PLoS ONE: Melk gefermenteerd door Propionibacterium freudenreichii apoptose van HGT-1 menselijke maagkanker Cellen

De abstracte

Achtergrond

Maagkanker is een van de meest voorkomende kanker in de wereld. De "economisch ontwikkelde landen" life style, met inbegrip van voeding, vormt een risicofactor ten gunste van deze vorm van kanker. Diet modulatie kan spijsvertering incidentie van kanker te verlagen. Onder veelbelovende voedingsbestanddelen werden zuivel Propionibacteria aangetoond dat apoptose van humane darmkankercellen activeren via de afgifte van kortketenige vetzuren acetaat en propionaat.

Methodologie /voornaamste bevindingen

A gefermenteerde , uitsluitend gefermenteerd door P. freudenreichii
, is recentelijk ontworpen. In dit werk, het pro-apoptotische potentieel van deze nieuwe gefermenteerde melk werd aangetoond HGT-1 menselijke maagkanker cellen. Gefermenteerde melk bovenstaande geïnduceerde typische kenmerken van apoptose waaronder chromatine condensatie, de vorming van apoptotische lichamen, DNA-ladder, celcyclus en de opkomst van een subG1 bevolking, blootstelling fosfatidylserine aan het plasmamembraan buitenste leaflet, reactive oxygen species accumulatie, mitochondriale transmembraan potentiële verstoring, caspase activering en afgifte van cytochroom c. Opmerkelijk is deze nieuwe gefermenteerde melk met P. freudenreichii
verhoogde de cytotoxiciteit van camptothecine, een geneesmiddel dat bij maagkanker chemotherapie.

Conclusies /Belang

De hernieuwde probiotische gefermenteerde melk kan dus bruikbaar zijn als onderdeel van een preventief dieet ontworpen voorkomen maagkanker en /of als een voedingssupplement om kanker therapeutische behandelingen versterken

Visum:. Cousin FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, jan G (2012) Melk Gefermenteerde door Propionibacterium freudenreichii
apoptose van HGT-1 Human Gastric kankercellen. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10.1371 /journal.pone.0031892

Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 15 november 2011; Aanvaard: 19 januari 2012; Gepubliceerd: 19 maart 2012

Copyright: © 2012 Cousin et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gefinancierd door de Conseil Régional de Bretagne via de CBB développement oproep voor projecten en door het Centre National Interprofessionnel de l'Économie Laitière (CNIEL) door middel van door het Wetenschappelijk Comité van Syndifrais oproep voor projecten. Onderzoek in de IRSET groep werd ondersteund door subsidies van de Ligue Nationale Contre le Cancer (de Côte d'Armor, Ille et Vilaine, Morbihan, Vendée en Sarthe Comités), INSERM, de Universiteit van Rennes 1 en de regio Bretagne. FJC ontving een subsidie ​​van CNIEL (doctorale beurs). SJL werd gesteund door de Association pour la Recherche sur le Cancer (doctorale beurs). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

dieet moduleert het risico op het ontwikkelen van maagkanker

kanker is de belangrijkste doodsoorzaak in de economisch ontwikkelde landen als gevolg van kanker-geassocieerde levensstijl keuzes zoals roken, lichamelijke inactiviteit, en "verwesterd" dieet [ ,,,0],1]. Sterker nog, de rol van voeding bij het ontstaan ​​van kanker sterk gesteund door epidemiologische studies, in het bijzonder met betrekking tot kanker van het spijsverteringskanaal. Maagkanker (GC) vertegenwoordigt het derde type dodelijke kanker voor mannen in de wereld. In 2008 werden 640,600 gevallen van GC ingeschat, waardoor 464,400 sterfgevallen wereldwijd [1]. Deze ziekte is vaak voor in Oost-Azië, en in Midden- en Oost-Europa. De belangrijkste etiologische factoren die betrokken zijn in de maag carcinogenese zijn dieet en Helicobacter pylori
infectie. Substantieel bewijs, voornamelijk uit case-control studies, suggereert dat het risico van aanbestedende GC wordt vergroot door hoge inname van gezouten, gebeitst of traditioneel gerookt voedsel, evenals gedroogde vis en vlees. Integendeel, vezels, verse groenten en fruit, wellicht als gevolg van hun vitamine C, bleken omgekeerd geassocieerd worden met GC risico [2], [3]. De impact van de natuurlijke /voedingscomponenten op carcinogenese van de maag is dus onderzocht in de loop van de afgelopen decennia [4] - [6]. Hiervan probiotica en hun vermogen om de ontwikkeling van kanker te remmen aangetrokken wetenschappelijk belang [7], [8]. Een probioticum is over het algemeen gedefinieerd als "een levend micro-organisme dat, indien ze in voldoende hoeveelheden, verleent een voordeel voor de gezondheid van de host" [9]. Terwijl sommige micro-organismen zoals H. pylori
kan worden bevoordeeld GC, anderen kunnen een gunstig effect op het voorkomen van digestieve kankers. In het bijzonder kan gekozen probiotische stammen kankerontwikkeling in diermodellen van kanker [10] beperken. Dit werd met name aangetoond bij darmkanker terwijl minder bekend is over de mogelijke effecten van probiotica op GC. Een mogelijke mechanistische verklaring van dergelijke beschermende effect is in situ
afgifte van anti-carcinogene metabolieten zoals kortketenige vetzuren (SCFA's).

Korte vetzuurketens apoptose van kankercellen

SCFA, met inbegrip van acetaat, propionaat en butyraat, zijn belangrijke anionen van de darminhoud en hun concentratie kan worden gemoduleerd door het dieet. Zij kregen een sleutelrol in belangrijke fysiologische functies, waaronder modulatie van het spijsverteringsstelsel epitheelcellen proliferatie /apoptose balans spelen. Hierbij SCFA-gemedieerde celcyclus arrestatie histon deacetylase remmen en apoptose in getransformeerde cellen stimuleren, maar ook stimulatie van differentiatie in gezonde cellen [11], [12]. Ook is gemeld dat het SCFA butyraat en propionaat zowel apoptose in humane gastrische carcinoma cellijnen [13] - [15]. Apoptose is een natuurlijk fysiologisch proces waardoor het aantal cellen regelgeving en vormt een doelwit voor anti-kanker chemotherapie [16]. Apoptose maakt depletie van kankercellen in een "schone" manier. Kankercellen fragment gecoördineerd kettingreactie en de residuen opgenomen door aangrenzende weefsels en het immuunsysteem [17], [18]. Twee belangrijke apoptoseroutes beschreven: de extrinsieke route, wat gemedieerd door activering van de dood receptoren en caspase 8, en de intrinsieke route, waarbij mitochondriën en caspase 9 betrokken zijn [16]. In het algemeen, in kankercellen, de apoptotische functie ontbreekt, waardoor hun aanhoudende proliferatie en dientengevolge de vorming van tumoren kan verklaren. Het vermogen om apoptose van kankercellen induceren wordt daarom erkend om zijn therapeutische potentieel [16]. Aangezien zuivel propionibacteriën in staat zijn om heilzame pro-apoptotische SCFAs produceren, kunnen ze nuttig zijn in de preventie of behandeling van kanker te bewijzen.

Propionibacterium freudenreichii
kunnen apoptotische uitputting van de spijsvertering kankercellen bevorderen

Het probioticum propionibacterium bleek celdood van verschillende humane colonkanker cellijnen te induceren tot apoptose inductie, in co-kweken [19]. De actieve verbindingen in het medium, leiden tot de intrinsieke mitochondriale apoptotische route in gekweekte humane colorectale kankercellen. Vooral de SCFA acetaat en propionaat vrijgegeven door P. freudenreichii
induceren apoptose door middel van het mitochondriale adenine nucleotide translocator, waardoor mitochondria depolarisatie en permeabilisatie, lekkage van cytochroom c en caspase activatie [19], [20]. Echter, supernatanten propionibacteriële nog meer pro-apoptotische dan SCFAs acetaat en propionaat, gebruikt bij de concentraties gemeten in supernatanten, wat suggereert dat andere verbindingen kunnen worden betrokken bij dit effect. Geselecteerde stammen van P. freudenreichii
levende en metabool actief binnen de darm van mensen en menselijke microbiota-geassocieerde ratten blijven waar ze SCFA's [21] produceren [22]. Zij werden derhalve aangetoond dat apoptose in getransformeerde colon epitheelcellen van deze ratten gevoed met het carcinogeen 1,2-dimethylhydrazine (DMH) te verhogen, maar niet in controle gezonde cellen [23]. Propionibacteria kon probiotica begunstiging van darmkanker profylaxe vormen, op voorwaarde dat ze hun doel levend en metabolisch actief te bereiken. In dit verband heeft de vector of probiotische afgiftedrager, bleek propionibacteriën overleving en activiteit [21], [24], [25] bepalen. Complexe zuivelproducten zoals yoghurt en kaas, met name beschermen Propionibacteria stress, maar een complex mengsel van bacteriën bevatten. Het is dus niet mogelijk om het gunstige effect toekennen aan een bepaalde stam.

Een gefermenteerde melk werd beoordeeld als propionibacteriën afgiftedrager in deze context

In deze studie hebben we een nieuwe voedingskwaliteit gefermenteerde melk met alleen P. freudenreichii
als enige microflora. Aangezien dit product bevat zowel levende propionibacteriën en de actieve metabolieten, moet ze in contact brengen met het maagslijmvlies bij inname. Deze gefermenteerde melk werd geanalyseerd met betrekking tot HGT-1 menselijke maagkanker cellen apoptose-inductie. Inderdaad, Propionibacteria veroorzaakt humane colonkanker doden maar hun effect op maagkanker cellen onbekend. De gefermenteerde melk gedood HGT-1 cellen op een tijd- en dosis-afhankelijke wijze. Typische kenmerken van het apoptose proces werden waargenomen, waaronder levensvatbaarheid drop, chromatine condensatie, de vorming van apoptotische lichamen ', DNA-ladder, ROS productie, mitochondriale membraanpotentiaal verstoring, caspase activering, celcyclus en de opkomst van een subG1 bevolking.

Resultaten

P. freudenreichii
gefermenteerde melk doodt menselijke maag- en darmkanker cellen

P. freudenreichii
ITG P9 groeide in 72 uur bij 30 ° C in aangevuld melk en aangevuld melk ultrafiltraat definitieve bevolking te bereiken van 9,43 log _{10 kolonievormende eenheden (kve) /ml en 9,35 log 10 cfu /ml, respectievelijk. De SCFA concentraties waren 26,21 mM acetaat en 54,47 mM propionaat (2,08 propionaat /acetaat ratio) in de melk gefermenteerde bovenstaande terwijl ze 24,00 mm 53,32 mM (2,22 ratio) in de gefermenteerde melk ultrafiltraat supernatant. Deze verhoudingen werden verwacht voor Propionibacteria, die in het algemeen produceren twee keer zoveel als acetaat propionaat [26]. Twaalf andere food-grade zuivel propionibacteriën stammen werden ook getest (zie tabel S1 en figuur S1). Met behulp van deze stammen, werden twaalf gefermenteerde melk verkregen. Propionaat concentraties varieerden 36-67 mM en propionibacteriën populaties 9,0-9,7 log 10 cfu /ml, voor de minder en de meest efficiënte stam, respectievelijk.}

De cytotoxische potentieel van supernatanten bereid uit melk of melk ultrafiltraat, zowel gefermenteerd door P. freudenreichii
ITG P9, werd onderzocht. HT-29 menselijke darmkankercellen en HGT-1 menselijke maagkanker cellen werden behandeld met deze supernatanten. Verschillende verdunningen variërend van ½ tot getest. Bovendien is de cytotoxiciteit van een mengsel van 15 mM acetaat en 30 mM propionaat werd getest in concentraties dicht bij deze ½ verdunde supernatanten. Als positieve controle van apoptose inductie chemotherapie drugs camptothecine (4 uM) en etoposide (100 pM) werden gebruikt voor HGT-1 en HT-29 cellen. Drie verschillende methoden voor celdood controle vergeleken. Zoals getoond in figuur S2, methyleenblauw, MTT en trypanblauwexclusie bepalingen leverden vergelijkbare kinetiek van dood. Bijgevolg werd methyleenblauw assay gebruikt in deze studie cellevensvatbaarheid verder te beoordelen. De niet-gefermenteerde melkproducten (melk of melk ultrafiltraat) geen effect noch op de HT-29, noch op HGT-1 cellevensvatbaarheid (fig. 1 A, B). Het supernatant van melk of ultrafiltraat gefermenteerd door P. freudenreichii
induceerde een vergelijkbare cytotoxiciteit in een tijdsafhankelijke wijze HT-29 en HGT-1-cellen, en dicht bij de cytotoxiciteit veroorzaakt door drugs of het acetaat /propionaat mengsel. Half-maximale doding van HGT-1 cellen trad na 24 uur en 26 uur behandeling met de gefermenteerde melk en gefermenteerde melk ultrafiltraat supernatanten respectievelijk na 17 uur behandeling met camptothecine na 24 uur behandeling met SCFA mengsel (afb. S3) . Bovendien, de cytotoxiciteit van gefermenteerde zuivelproduct supernatanten in HGT-1-cellen was dosisafhankelijk (Fig. 1C). Voor elke geteste verdunning, de daling van HGT-1 cellevensvatbaarheid geïnduceerd door de gefermenteerde melk of gefermenteerde melk ultrafiltraat was vergelijkbaar (figuur 1C &. Fig. S3). Dat is de reden waarom de volgende stappen van het onderzoek voerden we alleen met de gefermenteerde melk ultrafiltraat supernatant. Samengenomen geven deze gegevens aan dat propionibacteriën efficiënt menselijke colon- en maagkanker doden, ten minste gedeeltelijk via de productie van propionaat en acetaat (fig. 1). Enkele andere gefermenteerde melk, gefermenteerd door verschillende zuivelproducten Propionibacteria stammen, toonde vergelijkbare cytotoxische effecten op kankercellen (tabel S2). P. freudenreichii
ITG P9 feit dat bekend staat om zijn metabolische activiteit In vivo
[22], werd de overeenkomstige gefermenteerde melk verder bestudeerd.

P. freudenreichii
gefermenteerde melk induceert typische kenmerken van apoptose in menselijke maagkanker cellen

Kern morfologie van HGT-1 cellen geïncubeerd in aanwezigheid van P. freudenreichii
gefermenteerde ultrafiltraat werd geanalyseerd met fluorescentiemicroscopie na 33.342 Hoechst kleuring (fig. 2A). De nucleaire fluorescentie van onbehandelde cellen (controle) bleven onveranderd gedurende het tijdsverloop van het experiment met blauwe normale kernen (tijdstip 0 uur, fig. 2AA). Tijdens de behandeling getoond HGT-1 cellen de gecondenseerde chromatine en gefragmenteerde kernen kenmerken van apoptotische nuclei (Fig. 2AB, c), gevolgd door het verschijnen van apoptotische lichamen bij 72 uur (Fig. 2AD). Inter-nucleosomale DNA-fragmentatie wat DNA-ladder, een typisch kenmerk van apoptose [27], werd gevolgd tijdens gefermenteerde melk ultrafiltraat behandeling. DNA fragmentatie werd waargenomen vanaf 24 uur behandeling met gefermenteerde melk ultrafiltraat (fig. 2B), en in mindere mate met camptothecine (afb. S3). DNA-gehalte werd gekwantificeerd door stromingscytometrie na propidiumjodide labeling het effect van gefermenteerde melk ultrafiltraat op HGT-1 celcyclusverdeling (Fig. 2C) te bestuderen. Onbehandelde HGT-1 cellen gepresenteerd een celcyclusverdeling (fig. 2Ca) zonder subG1 fase, die onveranderd gedurende het tijdsverloop van het experiment bleef (gegevens niet getoond). Het percentage cellen in subG1 fase indicatief voor een apoptotisch proces aanzienlijk vergroot door tijdens gefermenteerde melk ultrafiltraat behandeling (figuur 2CB, Cc, Cd.): Bij 24 uur (39,24 ± 4,87%), 48 uur (91,63 ± 0,28 %) en 72 uur (94,79 ± 0,45%). Op 48 uur en 72 uur behandeling, alle cellen in de subG1 celcyclus fase, waarin de volledige dood van HGT-1 cellen. Als controle, camptothecine geïnduceerde apoptotische soortgelijke kenmerken in HGT-1-cellen (Fig. S4).

Om apoptose-inductie, phosphatdylserine translocatie van de binnenste naar de buitenste leaflet van de plasmamembraan bevestigen werd bepaald door kleuring HGT- 1 cellen met een combinatie van Annexine V-FITC (AV) en 7-AAD, gevolgd door flowcytometrie fluorescentie analyse (Fig. 3). Onbehandelde cellen (0 h) presenteerde een hoog gehalte aan levende cellen (AV ^{- /7AAD -; 92%) en slechts 5% van de cellen gekleurd met Annexine V (figuur 3B.). Deze percentages bepaald in onbehandelde cellen niet veranderen tijdens het tijdsverloop van het experiment (gegevens niet getoond). Tijdens de behandeling van HGT-1 cellen met ½ verdunde gefermenteerde melk ultrafiltraat in DMEMc, het percentage cellen alleen gekleurd door 7-AAD (vermelding necrose) was zeer laag (fig. 3B). De percentages van cellen gekleurd met Annexine V significant verhoogd in een tijd-afhankelijke wijze en 80% bereikte na 72 uur (fig. 3B). Derhalve HGT-1 cellen ondergingen apoptose na behandeling met P. freudenreichii
gefermenteerde melk ultrafiltraat, gekenmerkt door de eerste AV positieve kleuring, met vermelding van de blootstelling fosfatidylserine, en dan zowel AV en 7-AAD positieve kleuring, wat wijst op een latere verlies van membraan integriteit. Als controle, camptothecine geïnduceerde apoptotische vergelijkbare kenmerken (figuur S5.)}

Al SCFA handeling direct aan mitochondriën werden drie belangrijke mitochondriale parameters ook bepaald. A ^ m de binnenste membraanpotentiaal en het genereren van ROS, met twee fluorescerende probes, Dioc (6) 3 (die A ^ m-gevoelig) en DHE (waarin O _{2 ^{detecteert - niveau), en de lokalisatie van cytochroom c. Onbehandelde cellen (0 h) vertoonde een hoge fluorescentie (A ^ m hoog) en een lage fluorescentie DHE (lage productie van O 2 -) (fig. 4A, B). Na behandeling met gefermenteerde melk ultrafiltraat, een tijdsafhankelijke afname incorporatie van DiOC6 (3) fluorescente probe waargenomen, onthullen een verlies van A ^ m en dus mitochondriale membraan depolarisatie (Fig. 4A). De percentages van behandelde HGT-1 cellen met verkleinde binnendiameter membraanpotentiaal nam op tijdsafhankelijke wijze 96% van de cellen bereikt bij 72 uur. FCCP behandeling werd gebruikt als een positieve controle mitochondriale membraan depolarisatie. Dit verlies van A ^ m werd bevestigd door de karakteristieke verlies aan rode fluorescentie na JC-1 kleuring (Fig. 4B). Met betrekking tot ROS productie in HGT-1-cellen, gefermenteerde melk ultrafiltraat behandeling geïnduceerde accumulatie van O 2 - aanzienlijk na 48 uur en 72 uur van de behandeling (figuur 4C.). Deze ROS accumulatie kan gedeeltelijk worden voorkomen als cellen voorbehandeld door de ROS scavenger TEMPOL (fig. S6). Afgifte van cytochroom c van mitochondria naar het cytoplasma is een belangrijke cellulaire gebeurtenis van het apoptotische programma. Immunoblotting onderzoek van de cytoplasma-verrijkte fracties op de aanwezigheid van cytochroom c bevestigde een wijziging van de subcellulaire lokalisatie (fig. 4D). Cytochroom c gedetecteerd in het cytoplasma-verrijkte fractie uit 24 uur behandeling, wat aangeeft verplaatsing van dit eiwit (Fig. 4D). Dit herlokalisatie van cytochroom c in het cytoplasma werd bevestigd door immunokleuring tonen diffuse immunokleuring gehele cellen na behandeling, terwijl punctuated kleuring vóór behandeling (fig. 4E).}}

P. freudenreichii
gefermenteerde melk caspasen activeert

De apoptotische mechanismen geïnduceerd door gefermenteerde melk ultrafiltraat in HGT-1 cellen bevestigen verwerking van caspases 3, 8 en 9 werd geanalyseerd met western blotting en overeenkomstige enzymatische activiteiten monitoring HGT -1 celextracten (fig. 5). alleen de Proforms van caspase-3 en -9 werden gedetecteerd op western blot (fig. 5A) en geen caspase activiteit werd gemeten (figuur 5B.): De niet-gefermenteerde melk ultrafiltraat heeft caspase activering in HGT-1-cellen opwekken. De gefermenteerde melk ultrafiltraat supernatant, en de camptothecine of mengsel van propionaat en acetaat in een [2: 1] molverhouding geïnduceerde klieving van de pro-caspase 3 en de vorming van de actieve vorm van caspase-3, de subeenheden p17 en p12 (Fig. 5A). De activering van caspase-3, die een effector caspase, bevestigde de apoptose-inductie. Bovendien, gefermenteerde melk ultrafiltraat induceerde klieving van procaspase-9, waardoor de 35 en 37 kDa verwerkte vormen. Caspase-8 werd niet gedetecteerd in onbehandelde HGT-1 cellen. Echter, een propionibacteriële supernatanten of C2 /C3 mengsel tot een duidelijke detectie van de 54 kDa proform, gevolgd door de splitsing na 48 uur behandeling

De kwantificering van de caspase-3, -8 en. - 9 enzymactiviteiten bevestigd caspase activatie door zowel propionibacteriële metabolieten en camptothecine. Inderdaad, caspasen-9 en -3 werden geactiveerd in de vroegste stadia van de behandeling, terwijl caspase-8 leek geactiveerde later (Fig. 5B). Camptothecine en de SCFA mengsel geactiveerde alle drie onderzochte caspasen. Deze gegevens bevestigden de activatie van de intrinsieke route van apoptose door gefermenteerde ultrafiltraat behandeling, met een vroege activatie van caspase-9 en caspase-3 en -8.

P. freudenreichii
gefermenteerde melk verhoogt camptothecine cytotoxiciteit

Campthotecin een cytotoxisch alkaloïde chinoline waarin het DNA-enzym topoisomerase I (topo I) remt en wordt veel gebruikt in de chemotherapeutische behandeling van GC. We hebben aangetoond dat hierboven propionibacteriële metabolieten apoptose in HGT-1 cellen via de mitochondriale dood route. Bestudeerden we vervolgens apoptose geïnduceerd door de combinatie van camptothecine en gefermenteerde melk ultrafiltraat in HGT-1 cellen. Verhoogde concentraties van camptothecine (0, 0,25, 0,5, 1, 2 pM) in combinatie met verhoogde concentraties van gefermenteerde melk ultrafiltraat (0,, ⅛, ¼) werden op HGT-1 cellevensvatbaarheid getest en beide geïnduceerd verlies van HGT-1 levensvatbaarheid , op een dosis-afhankelijke manier (Fig. 6). Bovendien is de toevoeging van gefermenteerde melk ultrafiltraat verbeterde aanzienlijk cytotoxiciteit van camptothecine in HGT-1-cellen (fig. 6). Bijvoorbeeld, 0,25 pM camptothecine en gefermenteerde melk ultrafiltraat verdund tot ⅛ leidde tot een levensvatbaarheid verlies van 8,6% en 18,6% respectievelijk. De combinatie van deze twee verbindingen tot een verlies van cellevensvatbaarheid 29,8% (fig. 6), hetgeen een toegevoegde cytotoxiciteit camptothecine effect wanneer gecombineerd met gefermenteerde melk ultrafiltraat in HGT-1 cellen. Dienovereenkomstig is de combinatie index (CI), berekend zoals eerder [28], een waarde van 1 wijst op een additief effect van camptothecine en gefermenteerde melk ultrafiltraat behandelingen.

Discussie

Nieuwe gefermenteerde melk, die P. freudenreichii
als enige bacterie, werd ontwikkeld om de probiotische potentieel van deze zuivel bereiding van Propionibacteria verder te onderzoeken (beschreven door [29]). In deze studie rapporteren we dat de waterfase van de gefermenteerde melk doodt menselijke colon- en maagkanker cellen via metabolieten, zoals propionaat en acetaat, vrijgegeven door deze bacterie. Dit idee is gebaseerd op de waargenomen cytotoxische effecten van P. freudenreichii
gefermenteerde melk supernatanten op gekweekte HT-29 en HGT-1 kankercellen. Dit effect werd verkregen met ultracentrifugatie supernatanten, d.w.z. de gefermenteerde melk waterfase, zonder caseïnen en bacteriën, blijkt dat de werkzame stoffen worden afgescheiden, zoals eerder beschreven voor propionibacteriën [19]. Om deze reden zijn de meeste van de experimenten in dit werk werden uitgevoerd met gefermenteerde melk ultrafiltraat (fig. 1). We hebben laten zien voor de eerste keer dat de P. freudenreichii
gefermenteerde melk supernatant van geïnduceerde apoptose HGT-1 cellen op een tijd- en dosis-afhankelijke wijze met het verschijnen van klassieke morfologische en biochemische kenmerken van apoptose (gecondenseerde en gefragmenteerd chroma-, DNA-ladder en accumulatie van cellen in subG1 celcyclus fase).

We keken dan als de cellulaire mechanismen betrokken bij HGT-1 celdood route waren vergelijkbaar met de mitochondriale dood route geactiveerd in Caco-2 en HT-29 menselijke darmkankercellen door P. freudenreichii
DMEMc kweeksupernatanten [19], [20]. De sub-cellulaire en biochemische gebeurtenissen in behandelde HGT-1 cellen met gefermenteerde melk ultrafiltraat waren vergelijkbaar en inclusief ten minste mitochondriale A ^ m verlies, ROS (O _{2 ^{-) genereren, caspases verwerking en activering, cytochroom c verplaatsing in het cytoplasma (fig. 3, 4, 5). Gefermenteerde supernatant geïnduceerde verwerking en activering van caspase-8, naast caspases -3 en -9. Bovendien Figuur 4A geeft aan dat caspase-8 niet gedetecteerd in onbehandelde cellen en cellen behandeld met camptothecine of niet-gefermenteerde melk ultrafiltraat, in overeenstemming met het ontbreken van het mRNA (K. Le Jossic-Corcos, Faculty of Medicine, Brest , Frankrijk, persoonlijke communicatie). Er wordt opgemerkt dat een schijnbare discrepantie tussen enzymatische resultaten suggereren caspase-8 activiteit in-camptothecine behandelde cellen, terwijl er geen caspase-8 wordt waargenomen in deze cellen door Western blotting. Dit kan worden verklaard door het gebrek aan specificiteit van het Ac-IETD-AMC substraat, dat door andere enzymen zoals caspases -3 en -10 of granzyme B worden verwerkt, vooral als de concentratie van dergelijke enzymen wordt verhoogd [30], [31]. Daarentegen P. freudenreichii
gefermenteerde melk ultrafiltraat en het mengsel SCFA veroorzaakt zowel expressie en activering van caspase-8. De hierbij betrokken mechanismen zijn niet opgehelderd; echter caspase-8 bekend is onder gebracht in sommige kankercellen als gevolg van DNA-methylatie [32], [33]. De expressie kan op het RNA en eiwitniveau worden hersteld door demethylerende middelen zoals decitabine [34] en HDAC remmers [35], waardoor demethylering van de regulerende sequentie van caspase-8, een toename van caspase-8 promotoractiviteit en in re -expressie van caspase-8 [32]. SCFA, zoals propionaat, zijn HDAC inhibitoren, waardoor hyperacetylering van histonen [36]. Dit bevordert de transcriptie via een verandering in DNA conformatie [37] en kunnen de caspase-8 expressie herstellen. Andere door voedsel geboren verbindingen werden reeds aangetoond dat caspase-8 expressie herstellen. Een injecteerbare extract van Sperma Coicis
(relatieve maïs) extract weergeven antitumoractiviteit verhoogt expressie van caspase 8 en induceert apoptose in HepG2-cellen [38]. Diallyldisulfide, gevonden in knoflook, verhoogt expressie van caspase-8, Fas en FasL bij leukemie K562-cellen. Een dergelijke regeling kan derhalve betrokken zijn bij de pro-apoptotische effecten van zuivel Propionibacteria en gefermenteerde producten die deze bevatten. Western blotting blijkt hersteld expressie, late activatie van caspase-8 in propionibacteriële metabolieten behandeld HGT-1 cellen, die kunnen optreden als gevolg van caspase-8 activatie door een ander caspase zoals caspase-9. Inderdaad, uitgang van cytochroom c, een deel van de mitochondriale pathway, bleek verscheidene caspases zoals 2, 3, 6, 7, 8 en 10 [39] te activeren. Bovendien werd caspase-9 activatie gegeven resultaat in stroomafwaartse caspase-8 activatie [40]. Dienovereenkomstig caspase-9 krijgt in vitro
activeren caspase-3 die in bochten caspase-6 geactiveerd, verantwoordelijk voor caspase-8 activatie [41]. Al met al, onze resultaten bevestigen dat propionibacteriële metabolieten aanwezig zijn in P. freudenreichii
gefermenteerde melk induceren verschillende sub-cellulaire mechanismen ten gunste van apoptose. Dergelijke reactivering van caspase-8 expressie kan leiden tot een belangrijke apoptotische respons in HGT-1 cellen behandeld met dode domeinreceptoren agonisten (bijv Trail of Fas).}}

Voor zover wij weten is dit het eerste werk rapportage specifieke inductie van maagkanker cel apoptose door een gefermenteerd zuivelproduct. Gefermenteerde melken, zoals yoghurt, voorgesteld bruikbaar zijn bij de preventie van darmkanker is. Epidemiologische gegevens over de beschermende effecten van melk en zuivelproducten op darmkanker tarief gaf tegenstrijdige resultaten [42]. Melk en zuivelproducten totale consumptie geassocieerd met een vermindering van het risico op colorectale kanker. Maar dit is niet voor alle soorten zuivelproducten en effecten sterk variëren. Gefermenteerde zuivelproducten kunnen efficiënte levering voertuigen beschermende moleculen of microorganismen specifieke doelplaatsen vormen zoals het maag epitheel [43]. Runderlactoferrine, een bestanddeel van melk, induceert apoptose van colon [44] en maag [45] kankercellen. Geselecteerde stammen van micro-organismen die aanwezig zijn in gefermenteerde melk kan ook tegen darmkanker. Dienovereenkomstig, yoghurt en melkzuurbacteriën vertoonde anti-kanker eigenschappen in diermodellen van darmkanker [46]. Echter, weinig werk gericht op gefermenteerde zuivelproducten en maagkanker. Ons werk suggereert dat P. freudenreichii
een rol weggelegd, omdat zij zowel levende propionibacteriën en pro-apoptotische metabolieten zou leveren aan het maagslijmvlies. In dit verband moet worden opgemerkt dat de P. freudenreichii
hecht aan epitheelcellen spijsvertering en slijm [47], [48]. Er werd ook aangetoond dat de hechting van de verwekker van maagkanker Helicobacter pylori
remmen epitheelcellen, en H spijsvertering. pylori
geïnduceerde schade [49]. Deze eigenschappen wijzen op een rol van P. freudenreichii
gefermenteerde melk in de profylaxe van maagkanker.

Tenslotte maken gefermenteerde melk gepotentialiseerde de pro-apoptotische werking van het geneesmiddel camptothecine op maagkanker cellen. Dienovereenkomstig werden levende culturen van probiotische lactobacilli eerder aangetoond dat LS513 colorectale kankercellen te sensibiliseren voor 5-fluorouracyl [50]. In dit geval, de probiotica alleen had geen proapoptotische effect. In dit werk, lage doses van het medicijn camptothecine gebruikt bij maagkanker chemotherapie waren niet efficiënt in het doden van maagkanker cellen. In de aanwezigheid van lage doses van P. freudenreichii
gefermenteerde melk, ze dezelfde cellen efficiënt gedood (Fig. 6). Propionibacteriële metabolieten induceren de apoptose intrinsieke reactieweg door direct op mitochondria, terwijl camptothecine werkt op het DNA niveau. Dit strookt met de cumulatieve potentieel in apoptose-inductie wanneer deze pro-apoptotische induceerders gecombineerd. Bovendien, de gefermenteerde melk bevat SFCAs, bekend als HDAC remmers kunnen apoptose en celcyclus moduleren maagkanker cellen [13], [51] en de expressie van celcyclus verwante en apoptotische eiwitten in andere kankercellen [52], [53]. Probiotica werden reeds gebruikt in klinische studies om de bijwerkingen van kankerchemotherapie [54] te verminderen. P. freudenreichii
kan, volgens onze resultaten worden gebruikt in dergelijke klinische studies. Het synergistisch effect kan helpen om de dosis geneesmiddel verlagen en het comfort van de patiënt.

Kortom, een nieuwe melk gefermenteerd door uitsluitend P. freudenreichii
, geïnduceerde apoptose in HGT-1 menselijke maagkanker cellen. Daarnaast is deze gefermenteerde melk verbeterde de camptothecine cytotoxiciteit activiteit geneesmiddel dat bij maagkanker chemotherapie. Dergelijke nieuwe probiotische gefermenteerde melk kan van belang zijn als een functioneel voedsel om maagkanker te voorkomen en /of therapeutische behandelingen potentialize.

Materialen en Werkwijzen

Chemie

Camptothecine, etoposide , TEMPOL, acetaat en propionaat natriumzouten en caspase substraten Ac-DEVD-AMC (N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-methylcoumarin), Ac-IETD-AMC (N-Acetyl-Ile Glu-Thr-Asp-7-amido-4-methylcoumarin) en Ac-LEHD-AFC (N-acetyl-Leu-Glu-His-Asp-7-amido-4-trifluormethylcoumarine) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. -Quentin Fallavier, Frankrijk). Camptothecine werd opgelost in DMSO. De eindconcentratie van DMSO niet meer dan 0,01%, een concentratie die geen toxiciteit induceerde. RNAse A, PI (propidiumjodide), Hoechst H33342, MitoTracker® Red CMXRos, TO-PRO-3, JC-1, 3,3-dihexyloxacarbocyanine jodide (DiOC6 (3)) en dihydroethidium (DHE) werden verkregen van Invitrogen ( Cergy-Pontoise, Frankrijk). Annexine V-FITC (AV) kit en 7-amino-actinomycine-D-oplossing (7-AAD) werden verstrekt door BD Biosciences (Pont-de-Claix, Frankrijk).

• PLoS ONE: E-cadherine destabilisatie Accounts voor de pathogeniciteit van missense mutaties in erfelijke Diffuse Gastric Cancer
• PLoS ONE: Identificatie van Serum MicroRNA als nieuwe niet-invasieve biomarkers voor de vroege detectie van Gastric Cancer