topoizomeraze I (topo I) in se pogosto uporablja pri kemoterapiji GC. Pokazali smo zgoraj, da propionibacterial metaboliti inducira apoptozo v celicah HGT-1 preko mitohondrijske smrtni poti. Mi poleg preučevali apoptozo s kombinacijo obeh kamptotecina in fermentiranega mleka ultrafiltrata v celicah HGT-1 inducirane. Povišane koncentracije kamptotecina (0, 0,25, 0,5, 1, 2 uM) v kombinaciji s povišano vsebnostjo fermentiranega mleka ultrafiltrata (0, ⅛, ž) smo testirali na sposobnost preživetja HGT-1 celic in tako inducirane izgube HGT-1 preživetja v način odvisnosti od odmerka (sl. 6). Poleg tega dodatek fermentiranega mleka ultrafiltrata znatno izboljšala citotoksičnost kamptotecina v celicah HGT-1 (sl. 6). Na primer, 0,25 LM kamptotecin in fermentirano mleko Ultrafiltrat razredčimo do ⅛ pripeljala do izgube upravičenosti 8,6% in 18,6%, oz. Kombinacija teh dveh spojin privedlo do izgube vitalnosti celične od 29,8% (sl. 6), kar kaže na dodano citotoksičnost učinka, ko je kamptotecin kombinaciji z fermentiranega mleka ultrafiltrata v celicah HGT-1. Zato je indeks kombinacija (CI), izračunan kot prej [28], ima vrednost 1, kar kaže aditiven učinek kamptotecina in fermentirani mlečni ultrafiltratni zdravljenja.

Diskusija

Nov fermentirano mleko, ki vsebuje P. freudenreichii
kot edini bakterije, je bil razvit, da bi dodatno raziskali probiotični potencial te priprave mleka in mlečnih izdelkov v propionibacteria (pregledali v [29]). V tej študiji smo poročajo, da je vodna faza tega fermentiranega mleka uničuje človeškega debelega črevesa in želodca rakave celice preko metaboliti, vključno propionata in acetat, ki ga ta bakterija sproščeni. Ta pojem temelji na ugotovljenih citotoksične učinke P. freudenreichii PODJETJA
fermentirano mleko supernatantov na kultivirani HT-29 in HGT-1 rakavih celic. Ta učinek je bil pridobljen z ultracentrifugiranja supernatantih, tj fermentirani mlečni vodno fazo, brez slehernega kazeina in bakterij, ki kažejo, da so aktivne spojine izločajo, kot je prej opisano za propionibacteria [19]. Iz tega razloga je večina poskusov v tem delu so bile izvedene z fermentiranega mleka ultrafiltrata (sl. 1). Pokazali smo, prvič, da je P. freudenreichii PODJETJA
fermentirano mleko supernatant inducirano apoptozo celic HGT-1 v časovno in odvisnosti od odmerka način, s pojavom klasične morfološke in biokemijske značilnosti apoptoze (kondenzira in razdrobljene chromation, DNA laddering in kopičenje celic v celični cikel subG1 faza).

Pregledali smo potem, če so celične mehanizme, ki sodelujejo pri HGT-1 celična smrt poti podoben mitohondrijev smrtni poti sprožil na Caco-2 in HT-29 človeških celic raka kolona s p. freudenreichii
DMEMc supernatante kulture [19], [20]. V sub-celične in biokemični dogodkov, ugotovljenih v tretiranih celicah HGT-1 s fermentirano mleko ultrafiltrata bili podobni in se je vsaj, mitohondrijska izgubo ΔΨm, ROS (O _{2 ^{-) generacija, kaspaze predelavo in aktivacije, citokrom c premestitev v citoplazmo (sl. 3, 4, 5). Fermentirano mleko Supernatant inducirane obdelavo in aktivacije kaspaze-8, poleg kaspaz -3 in -9. Poleg tega je slika 4A kaže, da je kaspaze-8 ne zazna v kontrolnih neobdelanih celicah in v celicah, zdravljenih z kamptotecina ali ne-fermentiranega mleka ultrafiltrata, v skladu s pomanjkanjem njene mRNA (C. Le Jossic-Corcos, Medicinska fakulteta, Brest , Francija, osebna komunikacija). Treba je opozoriti, da obstaja očitna razlika med encimskih rezultate, kar kaže kaspaze-8 dejavnost-kamptotecina obdelan celic, medtem ko ni kaspaze-8 odkrita v teh celicah, ki jih zahodni blot. To lahko razložimo s pomanjkanjem specifičnosti substrata Ac-IETD-AMC, ki se lahko obdelujejo z drugimi encimi, kot kaspaz -3 in -10 ali grancima B, še posebej, če je povišana koncentracija teh encimov [30] [31]. V nasprotju s tem, P. freudenreichii PODJETJA
fermentirano mleko ultrafiltratni in zmes SCFA tako povzročene ekspresije in aktivacije kaspaze-8. Mehanizmi, ki sodelujejo tukaj ni pojasnjen; Vendar pa je znano, da je premalo izraženo v nekaterih rakavih celic zaradi metilacije DNA [32], kaspaza-8 [33]. Njen izraz se lahko obnovi na ravni RNA in proteinov z demetiliranjem agenti kot decitabinom [34] in inhibitorjev HDAC [35], kar demetilacijo regulatornega zaporedja kaspaze-8, povečanje kaspaze-8 promotorja aktivnost in pri ponovnem -expression kaspaze-8 [32]. SCFA, kot propionat, so HDAC inhibitorji, ki vodijo do hyperacetylation od histones [36]. To daje prednost prepis preko sprememb v DNA zgradbe [37] in bi lahko obnovili izražanje kaspaze-8. Druge spojine rojeni hrane so že pokazale, da se ponovno vzpostavi kaspaze-8 izraz. Injiciranje ekstrakt Seme coicis
(sorodnik koruze) ekstrakt prikaz anti-tumor aktivnost krepi izražanje kaspaze 8 in inducira apoptozo v HepG2 celic [38]. Dialil disulfid, ki se nahajajo v česen, povečuje izražanje kaspaze-8, Fas in FasL v levkemije K562 celicah. Takšna ureditev se tako lahko vključeni v pro-apoptotskih učinke mlečnih propionibacteria in fermentiranih izdelkov, ki jih vsebujejo. Western blot dokazuje obnovljena izražanja in nato pozno aktivacija kaspaze-8 v celicah propionibacterial-metabolitov obdelane HGT-1, ki se lahko pojavijo kot posledica kaspaze-8 aktivacijo z drugim kaspaze kot kaspaze-9. Dejansko je izstop citokrom c, del mitohondrijske poti, se je izkazalo za aktiviranje več kaspaz, vključno z 2, 3, 6, 7, 8 in 10 [39]. Poleg tega je bila kaspaze-9 aktiviranje prikazan rezultat v down-toka kaspaze-8 aktivacijo [40]. V skladu s tem je bil prikazan kaspaze-9 in vitro
za aktivacijo kaspaze-3, ki v zavojih aktivira kaspaze-6, ki je odgovoren za kaspaze-8 aktivacijo [41]. Skupaj naši rezultati potrjujejo, da propionibacterial metaboliti prisotni v P. freudenreichii
fermentirano mleko povzroči več sub-celične mehanizme, ki spodbujajo apoptozo. Takšna reaktivacijo kaspaze-8 izražanja lahko privede do večjega apoptoze odziv v celicah HGT-1, zdravljenih z mrtvimi domen receptorji agonisti (npr Trail ali FAS).}}

Kolikor nam je znano, je to prvi poročanje specifična delovna indukcijo apoptoze rakavih celic želodca z fermentiranega mlečnega izdelka. Fermentirana mleka, jogurta vključno bilo predlagano, da so koristne pri preprečevanju raka na debelem črevesu. Epidemiološke podatke o varovalnih učinkih mleka in mlečnih izdelkov na stopnjo raka debelega črevesa dali nasprotujoče si rezultate [42]. Mleko in skupni mlečni izdelki poraba je povezano z zmanjšanjem debelega črevesa in tveganje za nastanek raka. Ampak to ne velja za vse vrste mlečnih izdelkov in učinkov močno razlikujejo. Fermentirani mlečni izdelki lahko predstavlja učinkovito dostavna vozila, ki ciljajo na zaščitnih molekul ali mikroorganizmov na določenih mestih, kot so prebavnega epitela [43]. Goveja laktoferin, sestavina mleka, inducira apoptozo debelega črevesa [44] in želodca [45] rakavih celic. Izbrani sevi so prisotne v fermentiranih mleka mikroorganizmov lahko nevtralizira tudi debelo črevo rakotvornost. V skladu s tem, jogurt in mlečnokislinske bakterije razstavljene proti raku lastnosti v živalskih modelih debelega črevesa rakotvornosti [46]. Vendar pa je malo delo usmerjeno v fermentiranih mlečnih izdelkov in rakom želodca. Naše delo kaže, da je P. freudenreichii
lahko igrajo pomembno vlogo pri tem, saj bi to omogočijo tudi v živo propionibacteria in pro-apoptotičnih metabolitov do želodčne sluznice. V zvezi s tem je treba vedeti, da je P. freudenreichii
spoštuje prebavne epitelne celice in sluz [47], [48]. Pokazalo se je tudi, da inhibira adhezijo povzročitelja raka želodca Helicobacter pylori
za prebavne epitelijskih celic, kot tudi H. pylori
inducirano škode [49]. Te lastnosti kažejo na vlogo P. freudenreichii PODJETJA
fermentirano mleko v profilakso raka želodca.

Na koncu naše fermentirano mleko potentialized pro-apoptotske delovanje kamptotecina drog na želodcu rakavih celic. V skladu s tem so bile žive kulture probiotičnih laktobacilov prej pokazale senzibilizirati LS513 na debelem rakave celice v 5-fluorouracyl [50]. Vendar pa v tem primeru sam imeli probiotiki niso proapoptotičnih učinka. V tem delu je bilo nizke odmerke kamptotecina drog, ki se uporablja v želodčnem kemoterapijo raka neučinkovita pri ubijanje želodčne rakavih celic. Vendar pa se v prisotnosti majhnih odmerkov P. freudenreichii PODJETJA
fermentirano mleko se učinkovito ubili enakih celic (sl. 6). Propionibacterial metaboliti povzroči notranjo apoptozo poti, ki delujejo neposredno na mitohondrije, medtem ko kamptotecin deluje na ravni DNK. To je v skladu z njihovo kumulativno potenciala na indukcijo apoptoze, ko se združijo ti pro-apoptotske induktorji. Poleg tega fermentirano mleko vsebuje [51] SFCAs, znan kot inhibitorjev HDAC ki lahko modulirajo apoptozo in celično cikla v želodčnih rakavih celic [13], kakor tudi izražanje celičnega cikla povezanih in apoptotskih proteinov v drugih rakavih celic [52] [53]. Probiotiki so že bili uporabljeni v kliničnih študijah za zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije raka [54]. P. freudenreichii
lahko, glede na naše rezultate, ki se uporabljajo v teh kliničnih študijah. Njen sinergijski učinek lahko pomagajo znižati odmerek drog in izboljšanje udobja bolnikov.

Na koncu, novo mleko, fermentirano izključno s P. freudenreichii
, inducirano apoptozo v HGT-1 človekovih želodca rakavih celic. Poleg tega ta fermentirano mleko izboljšano citotoksičnosti aktivnost kamptotecina, drog uporabljena pri želodčnem kemoterapijo raka. Takšna nova probiotik fermentirano mleko bi lahko bilo koristno kot funkcionalna hrana za preprečevanje raka na želodcu in /ali potentialize terapevtskih tretmajev.

Materiali in metode

Kemikalije

kamptotecin, etopozid , TEMPOL, acetat in propionat natrijeve soli in kaspazne substrate Ac-DEVD-AMC (N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-metilkumarin), Ac-IETD-AMC (N-acetil-Ile glu-CX-Asp-7-amido-4-metilkumarin) in Ac-LEHD-AFC (N-acetil-Leu-Glu-His-Asp-7-amido-4-trifluoromethylcoumarin) smo kupili pri Sigma-Aldrich (Saint -Quentin Fallavier, Francija). Kamptotecin smo raztopili v DMSO. Končna koncentracija DMSO ne presega 0,01%, koncentracijo, ki ne povzroči toksičnosti. RNazo A, PI (propidijevim jodidom), Hoechst H33342, MitoTracker® Red CMXRos, TO-PRO-3, JC-1, 3,3'-dihexyloxacarbocyanine jodida (DiOC6 (3)) in dihydroethidium (DHE) smo dobili iz Invitrogen ( Cergy-Pontoise, Francija). Rešitev aneksin V-FITC (AV) kit in 7-aminoactinomycin-D (7-AAD) so predložili BD Biosciences (Pont-de-Claix, Francija).

• Plos ONE: E-kadherina destabilizacijo računi za patogenost Missense mutacij v dednim difuzna Rak želodca
• Plos ONE: Identifikacija Serum MicroRNAs kot Novel neinvazivna bioloških označevalcev za zgodnje odkrivanje želodčnega raka