PLoS ONE: HIF-1α Skatina naviko atsparumą daugeliui skrandžio vėžio ląsteles, sukeldami MIR-27a

Anotacija

Šis tyrimas, kurio tikslas nustatyti tarp HIF-1α ir Pasaulis-27a saviraiškos ir įvertinti slopinimu HIF-1α raiškos poveikį Pasaulis-27a saviraiškos ir atsparumas vaistams skrandžio vėžiu (koreliacijos GC). Šioje studijoje, realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė buvo atliekama siekiant aptikti HIF-1α išraišką GC audinių ir ląstelių linijų. Tada OCUM-2MD3 /L-OHP ląstelės buvo pernešta su HIF-1α-siRNA A Pasaulis-27a mėgdžioti ar pcDNR-HIF-1α ir ląstelių išlikimas buvo nustatytas per MTT. Iš HIF-1α, PPN-27a ir MDR susijusių genų ekspresija buvo matuojamas naudojant realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė. Lusto ir dviejų liuciferazės veiklos tyrimai buvo atlikti siekiant įvertinti transkripcijos reguliavimo HIF-1α ir miR-27a. Tyrimo rezultatai atskleidė, kad transfekcija su HIF-1α-siRNA ženkliai sumažino PPN-27a lygį, todėl žymiai sustiprintas slopina proliferaciją norma OCUM-2MD3 /L OHP ląsteles. Palyginti su ne perkeltų ląstelių išgyvenamumas buvo žymiai sumažino ląstelėse transfektuotose HIF-1α-siRNA po gydymo L-OHP. Ląstelių išgyvenamumas buvo žymiai padidėjo OCUM-2MD3 /L OHP ląstelėse, transfektuotose Mir-27a Mimic, o HIF-1α raiškos nesukėlė jokios aiškios pokyčių ląstelės išlikimui. Dvejopo liuciferazė veiklos tyrimo rezultatai parodė, kad HIF-1α pagerina transkripcijos aktyvumą miR27a promotoriaus ląstelėse transfektuotose reporterio plazmidės sudėtyje yra tiekėjų promotoriaus regione miR27a kartu su pcDNR-HIF-1α. ChIP analizė parodė, kad HIF-1α tiesiogiai jungiasi prie promotoriaus regione miR27a. Slopinimas HIF-1α ar miR27a išraiška sumažėjo MDR1 /P-gp, LRP, ir BCL-2 išraišką OCUM-2MD3 /L OHP ląsteles. Taigi, mes nustatėme, kad HIF-1α yra glaudžiai susijęs su MDR GC ir HIF-1α gali slopinti MDR1 /P-gp, LRP ir BCL-2 raiška slopindamas Pasaulis-27a išraišką

Citation:. Zhao Klausimas Li Y Tan Bb, ventiliatorius Lq Yang psl Tian Y (2015) HIF-1α Skatina naviko atsparumą daugeliui skrandžio vėžio ląsteles, sukeldami MIR-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. Doi: 10,1371 /journal.pone.0132746

redaktorius: Jin K. Cheng H.Lee Moffitt Vėžys centras "& Tyrimų institutas, JAV

Įstojo: sausio 5, 2015; Priėmė: Gegužės 17, 2015 m Paskelbta rugpjūčio 20, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Zhao et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. Šis darbas buvo remiamas pagal šią dotaciją. provincijos Gamtos mokslo fondas Hebei provincijoje (Nr H2013206311 į Qun Zhao)

konkuruojančių interesų. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra viena iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų, todėl didelę žalą visame pasaulyje [1, 2] Po metų technologinė pažanga diagnozuojant ir gydant GC, jos dažnis ir mirtingumas sumažėjo visame pasaulyje, bet lieka daug Azijos šalių [3, 4]. Šiuo metu, skrandžio rezekcija yra tik su laisvomis gydymo metodas GC. Tačiau, ji yra sunku pasiekti užbaigtą išgydyti nepaisant chirurginio pašalinimo naviko, nes dauguma pacientų kenčia nuo pažangiosios GC ant Diagnosis [5, 6]. Todėl, chemoterapija vaidina labai svarbų vaidmenį kompleksinio gydymo GC. Nors chemoterapija smarkiai progresavo atžvilgiu pažangių GC gydymo [7, 8] GC prognozė išlieka nepakankamas, su 5 metų išgyvenamumas yra mažesnis nei 30% [9]. Ši prognozė yra pirmiausia dėl naviko atsparumą daugeliui vaistų (MDR) GC ląsteles. MDR į GC dažnai veda prie chemoterapijos [10-12] sutrikimas. Todėl yra būtina kuo skubiau sukurti naujų perspektyvių gydymo strategijas, efektyviai sumažinti MDR GC.

Deguonies trūkumas yra paplitę solidinių navikų ir yra susijęs su biologinių funkcijų įvairovė. Šiuo metu hipoksija-indukuojamąją faktorius (HIF) -1α laikomas glaudžiai susijęs su hipoksija. HIF-1α stipriai išreikšta piktybinių navikų [13, 14] ir veikia kaip esminio veiksnio įvairių reguliuoti vėžinių ląstelių prisitaikyti prie hipoksijos [15]. HIF-1α buvo pasiūlyta būti glaudžiai susijęs su GC MDR [16, 17]. Tačiau neaišku, kuris kelias tarpininkauja su HIF-1α GC MDR vaidmenį.

pastaraisiais metais, mikro RNR vaidmuo (miRNAs) į vėžio tapo plačiai ištirtas mechanizmas naviko inicijavimo ir gydymas. Pasaulis-27a, priklausanti Mirna šeimos narys, buvo įrodyta, kad įtakos GC MDR [18]. Be to, miR-27a išraiška yra didėjo hipoksinio aplinkai [19]. Šie rezultatai rodo, kad HIF-1α gali reguliuoti PPN-27a išraišką ir įtaką GC MDR. Tačiau konkrečios reguliavimo mechanizmai dar reikia išsiaiškinti. Šis tyrimas parodė, kad HIF-1α ir miR-27a išraiška buvo gerokai iki reguliuojama GC audinių ir ląstelių linijų, ypač atsparių ląstelių linijų.

transfekcijq su konkrečiu sirnr blokuoti endogeninio HIF -1α lėmė per Pasaulis-27a išraiškos mažinimą ir MDR mažinimui GC ląstelių linijų. Šie nauji duomenys rodo, kad slopinimas HIF-1α išraiškos slopina MDR susijusių genų transkripciją MDR1 /P-glikoproteino, LRP, ir BCL-2 sušvelninti MDR GC ląstelių represuoti Pasaulis-27a išraiška.

medžiagos ir metodai

1.1 medžiagos

Skrandžio ląstelių linija OCUM-2MD3 buvo profesoriaus Marcus Yashiro Japonijoje Oitos medicinos chirurgijos [20]. Stabili vaistams atsparių ląstelių linija OCUM-2MD3 /L OHP2 buvo gautas per auginti ir atrankos mūsų mokslinių tyrimų grupės. GSE-1 ląstelių linija buvo įsigyta iš Cell išteklių centro Šanchajaus institutai Biologijos mokslų Kinijos mokslų akademija. RPMI 1640 mitybinė terpė ir tripsino buvo įsigytas iš Gibco Company; Trizol reagentas ir Lipofectamine 2000 transfekcija reagentas buvo įsigytas iš Invitrogen. Atvirkštinės transkripcijos rinkinys ir fluorescencijos kiekybine PGR reagentai buvo gauti iš Promega Corporation. PCR pradmenys ir sirnr susintetinti Šanchajus biologinės inžinerijos Company. Baltymų gavybos rinkinys buvo gauta iš Beyotime įmonė, Kinija. Pirminiai antikūnai prieš HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, BCL-2 TS arba GAPDH buvo įsigytas iš Santa Cruz. MTT buvo gauta iš Sigma. Mūsų tyrimas patvirtino etikos komiteto ketvirtosios filialas ligoninės Hebei medicinos universitete.

1,2 klinikinio mėginio paruošimas

Visi 65 pacientai, sergantys GC buvo atrinkti po skrandžio rezekcijos ir patologinės patvirtinimo ketvirtoje Ligoninių Hebei medicinos universiteto, įskaitant 42 vyrų ir 23 moterų amžiaus 60,5 ± 8,1 metų, kurie negavo priešoperacinė radioterapija arba chemoterapija. Vėžio ir para-karcinomos audiniai (maždaug 1,0 cm x 0,5 cm x 0,5 cm) buvo paimti iš kiekvienam pacientui, ir mėginiai buvo greitai užšaldomos skystame azoto, ir toliau perduota -80 ℃ išsaugojimui. Visi dalyviai pasirašė informuoto sutikimo.

1,3 Ląstelių kultūros ir transfekcija

OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L OHP ir GSE-1 ląstelių linijos buvo auginamos RPMI 1640 terpė papildyta 10% vaisiaus jaučio serumo (FBS), 100V, /ml penicilino ir 100 mg /ml streptomicino. Pažymėtina, kad iš OCUM-2MD3 /L-OHP ląstelių terpė buvo elgiamasi su L-OHP esant 75 g /mL koncentracijos išlaikyti savo narkotikų atsparumo fenotipas, vieną savaitę prieš operaciją nutraukti gydymą. Ląstelės buvo inkubuojami temperatūroje drėgnoje 5% CO _{2 atmosferoje esant 37 ° C}

Trys HIF-1α-siRNA sekos buvo sukurta, naudojant blokuoti-it RNRi dizaineris (seką 1:. GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; seką 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; seka 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), iš kurių kiekvienas buvo hibridizuoti su atitinkamais jų komplementaria seka ir transfekuota atitinkamai į OCUM-2 MD3 /l-OHP GC ląstelių. Nespecifinis siRNR seka (NS-siRNR: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. MiR27a mimezinis seka buvo 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 '. Žmogaus pilnametražis HIF-1α coden seka buvo subklonuotas į pcDNA3.1 vektorių. pGL3-miR27a-Luc, pcDNR-HIF-1α, pGL3-Basic ir PRL-TK plazmidės buvo pastatyti ir užkonservuoti mūsų laboratorijoje.

GC ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse 24 val prieš transfekciją ne iš 4 × 10 ^{5 ląstelių /ml tankio. Plazmidiniai vektoriai, siRNR arba miR27a mimikos buvo pernešta į GC ląstelių arba vaistams atsparių ląstelių naudojančių transfekcijq reagento Lipofectamine pagal gamintojo instrukcijas. Tada, ląstelės buvo išplauti su antibiotikų be serumo RPMI 1640 trūksta. Transfekcija efektyvumas buvo matuojamas 24 val vėliau, po iš ankstesnių eksperimentų.}

1,4 MTT

GC audiniai ir normalus para-karcinoma audinių buvo homogenizuoti paruošti vieno elemento suspensijos, filtruojant per 300 -mesh vario tinklelis. GC ląstelės suardomas naudojant 0,02% EDTA 0,25% tripsino buvo pasėjamos esant tankiui 5 × 10 ^{4 ląstelių /ml 96 duobučių plokšteles. Po to, kai ląstelės pasiekė apie 60% santaką, HIF-1α-siRNR buvo transfekuota arba buvo taikomas chemoterapinis vaistas (150μg /ml L-plėvelės keletą). Kiekviena grupė sudarė šešios šulinių. Tada, 20μl 5 mg /ml MTT buvo pridėta 4 h iki eksperimento pabaigoje. Ląstelės buvo kultivuojamos 4 h, ir tada, kultūrinė terpė buvo išmesti. Kitą, 150μl iš DMSO buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį, ir optinio tankio vertės buvo matuojamas esant 490 nm bangos ilgiui, naudojant mikroplokštelės skaitytuvą po Plokštelė purtant 15 min kambario temperatūroje. Eksperimentai buvo pakartoti tris kartus.}

1,5 RNR išskyrimas ir kiekybinė RT-PGR

bendra RNR buvo išskirta naudojant Trizol vieno žingsnio metodą, ir 2μg RNR buvo naudojamas atvirkštinės transkripcijos generuoti šabloną cDNR. Santykiniai iRNR kiekis buvo nustatomas naudojant kiekybinio PGR, GAPDH tarnavo kaip vidinio etalono geno. PGR parametrai buvo šios: 95 ° C temperatūroje 5 min, po to 45 ciklų denatūruojant esant 94 ° C temperatūroje 30 s ir išdegimo esant 60 ° C temperatūroje 30 s. Grunto sekos buvo sukurta, naudojant Primer 5.0 ir buvo ieškoma specifika. Pradmenys sekos yra taip: HIF-1α (93 bp): (F) 5'-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 'ir (R) 5'-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3'; MDR1 (126 bp): (F) 5'-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 'ir (R) 5'-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3'; GST-π (151 bp): (F) 5'-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 'ir (R) 5'-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3'; BCL-2 (98 bp): (F) 5'-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 'ir (R) 5'-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3'; Lrp (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'ir (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; TS (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'ir (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; ir GAPDH (138bp): (F) 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 'ir (R) 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'. Kiekybiniai PGR rezultatai buvo apskaičiuoti naudojant 2 ^{-ΔΔCt metodas}

1.6 Vakarų dėmė

audinių ir ląstelių mėginiai buvo lizuoti naudojant Ripa lizės buferiniame tirpale. 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,2 mM Na3VO4, 0,2 mM fenilmetilsulfonilfluoridą fluorido, ir 0,5% NP-40. Lygiomis dalimis baltymų mėginių buvo atskirtas nuo 10% poliakrilamido SDS geliai (SDS-PAGE) ir buvo electrotransferred į polivinilidenfluorido (PVDF) membraną (Amersham Pharmacia Biotech). Membranos buvo blokuotos 5% BSA 2 h ir inkubuojami su pirminiais antikūnais per naktį 4 ° C temperatūroje. Membranos buvo inkubuojami 2 h A krienų peroksidazės-konjuguoto antrinio antikūno. Tikslinės grupės buvo aptikta naudojant sustiprintą chemiluminescencja (ECL) aptikimo rinkinį (Santa Cruz, JAV). β-aktino buvo naudojamas kaip endogeninio kontrolės geno. Eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.

1,7 Chromatino imunoprecipitacijos (ChIP) Analizės

Chip tyrimai buvo atliekami pagal metodą Wang et al., [21]. Ląstelės su skirtingais gydymo buvo nustatyti su 1% formaldehido už kambario temperatūroje 15 min, ir užbaigta, kad galutinė koncentracija 0,125 M glicino. Tada ląstelės buvo lizuoti naudojant 300μl lizės buferiniame tirpale (50 mmol Tris-HCl, pH 8,0, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoksicholatas, ir proteazių inhibitorių). Ląstelių Lizatai disperguotos ultragarso pagalba į ledo vandens vonioje, taip gaunant chromatino fragmentus apie 600 bp, vertinant pagal agarozės gelyje. Po to, kai centrifuguojant 13.000 rpm 10 min, supernatantq buvo paimti ir iš anksto-nulėkė už 15 min, esant 4 ° C per inkubacijos su 30μl baltymų A-Sepharose kraštų ir šlyties jėgos, lašišų spermatozoidų DNR. Po centrifugavimo metu 13.000 rpm 5 min, supernatantq buvo suskirstyti į tris lygias dalis: vieną įėjimo, o kitos dvi už Imunoprecipitacijos su arba be HIF-1α antikūnų. Kitą dieną, imuninis kompleksai išsodinami su A baltymą-Sepharose kraštų ir šlyties jėgos, lašišų spermatozoidų DNR, tada granulės buvo surinkti po to, kai du kartus plaunamas su plovimo buferiu I (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, ir 2 mm EDTA), o po to plovimo buferio II (20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, ir 2 mm EDTA) , ir plovimo buferio III (10 mmol Tris-HCl; pH 8,1, 0,25 M LiCl, 1% Nonidet P-40, 1% deoksicholatas, ir 1 mM EDTA), ir galutinis plovimo buferio IV (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, ir 1 mM EDTA). Kad immunoprecipitates eliuuojami 200μl eliuavimo buferiu (1% SDS ir 0,1 M NaHCO _{3), po kurio eina ne 65 ° C temperatūroje, inkubacijos per naktį. Kitą dieną, DNR kiekvieno mėginio buvo izoliuotas ir PGR buvo atliekama siekiant sustiprinti rengėjas segmentus, kuriuose yra HIF-1α prijungimo vietą.}

1,8 liuciferazės tyrimus, atliekamus

Ląstelės išaugo iki 70% santakoje ir tada buvo pernešta trimis egzemplioriais su pGL3-miR-27a-Luc, pcDNR-HIF-1α ar pGL3-BASIC, kartu su PRL-TK. Po 48 h transfekcijos, ląstelės buvo renkami ir liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant dvejopo liuciferazės reporterio testą sistema (Promega, Madison, WI) pagal gamintojo protokolą. Liuciferazės veikla PRL-TK buvo įteikti kaip vidaus kontrolės.

1.9 Statistinė analizė

rezultatai pateikiami priemonėmis ± Š.D. ANOVA ir Dunnett testas buvo atliekamas naudojant SPSS 11.5 programą.

Rezultatai

1 HIF-1α ir miR27a yra skirtingai išreikšta tarp skrandžio para karcinoma audinių ir GC audinio

išraiška HIF-1α GC audinio palyginti su skrandžio para karcinoma audinio lėmė per KRL-PGR ir Vakarų dėmė, o L-OHP ląstelių jautrumas buvo nustatytas per MTT. HIF-1α (pav 1A, 1B ir 1C, qPCR ir Vakarų dėmė) ir miR27a (pav 1D, qPCR rezultatai) buvo iki-reguliuojami GC audinio, palyginti su skrandžio para karcinoma audinio. MTT tyrimas parodė, kad mobiliojo išgyvenamumas buvo didesnis GC audinio nei skrandžio para karcinoma audinio, kai L-OHP buvo pridėta prie vienaląsčiai audinių suspensijos (Pav 1E, histogramos rezultatai).

2 HIF -1α ir miR27a yra skirtingai išreikšta tarp skrandžio gleivinės epitelio ląstelių linijos ir GC ląstelių linija

HIF-1α išraiška buvo didžiausias OCUM-2MD3 /L-OHP ir OCUM-2MD3 ląsteles, nuosekliai, ir buvo mažiausias per GES-1 ląstelių (pav 2a, 2b ir 2c, qPCR ir Vakarų dėmė). Be to, miR27a išraiška rodomas pačią tendenciją, kurioje OCUM-2MD3 /L OHP ląstelės rodomas aukščiausią išraišką, po OCUM-2MD3 ląstelių ir GSE-1 ląstelės rodomas mažiausią išraišką PPN-27a (pav 2D, qPCR rezultatai). MTT tyrimas atskleidė, kad kai L-OHP buvo įtraukta į trijų ląstelių linijų, OCUM-2MD3 /L OHP ląstelės eksponuojami aukščiausią ląstelių išgyvenamumas, po OCUM-2MD3 ląstelių, ir kad GSE-1 ląstelės eksponuojami mažiausią ląstelių išgyvenimą norma (pav 2E, histogramos rezultatai).

3 HIF-1α-siRNR slopina miR27a išraiška ir atsparumo vaistams iš OCUM-2MD3 /l-OHP ląstelių

Vakarų dėmė analizė parodė, kad mRNR ir baltymų lygiai HIF-1α sumažėjo iki įvairaus laipsnio OCUM-2MD3 /l-OHP ląstelių Transfekuoti su trimis poromis HIF-1α-siRNA, o HIF-1α išraiška nepasikeitė ląstelėse transfektuotose kontrolės, siRNA. HIF-1α išraiška atrodė daugiausia sumažės smarkiai, maždaug 90%, naudojant HIF-1α-siRNA-2 (pav 3a). Kaip parodyta Fig 3B, HIF-1α išraiška sumažėjo šių ląstelių priklausomai nuo dozės priklausomu būdu, kuriame HIF-1α išraiška sumažėjo daugiau nei 95% ląstelėse transfekuotų su 80 nM HIF-1α-siRNR-2, kai HIF- 1α-siRNR-2 buvo toliau transfekuota esant 20 nM, 40 nM arba 80 nM dozės. Be to, maksimalus slopinantis poveikis buvo aptikta 48 h po to, transfekciją (pav 3C).

miR27a išraiška buvo žymiai sumažėjo po transfekciją iš OCUM-2 MD3 /L-OHP ląstelių su HIF-1α-siRNR-2 (pav 3D). MTT tyrimas parodė, kad mobiliojo išgyvenamumas buvo žymiai sumažintas po gydymo HIF-1α-siRNR-2-perkeltų OCUM-2 MD3 /L OHP ląstelių L-OHP palyginti su ne perkeltų ląstelių (pav 3e).

4 Poveikis miR27a dėl OCUM-2MD3 /l-OHP ląstelių MDR

iš miR27a išraiška buvo iki-reguliuojami OCUM-2MD3 /L OHP ląstelių kai miR27a mimikos buvo bendrai perkeltų į šių vaistams atsparių GC ląstelių, kurios buvo transfektuotose HIF-1α-siRNA (pav 4a). Tačiau jokio reikšmingo skirtumo HIF-1α išraiška buvo aptiktas OCUM-2MD3 /L OHP ląstelių po transfekciją (Pav 4B ir 4C, qPCR ir Vakarų dėmė).

MTT parodė, kad išlikimui norma OCUM-2MD3 /L OHP ląstelių buvo aiškiai padidėjo po transfekcijq su miR27a Mimic (pav 4D, histogramos rezultatai).

5 HIF-1α skatina į miR27a rašybą OCUM-2MD3 ląstelių

HIF-1α išraiška buvo gerokai padidėjo OCUM-2MD3 ląstelių, į kurias įvesti eukariotinių išraiška plazmidžių pcDNR-HIF-1α 48 h (pav 5A). Be to, miR27a išraiška buvo akivaizdus iki reguliuojama (pav 5B). Taigi, šie rezultatai rodo, kad HIF-1α yra lemiamas veiksnys, darantis įtaką miR27a transkripciją. Todėl, mes nustatyta liuciferazės reporteris genų plazmidę, turinčiame 2 kb seką prieš srovę nuo promotoriaus regione miR27a, kuri buvo bendrai transfekuota su pcDNR-HIF-1α į ląsteles. DLA duomenys parodė, kad HIF-1α sustiprintas rengėjas aktyvumą miR27a po bendradarbiavimo transfekciją (pav 5c). ChIP analizė dar kartą patvirtino, kad HIF-1α, tiesiogiai susietas su promotoriaus regione miR27a (pav 5d). Rezultatai parodė, kad HIF-1α gali skatinti miR27a rašybą OCUM-2MD3 ląstelių tiesiogiai prisijungdamas prie promotoriaus regione miR27a.

6 slopinimas HIF-1α naudojant siRNA slopina narkotikų išraišką atsparumo susijusi genai

Kaip parodyta Fig 6 d slopinimas HIF-1α dramatiškai slopino MDR1 /p-gp, LRP, ir BCL-2 OCUM-2MD3 /L OHP ląstelių išraišką, bet reikšmingai nepakeitė GST-π arba TS išraiška. (Pav 6).

7 slopinimas miR27a sumažina narkotikų atsparumo susijusių genų raiškos OCUM-2MD3 /l-OHP ląstelių

miR27a buvo represuoti ir vaistams atsparios GC OCUM-2MD3 /L-OHP ląstelės transfekuotos su anti-miR27a sekos (pav 7A). Be to, po šios transfekciją, kad MDR1 /P-gp, LRP ir išraiška BCL-2 buvo ženkliai sumažėjo, o ne didelis skirtumas buvo aptikta PVM-π arba TS (Pav 7b, 7c ir 7d, qPCR ir Vakarų išraiškos dėmė). (7 pav)

Diskusijos

Nors atrodo, kad visame pasaulyje sergamumas GC, kad pastaraisiais metais sumažėjo, didelis sergamumas GC išlieka, rimtą pavojų asmenų sveikatai Azijoje [22] , GC ląstelių MDR prisideda prie prastos prognozės GC, kuriame deguonies trūkumas vaidina labai svarbų vaidmenį. Šioje studijoje, mes sukūrėme stabilų OCUM-2MD3 /L OHP ląstelių liniją, kuri yra atsparus L-OHP. Mūsų duomenys rodo, kad GC audiniai ir ląstelių linijos pasižymi atsparumu stipresnį narkotikų, palyginti su normaliomis skrandžio epitelinių audinių ir ląstelių linijų. Mes taip pat nustatė, kad vaistams atsparių ląstelių sukurti daug stipresnį MDR. Mūsų rezultatai parodė, padidėjo išraiška HIF-1α GC audinių ir ląstelių linijų, o didžiausia išraiška HIF-1α buvo aptikta narkotikų atsparus ląstelių linija. Todėl, mes rodo, kad HIF-1α prisideda prie MDR plėtros GC ląstelių.

HIF-1α genas koduoja baltymą, kuris susideda iš 826 amino rūgščių, kurio molekulinė masė 120 kDa [23]. Daugelis tyrimų patvirtino, kad padidėjo išraiška HIF-1α stipriai susijęs su atsiradimo ir plėtros navikų [24-28]. Kiti tyrimai parodė, kad per išraiška HIF-1α pagerina vaistams atsparių savybių navikinių ląstelių [29-32] įvairovė. Be to, mūsų tyrimai parodė, kad GC audiniai ir ląstelių linijos eksponuoti stipresnį atsparumą chemoterapiniais narkotikų nei skrandžio para-karcinoma audinių ir skrandžio gleivinės ląstelių linijų. Mes taip pat aptiko galingiausią narkotikų atsparumą GC ląsteles. Tačiau mechanizmų, kuriuos HIF-1α reguliuoja MDR dar turi būti aiškiai nurodyta GC ląsteles. Todėl mes toliau nagrinėjo HIF-1α apie MDR savybių GC ląstelių poveikį per genų trukdžių ir klonavimo metodus. RNR interferencijos (RNRi) buvo rodomas privalumų specifiškumo, efektyvumas ir ilgaamžiškumas už taikinio geno išraiškos [33] Reglamentas. Mūsų duomenys rodo, kad slopinimas HIF-1α žymiai sumažino atsparumą narkotikais OCUM-2MD3 /L OHP ląsteles. Be to, mes įrodyta, kad atsparumo vaistams buvo žymiai didesnis tada, kai pcDNR-HIF-1α, kuris buvo naudojamas superekspresuotų HIF-1α, buvo transfekuota į ne-vaistams atsparių GC ląstelių linijų. Mūsų rezultatai parodė, kad HIF-1α vaidina svarbų vaidmenį MDR GC plėtrai.

Neseniai atlikti tyrimai parodė, kad MDR yra glaudžiai susijęs su miRNAs navikuose [34-36]. Hu pranešė, kad nukenksminti MIR-27a gali pakeisti MDR savybes GC ląstelių [18]. Be to, jis buvo pranešė, kad miR-21, miR-27a, miR-210 ir miR-181b buvo iki reguliuojama per HIF keliu į hipoksinio aplinką, grindžiamą genų-chip tyrimo [19]. Pagal mūsų rezultatus, HIF-1α teigiamai susijęs su PPN-27a raiškos GC audinių ir ląstelių linijų ir slopinimas HIF-1α sumažėjo MIR-27a. Priešingai, per išraiška HIF-1α paskatino PPN-27a išraiška. Šie rezultatai parodė, kad HIF-1α reguliuoja miR-27a išraiška. Be to, mūsų tyrimas parodė, kad Pasaulis-27a imituoja išgelbėjo narkotikų atsparumo savybes HIF-1α-triuškinantis ląsteles. Svarbiausia, HIF-1α tiesiogiai jungiasi su ir skatina miR27a transkripciją, nurodant, kad HIF-1α reguliuoja GC MDR per miR-27a.

būdingas genų išraiška, yra glaudžiai susiję su MDR, įskaitant MDR1 /P-glikoproteino, PVM-π, LRP, BCL-2 ir TS prieš ir po HIF-1α išraiškos moduliavimo GC ląstelių išsiaiškinti mechanizmą, pagal kurį HIF-1α-Pasaulis-27a kelias reguliuoja GC MDR , Mes parodė, kad slopinimas HIF-1α išraiškos sumažino MDR1 /P-gp, LRP ir BCL-2 išraišką. Ekspresijos lygis šių genų buvo žymiai didesnis, kai ląstelės buvo transfekuota su miR-27a kartojančius, o ekspresijos lygis GST-π ir TS buvo labai nepakinta. Pagal šią išvadą, per išraiška HIF-1α stipriai iki-sureguliavo MDR1 /P-gp, LRP, ir BCL-2 išraišką GC OCUM-2MD3 ląstelių linija. Todėl, mūsų duomenys rodo, kad HIF-1α-Pasaulis-27a kelias tarpininkauja MDR savybės GC sukeliant MDR1 /P-gp, LRP ir BCL-2 išraišką.

Mūsų tyrimai rodo, kad HIF-1α ir miR -27a yra up-reguliuojami GC audinių ir ląstelių linijų. HIF-1α veikia kaip prieš srovę reguliatorius miR-27a. HIF-1α-Pasaulis-27a signalizacijos pagerina MDR savybes sukeliant į MDR1 /P-gp, LRP ir BCL-2 GC išraiška. Šie rezultatai rodo, kad HIF-1α-Pasaulis-27a kelias vaidina lemiamą vaidmenį MDR inicijavimo žmogaus GC, kuris gali tarnauti kaip naują terapinį tikslą, pagal MDR GC.

Parama Informacija
S1 failą. Duomenys MTT ir Vakarų
Doi.: /Journal.pone.0132746.s001
(zip)
10,1371

• PLoS ONE: daugiskaitos Atsparumas Susiję Rimta Ne kodavimo RNR išraiška Profilis Analizė skrandžio vėžio
• PLoS ONE reglamentavimą B ląstelių funkcija yra užslopinta rūkymas ir nutukimas H. pylori infekuotų dalykų ir yra susijęs su padidinta rizika Skrandžio Cancer