PLoS ONE: fermentierter Milch von Propionibacterium freudenreichil induziert Apoptose von HGT-1 Human Magenkrebs Cells

Abstrakt

Hintergrund

Magenkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen in der Welt. Die "wirtschaftlich entwickelten Länder" Lebensstil, einschließlich Ernährung, stellt einen Risikofaktor dieser Krebs begünstigen. Diät-Modulation kann Verdauungs Inzidenz von Krebserkrankungen senken. Unter viel versprechende Lebensmittelkomponenten wurden Milch Propionibakterien gezeigt Apoptose von humanen Kolon-Krebszellen auslösen, über die Freisetzung von kurzkettigen Fettsäuren Acetat und Propionat.

Methodik /wesentlichen Ergebnisse

Eine fermentierte Milch exklusiv von P vergoren. freudenreichil
wurde vor kurzem entwickelt. In dieser Arbeit wurde die pro-apoptotische Potential dieser neuen fermentierte Milch auf HGT-1 menschlichen Magenkrebszellen nachgewiesen. Sauermilchüberstand typischen Merkmale der Apoptose einschließlich Chromatin-Kondensation, die Bildung von apoptotischen Körpern, DNA laddering, Zellzyklusarrest und Entstehung einer subG1 Bevölkerung, Phosphatidylserin an der Plasmamembran äußere Seite, reaktive Sauerstoffspezies Akkumulation der mitochondrialen Transmembranpotentials Störung induzierte Caspase Aktivierung und Freisetzung von Cytochrom c. Bemerkenswert ist, enthält diese neue fermentierte Milch P. freudenreichil
erhöhte die Zytotoxizität von Camptothecin, ein Medikament im Magen-Krebs-Chemotherapie verwendet.

Schlussfolgerungen /Bedeutung

Diese neuen probiotischen fermentierter Milch somit als Teil einer präventiven Ernährung nützlich sein können, entwickelt, um verhindern Magenkrebs und /oder als Nahrungsergänzungsmittel zur Krebstherapie Behandlungen potenzieren

Citation:. Cousin FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, Jan G (2012) Milch von Propionibacterium freudenreichil
induziert Apoptose von HGT-1 menschlichen Magenkrebszellen. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10.1371 /journal.pone.0031892

Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 15. November 2011; Akzeptiert: 19. Januar 2012 um; Veröffentlicht: 19. März 2012

Copyright: © 2012 Cousin et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit von Conseil Régional de Bretagne durch die CBB développement Aufruf wurde für Projekte für Projekte und vom Centre national interprofessionnel de l'Economie Laitière (CNIEL) durch die vom Wissenschaftlichen Ausschuss der Syndifrais Anruf finanziert. Forschung in der IRSET Gruppe wurde durch Zuschüsse aus der Ligue Nationale Contre le Cancer (der Côte d'Armor, Ille-et-Vilaine, Morbihan, Vendée und Sarthe Gremien), INSERM, Universität Rennes 1 und der Region Bretagne unterstützt. FJC erhielt einen Zuschuss von CNIEL (Promotionsstipendium). SJL wurde von der Vereinigung la Recherche sur le Cancer (Promotionsstipendium) gießen unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Diät moduliert das Risiko von Magenkrebs
der Entwicklung

Krebs ist die häufigste Todesursache in den wirtschaftlich entwickelten Ländern aufgrund von Krebs-assoziierten Lebensstil Wahlen wie Rauchen, Bewegungsmangel, und "verwestlicht" Diät [ ,,,0],1]. Tatsächlich ist die Rolle der Ernährung bei der Krebsentwicklung stark von epidemiologischen Studien unterstützt, insbesondere im Hinblick auf Krebserkrankungen des Verdauungstraktes. Magenkrebs (GC) stellt die dritte Art von tödlichen Krebserkrankungen bei Männern in der Welt. Im Jahr 2008 wurden 640,600 Fälle von GC geschätzt, was 464,400 Todesfälle weltweit [1]. Diese Krankheit ist besonders häufig in Ost-Asien und in Mittel- und Osteuropa. Die wichtigsten Ursachen für Magen-Krebsentstehung beteiligt sind Ernährung und Helicobacter pylori
Infektion. Erhebliche Beweise, vor allem aus Fall-Kontroll-Studien, legt nahe, dass das Risiko der GC durch hohe Aufnahme von gesalzen, gebeizt oder geräuchert traditionell Lebensmittel erhöht wird, sowie getrocknete Fisch und Fleisch. Im Gegenteil, Fasern, frischem Gemüse und Obst, vielleicht aufgrund ihrer Vitamin C-Gehalt, wurden gefunden invers mit Risiko GC [2] zugeordnet werden, [3]. [6] - Die Auswirkungen von Natur /Lebensmittelbestandteilen auf die Karzinogenese des Magens hat damit in den letzten Jahrzehnten [4] untersucht worden. Unter diesen Probiotika und ihre Fähigkeit, die Entwicklung von Krebs zu hemmen zogen wissenschaftlichem Interesse [7], [8]. Probiotische wird im Allgemeinen als "ein lebender Mikroorganismus, der, wenn in ausreichender Menge verabreicht wird, einen gesundheitlichen Nutzen zu dem Host überträgt" definiert [9]. Während einige Mikroorganismen wie H. pylori
GC begünstigen können, können andere haben eine positive Wirkung durch Verdauungskrebserkrankungen zu verhindern. Insbesondere ausgewählten Stämme probiotischer Bakterien können die Entwicklung von Krebs in Tiermodellen der Karzinogenese [10] begrenzen. Dies wurde besonders für Darmkrebs nachgewiesen, während weniger auf die möglichen Auswirkungen von Probiotika auf GC bekannt ist. Eine mögliche mechanistische Erklärung für eine solche Schutzwirkung ist die in situ
Freisetzung von anti-karzinogene Stoffwechselprodukte wie kurzkettige Fettsäuren (SCFAs).

kurzkettigen Fettsäuren Apoptose von Krebszellen induzieren

SCFA, einschließlich Acetat, propionat und Butyrat, sind wichtige Anionen des Darminhaltes und ihre Konzentration kann durch die Ernährung moduliert werden. Sie waren eine Schlüsselrolle in wichtigen physiologischen Funktionen einschließlich Modulation des Verdauungs Epithelzellen-Proliferation /Apoptose Gleichgewicht zu spielen gezeigt. Dies beinhaltet SCFA-vermittelten Zellzyklusarrest, Hemmung Histon-Deacetylase und Apoptose Stimulation in transformierten Zellen, sondern auch die Stimulation der Differenzierung in gesunden Zellen [11], [12]. [15] - hat es auch, dass die SCFAs Butyrat und Propionat sowohl induzieren Apoptose in menschlichen Magenkarzinomzelllinien [13] berichtet. Die Apoptose ist ein natürlicher physiologischer Prozess ermöglicht Zellzahl Regulierung und stellt ein Ziel für Anti-Krebs-Chemotherapie [16]. Apoptosis ermöglicht Erschöpfung von Krebszellen in eine "saubere" Art und Weise. Krebszellen Fragment in einer koordinierten Kettenreaktion und die Rückstände werden von benachbarten Geweben und Immunsystem absorbiert [17], [18]. Zwei Haupt apoptotischen Wege sind beschrieben worden: den extrinsischen Weg, die durch Aktivierung von Todesrezeptoren und Caspase 8 und den intrinsischen Weg vermittelt wird, in der Mitochondrien und Caspase 9 involviert sind [16]. Im allgemeinen wird in Krebszellen, die apoptotische Funktion fehlt, die ihre anhalt Proliferation erklären kann und damit die Bildung von Tumoren. Die Fähigkeit, die Apoptose von Krebszellen zu induzieren, ist somit für das therapeutische Potenzial erkannt [16]. Da Milch Propionibakterien vorteilhaft pro-apoptotische SCFA produzieren können, können sie nützlich bei der Krebsprävention oder Behandlung beweisen.

Propionibacterium freudenreichil
können apoptotische Depletion von Verdauungskrebszellen begünstigen

Diese probiotischen Milch Propionibacterium wurde durch Apoptose-Induktion, in Co-Kulturen [19] Zelltod von verschiedenen menschlichen Zell Kolonkrebs Linien gezeigt zu induzieren. Die Wirkstoffe, in das Medium sezerniert wird, lösen die intrinsische mitochondrialen Apoptoseweg in kultivierten humanen colorektalen Krebszellen. Insbesondere Acetat die SCFA und Propionate von P freigegeben. freudenreichil
Apoptose induzieren, indem Sie auf die mitochondriale Adeninnukleotid Translokator wirkt, wodurch Mitochondrien Depolarisation und Permeabilisierung, Leckage von Cytochrom c und Caspase-Aktivierung [19], [20]. Jedoch sind propionibacterial Überständen noch mehr pro-apoptotischen als die SCFAs Acetat und Propionat, bei den Konzentrationen in den Überständen gemessen wurde, was darauf hindeutet, dass andere Verbindungen in dieser Effekt beteiligt sein können. Ausgewählte Stämme von P. freudenreichil
bleiben leben und metabolisch aktiv im Darm von Menschen und der menschlichen Mikrobiota-assoziierten Ratten, wo sie SCFA erzeugen [21], [22]. Dementsprechend wurden sie gezeigt Apoptose in transformierten Kolon-Epithelzellen von solchen Ratten, die mit dem Karzinogen 1,2-Dimethylhydrazin (DMH) zugeführt zu erhöhen, aber nicht in Kontroll gesunden [23]. Propionibacteria könnte Probiotika Begünstigung Darmkrebs Prophylaxe darstellen, sofern sie ihr Ziel am Leben und metabolisch aktiv erreichen. In diesem Zusammenhang ist der Vektor oder probiotischen Abgabevehikels wurde gezeigt Propionibakterien Überleben und die Aktivität [21], [24], [25] bestimmen. Komplex Milchprodukte wie Joghurt und Käse, insbesondere schützen Propionibakterien von Stress, sondern eine komplexe Mischung von Bakterien enthalten. Es ist daher nicht möglich, die positive Wirkung auf eine bestimmte Belastung zuzuschreiben.

A fermentierter Milch als Propionibakterien Lieferfahrzeug bewertet wurde in diesem Zusammenhang

In dieser Studie verwendeten wir eine neue Lebensmittelqualität fermentierte Milch nur P enthält. freudenreichil
als einziger Mikroflora. Da dieses Produkt sowohl Live Propionibakterien und deren aktiven Metaboliten enthält, sollten sie sie in Kontakt mit der Magenschleimhaut zu bringen, wenn sie eingenommen. Diese fermentierte Milch wurde in Bezug auf HGT-1 menschlichen Magenkrebszellen Apoptose-Induktion untersucht. Tatsächlich sind bekannt Propionibakterien humanen Kolon-Krebszellen zu töten, aber ihre Wirkung auf die Magenkrebszellen ist unbekannt. Die fermentierte Milch getötet HGT-1-Zellen in einer zeit- und dosisabhängigen Weise. Typische Merkmale der Apoptose-Prozess beobachtet wurden, einschließlich Lebensfähigkeit Abfall, Chromatin-Kondensation, apoptotische Körper 'Bildung, DNA laddering, ROS-Produktion, mitochondriale Membranpotential Störung, Caspase-Aktivierung, Zellzyklusarrest und Entstehung einer subG1 Bevölkerung.

Ergebnisse |

P. freudenreichil
fermentierter Milch tötet menschlichen Magen-und Darmkrebs-Zellen

P. freudenreichil
ITG P9 wurde in 72 h bei 30 ° C in ergänzten Milch und Milch ergänzt Ultrafiltrat letzte Population von 9,43 log zu erreichen _{10 koloniebildenden Einheiten (KBE) /ml und 9,35 log 10 cfu /ml. Die SCFA-Konzentrationen waren 26,21 mM Acetat und 54,47 mM propionat (2,08 propionate /Acetat-Verhältnis) in der überstehenden Flüssigkeit Milch fermentiert während sie 24,00 mM und 53,32 mM waren (2,22-Verhältnis) in der fermentierten Milch Ultrafiltrat Überstand. Diese Verhältnisse wurden für Propionibakterien erwartet, die im Allgemeinen doppelt so viel propionat als Acetat erzeugen [26]. Zwölf weitere Lebensmittelqualität Milch Propionibakterien Stämme wurden ebenfalls getestet (siehe Tabelle S1 und Abbildung S1). Unter Verwendung dieser Stämme wurden zwölf fermentierte Milch erhalten. Propionate Konzentrationen reichten von 36 bis 67 mM und Propionibakterien Populationen von 9,0 bis 9,7 log 10 KBE /ml, für die weniger und für die effizienteste Belastung dar.}

Die zytotoxische Potenzial von Überständen aus Milch hergestellt wurden oder Milch Ultrafiltrat, die beide von P vergoren. freudenreichil
ITG P9, wurde untersucht. HT-29 humanen Kolon-Krebszellen und HGT-1 menschlichen Magenkrebszellen wurden mit diesen Überstand behandelt. Verschiedenen Verdünnungen im Bereich von ½ bis getestet. Darüber hinaus wurde die Zytotoxizität von einer Mischung aus 15 mM Acetat und 30 mM Propionat getestet bei Konzentrationen der Nähe dieser ½ verdünnten Überstände. Als positive Kontrollen der Apoptose-Induktion, die Chemotherapie-Medikamente Camptothecin (4 &mgr; M) und Etoposid (100 &mgr; M) wurden für HGT-1 und HT-29-Zellen verwendet wurden. Drei verschiedene Methoden des Zelltods Überwachung wurden verglichen. Wie in Abbildung S2 gezeigt, Methylenblau, MTT und Trypanblau-Ausschluss-Assays ergaben ähnliche Kinetik des Todes. Folglich wurde Methylenblau-Test in dieser Studie verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen beurteilen. Die nicht-fermentierten Milchprodukten (Milch oder Milch Ultrafiltrat) hatte keine Wirkung, weder auf HT-29, noch auf HGT-1 Zell-Lebensfähigkeit (Fig. 1 A, B). Der Überstand von Milch oder Milch Ultrafiltrat von P vergoren. freudenreichii
eine ähnliche Cytotoxizität in einer zeitabhängigen Weise in HT-29 und HGT-1-Zellen induziert wird, und nahe der Zytotoxizität durch Medikamente oder durch die Acetat /Propionat-Gemisch induziert. Halbmaximale Abtötung von HGT-1-Zellen erfolgte nach 24 h und 26 h nach der Behandlung mit der fermentierten Milch und Milch Ultrafiltrat Überständen vergorenen jeweils nach 17 h der Behandlung mit Camptothecin und nach 24 h der Behandlung mit SCFA Gemisch (Fig. S3) . Zusätzlich wurde die Cytotoxizität von fermentierten Milchprodukt Stände in HGT-1-Zellen dosisabhängig (Fig. 1C). Für jede Verdünnung getestet induzierte Abfall der HGT-1 Zell-Lebensfähigkeit durch die fermentierte Milch oder fermentierter Milch Ultrafiltrat war sehr ähnlich (1C &.. Fig S3). Deshalb sind die nächsten Schritte der Studie, die wir nur mit dem fermentierten Milch Ultrafiltrat Überstand durchgeführt. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Propionibakterien effizient humanen Kolon und Magenkrebszellen zu töten, zumindest teilweise über die Produktion von Propionat und Acetat (Abb. 1). Einige andere fermentierte Milch, die von verschiedenen Milch Propionibakterien Stämme fermentiert, zeigten ähnliche zytotoxische Wirkung auf Krebszellen (Tabelle S2). P. freudenreichil
ITG P9 wird für seine metabolische Aktivität in vivo
[22], die entsprechende fermentierter Milch bekannt wurde weiter untersucht.

P. freudenreichil
fermentierter Milch induziert typische Noten von Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen

Nucleus Morphologie der HGT-1 in Gegenwart inkubiert Zellen von P. freudenreichii
fermentierter Milch Ultrafiltrat wurde durch Fluoreszenzmikroskopie nach Hoechst 33342-Färbung (Fig. 2A) analysiert. Die Kernfluoreszenz von unbehandelten Zellen (Kontrolle) blieb während des Zeitverlaufs des Experiments mit blauen normalen Kerne (Zeitpunkt 0 h, Fig. 2Aa) unverändert. Während der Behandlung angezeigt HGT-1-Zellen, die kondensierten Chromatin und fragmentierte Kerne Eigenschaften von apoptotischen Kerne (Fig. 2Ab, c), gefolgt von dem Auftreten von apoptotischen Körpern bei 72 h (Fig. 2Ad). Inter-nukleosomalen DNA-Fragmentierung führt DNA laddering, ein typisches Zeichen von Apoptose [27], wurde auch während fermentierter Milch Ultrafiltrat Behandlung überwacht. DNA Fragmentierung wurde von 24 h der Behandlung mit fermentierter Milch Ultrafiltrat (Fig. 2B), und in geringerem Ausmaß mit Camptothecin (Fig. S3) beobachtet. DNA-Gehalt wurde ebenfalls mittels Durchflusszytometrie nach Propidiumiodid Markierung zur Untersuchung der Wirkung von fermentierten Milch Ultrafiltrat auf HGT-1-Zellzyklus-Verteilung (Abb. 2C) quantifiziert. Unbehandelte HGT-1-Zellen einen Zellzyklus-Verteilung dargestellt (Fig. 2Ca) ohne subG1 Phase, die während des Zeitverlaufs des Experiments unverändert blieb (Daten nicht gezeigt). Der Prozentsatz an Zellen in subG1 Phase, indikativ für einen apoptotischen Prozess, signifikant mit der Zeit während fermentierter Milch Ultrafiltrat-Behandlung (Fig. 2Cb, Cc, Cd) erhöht: 24 h (39,24 ± 4,87%), bei 48 Stunden (91,63 ± 0,28 %) und bei 72 h (94,79 ± 0,45%). Nach 48 h und 72 h der Behandlung waren alle Zellen in der subG1 Zellzyklusphase, was auf die vollständige Tod HGT-1-Zellen. Als Kontrolle von der inneren zur Bestätigung Apoptose-Induktion, phosphatdylserine Translokation Camptothecin ähnlich apoptotischen Kennzeichen in HGT-1-Zellen (Fig. S4).

induzierte zum äußeren Blatt der Plasmamembran durch Anfärben HGT- beurteilt 1-Zellen mit einer Kombination von Annexin V-FITC (AV) und 7-AAD, gefolgt von Durchflusszytometrie Fluoreszenzanalyse (Fig. 3). Unbehandelte Zellen (0 h) präsentiert einen hohen Anteil an lebenden Zellen (AV ^{- /7AAD -; 92%) und nur 5% der Zellen wurden mit Annexin V gefärbt (Abb. 3B). Diese Prozentsätze in unbehandelten Zellen bestimmt nicht während des Zeitverlaufs des Experiments geändert werden (Daten nicht gezeigt). Während der Behandlung der HGT-1-Zellen mit ½ verdünnten fermentierten Milch Ultrafiltrat in DMEMc der Prozentsatz der Zellen gefärbt nur durch 7-AAD (was anzeigt, Nekrose) war sehr gering (Fig. 3B). Jedoch erhöhten sich die Prozentsätze von Zellen, gefärbt mit Annexin V signifikant in einer zeitabhängigen Art und Weise und erreicht 80% bei 72 h (Fig. 3B). Daher unterzog HGT-1-Zellen Apoptose nach der Behandlung mit P. freudenreichil
Milch Ultrafiltrat fermentiert, indem man zuerst AV positive Färbung gekennzeichnet, Phosphatidylserin anzeigt, und dann beide AV und 7-AAD positive Färbung, eine spätere Verlust der Membranintegrität anzeigt. Als Kontrolle induzierte Camptothecin ähnlich apoptotischen Kennzeichen (Fig S5).}

als SCFA wirken direkt auf Mitochondrien wurden drei wichtige mitochondrialen Parameter ebenfalls bestimmt. Die ΔΨm innere Membranpotential, und die Erzeugung von ROS, unter Verwendung von zwei Fluoreszenzsonden, DiOC (6) 3 (die ΔΨm empfindlich) und DHE (die O _{2 erfasst ^{- Ebene) und die Lokalisierung von Cytochrom c. Unbehandelte Zellen (0 h) zeigten eine hohe Fluoreszenz (hohe ΔΨm) und eine niedrige DHE-Fluoreszenz (geringe Produktion von O 2 -) (Fig. 4A, B). Nach der Behandlung mit fermentierter Milch Ultrafiltrat, eine zeitabhängige Abnahme der Inkorporation von DiOC6 (3) wurde fluoreszierende Sonde beobachtet, was einen Verlust von ΔΨm und somit mitochondrialen Membrandepolarisation enthüllt (Fig. 4A). Die Prozentsätze von behandelten HGT-1-Zellen mit einer verringerten inneren Membranpotential in einer zeitabhängigen Weise erhöht 96% der Zellen bei 72 h zu erreichen. FCCP Behandlung wurde als eine positive Kontrolle der mitochondrialen Membran Depolarisation verwendet. Dieser Verlust an ΔΨm wurde durch den charakteristischen Verlust in roter Fluoreszenz folgenden JC-1-Färbung (Fig. 4B) bestätigt. In Bezug auf ROS-Produktion in HGT-1-Zellen, fermentierte Milch Ultrafiltrat Behandlung induzierte Anhäufung von O 2 -, deutlich nach 48 h und 72 h der Behandlung (4C.). Diese ROS Akkumulation kann teilweise, wenn die Zellen verhindert werden, werden durch die ROS-Scavenger TEMPOL vorbehandelt (Fig. S6). Cytochrome c-Freisetzung aus Mitochondrien in das Zytoplasma ist ein wichtiger Zellereignis des apoptotischen Programms. Immunoblotting Untersuchung der Zytoplasma-angereicherten Fraktionen auf die Anwesenheit von Cytochrom c bestätigte eine Änderung ihrer subzellulären Lokalisierung (Fig. 4D). Cytochrom c wurde in das Zytoplasma angereicherte Fraktion von 24 h der Behandlung, was darauf hinweist Verlagerung dieses Proteins (Fig. 4D) nachgewiesen. Diese Relokalisation von Cytochrom c in das Zytoplasma wurde durch Immunfärbung bestätigt, diffuse Immunfärbung in der Zelle nach der Behandlung zeigt, während punktierten Färbung vor der Behandlung (Abb. 4E).}}

P. freudenreichil
fermentierter Milch aktiviert Caspasen

die apoptotische Mechanismen von fermentierten Milch Ultrafiltrat in HGT-1-Zellen, die Verarbeitung von Caspasen 3, 8 und 9 wurde durch Western-Blot und entsprechende Enzymaktivitäten Überwachung in HGT analysiert induziert Um zu bestätigen, -1-Zellextrakten (Fig. 5). Die nicht-fermentierte Milch Ultrafiltrat nicht Caspase-Aktivierung in HGT-1-Zellen induzieren: nur die proforms von Caspase-3 und -9 wurden auf Western-Blot nachgewiesen (Abb. 5A) und keine Caspase-Aktivität wurde gemessen (Abb. 5B). Die fermentierte Milch Ultrafiltrat Überstand sowie das Camptothecin oder der Mischung aus Vinylpropionat und Vinylacetat in einem [2: 1] Molverhältnis, die Spaltung von pro-Caspase-3 und die Erzeugung der aktiven Formen von Caspase-3, die Untereinheiten induzierten p17 und p12 (Abb. 5A). Die Aktivierung von Caspase-3, die ein Effektor-Caspase, bestätigte die Apoptoseinduktion. Zusätzlich fermentierter Milch Ultrafiltrat Spaltung von Procaspase-9 induziert werden, die zu den 35 und 37 kDa verarbeiteten Formen. Caspase-8 wurde in unbehandelten Kontroll HGT-1-Zellen nicht erkannt. Die Behandlung mit propionibacterial Stände oder C2 /C3-Gemisch zu einer klaren Nachweis des 54 kDa Proform führte, gefolgt von der Spaltung nach 48 h Behandlung

Die Quantifizierung der Caspase-3, -8 und. - 9 enzymatischen Aktivitäten bestätigt Caspase-Aktivierung von beiden propionibacterial Metaboliten und von Camptothecin. Tatsächlich Caspasen-9 und -3 wurden in den frühesten Stadien der Behandlung aktiviert wird, während der Caspase-8 später aktiviert schien (Fig. 5B). Camptothecin und die SCFA Mischung aktiviert, um die alle drei untersuchten Caspasen. Diese Daten bestätigten die Aktivierung des intrinsischen Wegs der Apoptose durch fermentierte Milch Ultrafiltrat Behandlung mit einer frühen Aktivierung von Caspase-9 und dann von Caspase-3 und -8.

P. freudenreichil
fermentierter Milch erhöht Camptothecin Zytotoxizität

Campthotecin ein Chinolin Alkaloid zytotoxische ist, die das DNA-Enzym hemmt die Topoisomerase I (Topo I) und ist weit verbreitet in der chemotherapeutischen Behandlung von GC verwendet. Wir haben gezeigt, dass die oben propionibacterial Metaboliten Apoptose in HGT-1-Zellen über den mitochondrialen Tod Weg induzieren. Wir untersuchten weiter die Apoptose, induziert durch die Kombination beider Camptothecin und fermentierter Milch Ultrafiltrat in HGT-1-Zellen. Erhöhte Konzentrationen von Camptothecin (0, 0,25, 0,5, 1, 2 uM) in Kombination mit erhöhten Konzentrationen von fermentierter Milch Ultrafiltrat (0,, ⅛, ¼) wurden auf HGT-1 Zelllebensfähigkeit getestet und sowohl induzierten Verlust der HGT-1 Lebensfähigkeit , in einer dosisabhängigen Weise (Fig. 6). Darüber hinaus verbesserte die Zugabe von fermentierten Milch Ultrafiltrat signifikant die Zytotoxizität von Camptothecin in HGT-1-Zellen (Fig. 6). Beispielsweise 0,25 uM Camptothecin und fermentierter Milch Ultrafiltrat verdünnt auf eine Lebensfähigkeit Verlust von 8,6% bzw. 18,6%, bzw. führten zu ⅛. Die Kombination dieser beiden Verbindungen führte zu einer Zellebensfähigkeit Verlust von 29,8% (Fig. 6), was auf eine zusätzliche Zytotoxizität wirksam, wenn Camptothecin mit fermentierter Milch Ultrafiltrat in HGT-1-Zellen vereinigt. Dementsprechend wird der Kombinationsindex (CI), berechnet wie vorstehend [28] einen Wert von 1, eine additive Wirkung von Camptothecin und fermentierter Milch Ultrafiltrat Behandlungen anzeigt.

Discussion

Eine neue fermentierte Milch, mit P. freudenreichil
als einziges Bakterium, wurde entwickelt, um weiter die probiotischen Potenzial dieser Milch Herstellung von Propionibakterien (beschrieben in [29]) zu untersuchen. In dieser Studie berichten wir, dass die wässrige Phase dieser fermentierten Milch tötet menschlichen Kolon und Magenkrebszellen über Metaboliten, einschließlich Propionat und Acetat, die von diesem Bakterium freigesetzt. Diese Vorstellung basiert auf den beobachteten cytotoxischen Wirkungen von P. freudenreichil
kultivierten HT-29 Milchstände vergoren und HGT-1 Krebszellen. Dieser Effekt wurde mit Ultrazentrifugation Überstand erhalten wird, d.h. der fermentierten Milch wässrige Phase, ohne Kaseine und von Bakterien, die zeigen, dass die Wirkstoffe sezerniert wird, wie zuvor für Propionibakterien beschrieben [19]. Aus diesem Grund wurden die meisten Experimente in dieser Arbeit mit fermentierter Milch Ultrafiltrat (Fig. 1) durchgeführt. Wir haben gezeigt, zum ersten Mal, dass P. freudenreichii
einer zeit- und dosisabhängigen Weise mit dem Auftreten der klassischen morphologischen und biochemischen Merkmale der Apoptose (kondensiert und fragmentierten Chromatierung, DNA-Laddering und Akkumulation von Zellen in Zellzyklus subG1 Milchüberstand induzierte Apoptose von HGT-1-Zellen fermentiert Phase).

Wir sahen dann, wenn die zellulären Mechanismen in HGT-1 Zelltod beteiligt an den mitochondrialen Tod Weg ähnlich waren ausgelöst in Caco-2 und HT-29 humanen Kolon-Krebszellen durch P. freudenreichii
DMEMc Kulturüberstand [19], [20]. Die subzellulärer und biochemischen Ereignisse in behandelten HGT-1-Zellen mit fermentierter Milch Ultrafiltrat beobachtet wurden, waren ähnlich und enthalten zumindest mitochondrialen ΔΨm Verlust, ROS (O _{2 ^{-) Generation, Caspasen Verarbeitung und Aktivierung, Cytochrom c Verlagerung in das Cytoplasma (Fig. 3, 4, 5). Fermentierte Milchüberstand induzierte Verarbeitung und die Aktivierung von Caspase-8, zusätzlich zu Caspasen -3 und -9. Außerdem zeigt 4A, dass Caspase-8 nicht in unbehandelten Kontrollzellen und in Zellen mit Camptothecin oder nicht fermentierte Milch Ultrafiltrat, im Einklang mit dem Fehlen seiner mRNA (C. Le Jossic-Corcos, Medizinische Fakultät, Brest behandelt erkannt wird , Frankreich, persönliche Mitteilung). Es sollte bemerkt werden, dass eine offensichtliche Diskrepanz zwischen enzymatischen Ergebnisse besteht, Caspase-8-Aktivität in Camptothecin-behandelten Zellen darauf hindeutet, während keine Caspase-8 in diesen Zellen mittels Western Blot nachgewiesen wird. Dies kann durch den Mangel an Spezifität der Ac-IETD-AMC Substrat erklärt werden, die durch andere Enzyme, wie beispielsweise Caspasen verarbeitet werden können -3 und -10 oder Granzym B, vor allem, wenn die Konzentration solcher Enzyme erhöht ist [30], [31]. Dagegen P. freudenreichii
Milch Ultrafiltrat fermentiert und die Mischung aus SCFA sowohl Expression und Aktivierung von Caspase-8 verursacht. Die Mechanismen hier beteiligt sind, nicht aufgeklärt; jedoch Caspase-8 ist bekannt, unter-exprimiert in einigen Krebszellen als Ergebnis der DNA-Methylierung zu sein [32], [33]. Seine Expression kann durch Demethylierungsagenzien wie decitabine [34] und HDAC-Inhibitoren [35], was zu Demethylierung der regulatorischen Sequenz von Caspase-8, eine Zunahme in Caspase-8-Promotor-Aktivität und in re auf RNA-und Proteinebene wieder hergestellt werden -Ausdruck von Caspase-8 [32]. SCFA, wie Propionat, sind HDAC-Inhibitoren, die zu Hyperacetylierung von Histonen [36]. Dies begünstigt die Transkription über eine Veränderung in der DNA-Konformation [37] und könnte die Caspase-8-Expression wiederherzustellen. Andere Lebensmittel geborene Verbindungen wurden bereits gezeigt, Caspase-8-Expression wiederherzustellen. Ein injizierbares Extrakt von Semen Coicis
(ein Verwandter von Mais) Extrakt Anzeigen Anti-Tumor-Aktivität die Expression von Caspase verbessert 8 und induziert Apoptose in HepG2-Zellen [38]. Diallyldisulfid, in Knoblauch gefunden, verbessert die Expression von Caspase-8, Fas und FasL in Leukämie K562-Zellen. Eine solche Regelung kann daher in den pro-apoptotische Wirkung von Milch Propionibakterien und fermentierter Produkte, die sie einbezogen werden. Western-Blotting nachgewiesen Expression wiederhergestellt und dann späten Aktivierung von Caspase-8 in propionibacterial Metaboliten behandelten HGT-1-Zellen, die als Ergebnis der Caspase-8-Aktivierung durch eine andere Caspase wie Caspase-9 auftreten kann. Tatsächlich Ausgang von Cytochrom c, ein Teil des mitochondrialen Wegs, wurde 3 mehrere Caspasen darunter 2, zu aktivieren gezeigt, 6, 7, 8 und 10 [39]. Des Weiteren wurde die Caspase-9-Aktivierung Ergebnis in Down-Stream-Caspase-8-Aktivierung gezeigt [40]. Dementsprechend Caspase-9 wurde gezeigt in vitro zu aktivieren
Caspase-3, die in Windungen Caspase-6, die für Caspase-8-Aktivierung aktiviert [41]. Insgesamt unsere Ergebnisse bestätigen, dass propionibacterial Metaboliten in P. freudenreichii
fermentierter Milch mehrere subzellulären Mechanismen der Apoptose induzieren begünstigen. Eine solche Reaktivierung von Caspase-8-Expression könnte zu einer großen apoptotische Reaktion führen in HGT-1 behandelten Zellen mit toten Domäne-Rezeptoren Agonisten (zB Trail oder Fas).}}

Nach unserem Wissen ist dies die erste Arbeit spezifische Berichterstattung Induktion von Magenkrebs Zell-Apoptose durch eine fermentierte Milchprodukt. Fermentierten Milchsorten, einschließlich Joghurt, wurden vorgeschlagen in der Prävention von Darmkrebs nützlich sein. Epidemiologische Daten über die schützende Wirkung von Milch und Milchprodukten auf Darmkrebs Rate gab widersprüchliche Ergebnisse [42]. Milch und Milchprodukte Gesamtverbrauch wird mit einer Verringerung der Darmkrebs-Risiko verbunden. Aber das ist nicht wahr für alle Arten von Milchprodukten und Auswirkungen sehr unterschiedlich sein. Fermentierte Milchprodukte können effiziente Lieferfahrzeuge dar Schutz Moleküle oder Mikroorganismen zu spezifischen Stellen wie das Verdauungs Epithel Ziel [43]. Rinder-Lactoferrin, ein Bestandteil der Milch, induziert Apoptose von Dick [44] und Magen [45] Krebszellen. Ausgewählte Stämme von Mikroorganismen, die in fermentierter Milch kann auch Kolonkarzinogenese entgegenzuwirken. Dementsprechend, Joghurt und Milchsäurebakterien, anti-Krebs-Eigenschaften in Tiermodellen von Kolon-Karzinogenese gezeigt [46]. Allerdings gibt es wenig Arbeit konzentrierte sich auf fermentierte Milchprodukte und Magenkrebs. Unsere Arbeit legt nahe, dass P. freudenreichil
könnte eine Rolle spielen in diesem Zusammenhang, da sie sowohl live als Propionibakterien liefern würde und pro-apoptotische Metaboliten auf die Magenschleimhaut. In diesem Zusammenhang ist zu beachten, dass P. freudenreichil
haftet Epithelzellen Verdauungs-und Schleim [47], [48]. Es wurde auch Epithelzellen zu Verdauungs sowie H zu hemmen Haftung des Erregers von Magenkrebs Helicobacter pylori
gezeigt. pylori
-induzierte Schäden [49]. Diese Eigenschaften deuten auf eine Rolle von P. freudenreichil
Milch in der Prophylaxe von Magenkrebs vergoren.

Schließlich unsere fermentierter Milch potentialisiert die pro-apoptotische Wirkung des Arzneimittels Camptothecin auf die Magenkrebszellen. Dementsprechend wurden lebende Kulturen von probiotischen Lactobacilli zuvor gezeigt LS513 kolorektalen Krebszellen zu 5-fluorouracyl [50] sensibilisieren. Aber in diesem Fall mußten die Probiotika allein keine proapoptotischen Effekt. In dieser Arbeit, Camptothecin niedrige Dosen des Medikaments im Magen-Krebs-Chemotherapie verwendet wurden, waren ineffizient bei Magenkrebszellen zu töten. Jedoch in Gegenwart von niedrigen Dosen von P. freudenreichil
fermentierter Milch, sie die gleichen Zellen effizient (Abb. 6) getötet. Propionibacterial Metaboliten, die die intrinsische Apoptose induzieren Weg durch direkt auf die Mitochondrien wirkt, während Camptothecin auf DNA-Ebene wirkt. Dies steht im Einklang mit ihren kumulativen Potential in Apoptose-Induktion, wenn diese pro-apoptotische Induktoren kombiniert werden. Darüber hinaus kann die fermentierte Milch enthält SFCAs, bekannt als HDAC-Inhibitoren können Apoptose und Zellzyklus in Magenkrebszellen zu modulieren, [13], [51] sowie der Expression von Zellzyklus bezogen und apoptotischen Proteinen in anderen Krebszellen [52], [53]. Probiotika wurden bereits in klinischen Studien verwendet, um die Nebenwirkungen der Krebschemotherapie [54] zu reduzieren. P. freudenreichii
kann nach unseren Ergebnissen in solchen klinischen Studien verwendet werden. Die synergistische Wirkung kann helfen, die Medikamentendosis und verbessern den Komfort der Patienten zu senken.

Abschließend eine neue Milch, ausschließlich fermentiert von P. freudenreichil
, induzierte Apoptose in HGT-1 menschlichen Magenkrebszellen. Darüber hinaus erweitert diese fermentierter Milch, die Camptothecin Zytotoxizität Aktivität, Drogen im Magen-Krebs-Chemotherapie verwendet. Solche neuen probiotischen fermentierter Milch könnte von Interesse sein als ein funktionelles Lebensmittel Magenkrebs und /oder zu potenzieren therapeutischen Behandlungen zu verhindern.

Materialien und Methoden

Chemikalien

Camptothecin, Etoposid Propionat, TEMPOL, Acetat und Natriumsalze, und Caspase-Substrate Ac-DEVD-AMC (N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-methylcumarin), Ac-IETD-AMC (N-Acetyl-Ile -Glu-Thr-Asp-7-Amido-4-methylcumarin) und Ac-LEHD-AFC (N-Acetyl-Leu-Glu-His-Asp-7-amido-4-trifluormethylcoumarin) wurden von Sigma-Aldrich (St. gekauft -Quentin Fallavier, Frankreich). Camptothecin wurde in DMSO gelöst. Die Endkonzentration von DMSO überschritt nicht 0,01%, eine Konzentration, die keine Toxizität nicht induzierte. RNAse A, PI (Propidiumiodid), Hoechst H33342, MitoTracker® Red CMXRos, TO-PRO-3, JC-1, 3,3'-dihexyloxacarbocyanine Iodid (DiOC6 (3)) und Dihydroethidium (DHE) wurden von der Firma Invitrogen ( Cergy-Pontoise, Frankreich). Annexin V-FITC (AV) Kit und 7-Aminoactinomycin-D (7-AAD) -Lösung wurden von BD Biosciences (Pont-de-Claix, Frankreich) zur Verfügung gestellt.

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