PLOS ONE: HIF-1α induce resistencia a múltiples fármacos en células de cáncer gástrico mediante la inducción de miR-27a

Extracto

Este estudio tuvo como objetivo determinar la correlación entre HIF-1α y la expresión de miR-27a y para evaluar el efecto de inhibición de la expresión de HIF-1α en la expresión de miR-27a y resistencia a los medicamentos en el cáncer gástrico (GC). En el presente estudio, tiempo real, PCR y Western blot se realizaron para detectar la expresión de HIF-1α en los tejidos y líneas celulares de GC. A continuación, las células OCUM-2MD3 /L-OHP fueron transfectadas con HIF-1α-siRNA, un mimético de miR-27a o pcDNA-HIF-1α, y la supervivencia celular se determinó mediante el ensayo de MTT. La expresión de HIF-1α, miR-27a, y los genes relacionados con la MDR se midió a través de PCR en tiempo real y Western blot. Chip y ensayos de actividad de luciferasa duales se realizaron para evaluar la regulación transcripcional de HIF-1α y miR-27a. Los resultados revelaron que la transfección con HIF-1α-siRNA disminuyó notablemente los niveles de miR-27a, lo que resulta en una mayor dramáticamente la inhibición de la tasa de proliferación de las células OCUM-2MD3 /L-OHP. En comparación con las células no transfectadas, la tasa de supervivencia se redujo significativamente en las células transfectadas con HIF-1α-siRNA después del tratamiento con L-OHP. La tasa de supervivencia de las células fue significativamente mayor en OCUM-2MD3 /L-OHP células transfectadas con el imitador de miR-27a, mientras que la sobreexpresión de HIF-1α no dio lugar a ningún cambio claro en la supervivencia celular. Los resultados del ensayo de la actividad de luciferasa dual demostraron que HIF-1α aumenta la actividad transcripcional del promotor miR27a en células transfectadas con un plásmido indicador que contiene la región del promotor corriente arriba de miR27a junto con pcDNA-HIF-1α. Chip análisis sugirió que HIF-1α se une directamente a la región promotora de miR27a. La inhibición de HIF-1α o expresión miR27a disminuyó MDR1 /P-gp, PRL, y Bcl-2 expresión en OCUM-2MD3 /células L-OHP. De este modo, encontramos que HIF-1α está estrechamente asociada con la MDR en GC y que HIF-1α puede suprimir MDR1 /P-gp, PRL y Bcl-2 expresión de la inhibición de la expresión de miR-27a

Visto:. Zhao Q, Y Li, Tan Bb, Ventilador Lq, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α induce resistencia a múltiples fármacos en células de cáncer gástrico mediante la inducción de miR-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10.1371 /journal.pone.0132746

Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & Research Institute, Estados Unidos |

Recibido: 5 de Enero, 2015; Aceptado: 17 Junio ​​2015; Publicado: 20 Agosto 2015

Derechos de Autor © 2015 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la siguiente subvención:. la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de la provincia de Hebei (núm H2013206311 a Qun Zhao)

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico (CG) es una de las neoplasias más comunes, causando daños graves en todo el mundo [1, 2] Después de años de los avances tecnológicos en el diagnóstico y tratamiento de la GC, su incidencia y mortalidad han disminuido en todo el mundo, pero siguen siendo altos en los países de Asia [3, 4]. En la actualidad, la resección gástrica es el único método disponible para curar GC. Sin embargo, es difícil de lograr una curación completa a pesar de la extirpación quirúrgica del tumor porque la mayoría de los pacientes sufren de GC avanzado en el diagnóstico [5, 6]. Por lo tanto, la quimioterapia desempeña un papel extremadamente importante en el tratamiento integral de la GC. Aunque la quimioterapia progresó considerablemente con respecto al tratamiento de la CG avanzado, [7, 8] el pronóstico de GC sigue siendo insuficiente, con una tasa de supervivencia a 5 años inferior al 30% [9]. Este pronóstico es debido principalmente a la resistencia a múltiples fármacos (MDR) de las células de GC. MDR en GC menudo conduce al fracaso de la quimioterapia [10-12]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas prometedoras para reducir eficazmente MDR en GC.

deficiencia de oxígeno es prevalente en tumores sólidos y se asocia con una variedad de funciones biológicas. En la actualidad, el factor inducible por hipoxia (HIF) -1α se considera que esté estrechamente asociada a la hipoxia. HIF-1α se expresa fuertemente en una variedad de tumores malignos [13, 14] y actúa como un factor esencial para regular la adaptación de las células tumorales a la hipoxia [15]. HIF-1α ha sugerido que estar estrechamente asociado con GC MDR [16, 17]. Sin embargo, no está claro qué vía media en el papel de HIF-1α en GC MDR.

En los últimos años, el papel de los microRNAs (miRNAs) en el cáncer se ha convertido en un mecanismo ampliamente investigado de la iniciación y el tratamiento de tumores. miR-27a, un miembro de la familia de los genes miARN, se ha demostrado que afectan a la MDR de GC [18]. Además, la expresión de miR-27a se aumenta en un entorno hipóxico [19]. Estos hallazgos sugieren que HIF-1α puede regular la expresión de miR-27a y afectar GC MDR. Sin embargo, los mecanismos de regulación específicos aún no se han dilucidado. El presente estudio demostró que la expresión de HIF-1α y miR-27a fueron significativamente hasta reguladas en los tejidos y líneas celulares de GC, especialmente en líneas celulares resistentes.

La transfección con un ARN pequeño de interferencia específico para bloquear HIF endógena -1α dio lugar a una reducción en la expresión de miR-27a y el alivio de la MDR en líneas celulares de GC. Estos nuevos hallazgos sugieren que la inhibición de la expresión de HIF-1α suprime la transcripción de los genes relacionados con la MDR MDR1 /P-gp, PRL, y Bcl-2 para atenuar la MDR de células GC mediante la represión de la expresión de miR-27a.

Materiales y Métodos

1.1 Materiales

línea celular gástrica OCUM-2MD3 era del profesor Masakazu Yashiro en Cirugía Japón Oita médica [20]. Se obtuvo la línea celular resistente a los medicamentos estables OCUM-2MD3 /L-OHP2 vía cultivo y selección por nuestro grupo de investigación. La línea de células GSE-1 fue adquirido de la célula Centro de Recursos en Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas de la Academia China de Ciencias. RPMI 1640 medio de cultivo y la tripsina se adquirieron de Gibco Company; reactivo Trizol y el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 se adquirieron de Invitrogen. Los kit de transcripción y de PCR cuantitativa de fluorescencia inversa reactivos se obtuvieron de Promega Corporation. Los cebadores de PCR y pequeños ARN de interferencia se sintetizaron por Shanghai Biological Engineering Company. El kit de extracción de la proteína se obtuvo de Beyotime Company, China. Los anticuerpos primarios contra HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, PRL, Bcl-2, o TS GAPDH fueron adquiridos de Santa Cruz. MTT se obtuvo de Sigma. Nuestro estudio fue aprobado por el comité de ética de la Cuarta Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Hebei.

1,2 preparación de la muestra clínica

Todos los 65 pacientes con GC fueron seleccionados después de la resección gástrica y la confirmación patológica en la Cuarta el hospital de la Universidad médica de Hebei, entre ellos 42 hombres y 23 mujeres con edad de 60.5 ± 8.1 años que no habían recibido radioterapia o quimioterapia preoperatoria. cáncer de los tejidos y para-carcinoma (aproximadamente 1,0 cm x 0,5 cm x 0,5 cm) se tomaron de cada paciente y las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y posteriormente se transfirieron a -80 ℃ conservación. Todos los participantes firmaron el consentimiento informado.

1.3 Cultivo de células y transfección

El OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OHP y GSE-1 líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. En particular, el medio de las células OCUM-2MD3 /L-OHP se trató con L-OHP a una concentración de 75μg /ml para mantener su fenotipo de resistencia a fármacos, una semana antes de la cirugía para detener el tratamiento. Las células se incubaron en un 5% humidificado de CO _{2 atmósfera a 37 ° C}

Tres secuencias de HIF-1α-siRNA fueron diseñados utilizando BLOCK-iT RNAi Designer (secuencia 1:. GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; secuencia 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; secuencia 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), cada uno de los cuales se recoció con su secuencia complementaria y se transfectó en las células respectivamente OCUM-2 MD3 /L-OHP GC. Una secuencia de siRNA no específica (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) se utilizó como control negativo. La secuencia mimética miR27a era 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 '. secuencia coden HIF-1α humana de longitud completa se subclonó en el vector pcDNA3.1. pGL3-miR27a-luc, plásmidos pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic y PRL-TK se construye y se conserva en nuestro laboratorio.

Las células GC fueron sembradas en placas de 6 pocillos durante 24 h antes de la transfección en una densidad de 4 x 10 ^{5 células /ml. Los vectores plasmídicos, o siRNA miR27a imitador se transfectó en las células de GC o de células resistentes a los medicamentos utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine siguiendo las instrucciones del fabricante. Entonces, las células se lavaron con antibióticos RPMI 1640 libre de suero deficiente. La eficacia de transfección se midió 24 h después, seguido de los experimentos posteriores.}

1,4 MTT ensayo

tejidos GC y tejido normal para-carcinoma se homogeneizó para preparar suspensiones de células individuales mediante la filtración a través de un 300 rejilla de cobre-malla. Las células GC digeridos usando 0,02% de EDTA-tripsina al 0,25% se sembraron a una densidad de 5 × 10 ^{4 células /ml en placas de 96 pocillos. Una vez que las células alcanzaron aproximadamente 60% de confluencia, HIF-1α-siRNA se transfectó o se aplicó un fármaco quimioterapéutico (150μg /ml de L-OHP). Cada grupo constaba de seis pozos. A continuación, 20μl de 5 mg /ml MTT se añadió durante 4 h antes del final del experimento. Las células se cultivaron durante 4 h y, a continuación, se desechó el medio de cultivo. A continuación, se añadió 150μl de DMSO a cada pocillo, y los valores de DO se midieron a 490 nm usando un lector de microplacas después de agitar la placa durante 15 min a temperatura ambiente. Los experimentos se repitieron tres veces.}

1,5 de aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa

El ARN total se extrajo utilizando Trizol método de una etapa, y se utilizó RNA 2μg para la transcripción inversa para generar ADNc de plantilla. Los niveles de mRNA relativa se determinaron mediante PCR cuantitativa, GAPDH sirvió como un gen de referencia interna. Los parámetros de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 5 min seguido de 45 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 s y recocido a 60 ° C durante 30 s. Las secuencias de los cebadores fueron diseñados utilizando Primer 5.0 y se realizaron búsquedas de especificidad. Las secuencias de los cebadores son las siguientes: HIF-1α (93 pb): (F) 5'-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 'y (R) 5' CTCAAAGCGACAGATAACACG-3 '; MDR1 (126 pb): (F) 5'-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 'y (R) 5' ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3 '; GST-π (151 pb): (F) 5'-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 'y (R) 5' TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3 '; Bcl-2 (98 pb): (F) 5'-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 'y (R) 5' TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3 '; LRP (129 pb): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'y (R) 5' AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3 '; TS (129 pb): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'y (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; y GAPDH (138bp): (F) 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 'y (R) 5' CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3 '. Los resultados cuantitativos de PCR se calcularon utilizando el 2 ^{-ΔΔCt método}

1.6 Western blot

Las muestras de tejidos y células se lisaron usando tampón de lisis RIPA:. 1% de Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, pH 8,0, Na3VO4 0,2 mM, 0,2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y 0,5% NP-40. Cantidades iguales de las muestras de proteína se separaron en los geles de SDS poliacrilamida al 10% (SDS-PAGE) y se electrotransfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Amersham Pharmacia Biotech). Las membranas se bloquearon con 5% de BSA durante 2 h y se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. Las membranas se incubaron durante 2 h en un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las bandas diana se detectan usando un aumento de quimioluminiscencia (ECL) kit de detección (Santa Cruz, EE.UU.). β-actina se utilizó como gen de control endógeno. El experimento se repitió tres veces. Se realizaron

1,7 inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ensayo de

ensayos de chip de acuerdo con el método de Wang et al. [21]. Las células con diferente tratamiento se fijaron con formaldehído al 1% durante 15 min a temperatura ambiente, y terminado por una concentración final de 0,125 M de glicina. Luego, las células se lisaron usando tampón de lisis 300μl (mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 1% inhibidores de la P-40, 0,5% desoxicolato, y la proteasa 50 Nonidet). Los lisados ​​celulares se sometieron a ultrasonidos en baño de agua helada para producir fragmentos de cromatina de 600 pb, tal como se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa. Después de centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min, se tomaron los sobrenadantes y pre-borran durante 15 min a 4 ° C a través de la incubación con 30μl de perlas de proteína A-Sepharose y ADN de esperma de salmón. Después de centrifugación a 13.000 rpm durante 5 min, los sobrenadantes se dividieron en tres partes iguales: una para la entrada, los otros dos para la inmunoprecipitación con o sin anticuerpo HIF-1α. El día siguiente, los complejos inmunes se precipitaron con proteína perlas A-Sepharose y ADN de esperma de salmón, a continuación, se recogieron las perlas después se lavaron dos veces con el tampón de lavado I (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, NaCl 150 mM, 0,1% SDS, 1% de Triton X-100, y 2 mM de EDTA), seguido de tampón de lavado II (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, NaCl 500 mM, 0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, y EDTA 2 mM) y tampón de lavado III (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,25 M de LiCl, 1% Nonidet P-40, 1% desoxicolato y EDTA 1 mM), y el tampón de lavado final IV (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, y 1 mM EDTA). Los inmunoprecipitados se eluyeron por 200μl de tampón de elución (1% SDS y 0,1 M NaHCO _{3), seguido de incubación a 65 ° C durante la noche. El día siguiente, se aisló el ADN de cada muestra, y se realizó una PCR para amplificar los segmentos de promotor que contiene un sitio de unión HIF-1α.}

1,8 Los ensayos de luciferasa

Las células cultivadas a 70% de confluencia y a continuación, se transfectaron por triplicado con pGL3-miR-27a-luc, pcDNA-HIF-1α o pGL3-Basic, junto con pRL-TK. Después de 48 h de transfección, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa usando el Dual Luciferase-Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las actividades de luciferasa de PRL-TK se sirvieron como control interno.

1.9 estadístico El análisis

Los resultados se presentan como las medias ± S. D. ANOVA y Dunnett prueba se realizó con el programa SPSS 11.5.

Resultados

1 HIF-1α y miR27a se expresan diferencialmente entre los tejidos para-carcinoma gástrico y GC tejido

La expresión de HIF-1α en el tejido GC en comparación con el tejido para-carcinoma gástrico se determinó a través de QRT-PCR y Western blot, y se determinó la sensibilidad de las células L-OHP mediante el ensayo de MTT. HIF-1α (Fig 1A, 1B y 1C, qPCR y Western blot) y miR27a (Fig 1D, los resultados qPCR) eran hasta regulado en el tejido GC comparación con el tejido para-carcinoma gástrico. El ensayo MTT demostraron que la tasa de supervivencia de las células fue mayor en el tejido GC que en el tejido para-carcinoma gástrico cuando se añadió L-OHP a las suspensiones de tejidos de una sola célula (Figura 1E, los resultados del histograma).

2 HIF -1α y miR27a se expresan diferencialmente entre una línea de células epiteliales de la mucosa gástrica y una línea celular GC

la expresión de HIF-1α fue la más alta en las células OCUM-2MD3 OCUM-2MD3 /L-OHP y, secuencialmente, y fue el más bajo en GES-1 células (figura 2A, 2B y 2C, qPCR y Western blot). Por otra parte, la expresión de miR27a muestra la misma tendencia, en el que las células OCUM-2MD3 /L-OHP muestran la expresión más alta, seguida por las células OCUM-2MD3, y las células GSE-1 está representada la más baja expresión de miR-27a (figura 2D, resultados qPCR). El ensayo MTT reveló que cuando se añadió L-OHP a las tres líneas de células, las células OCUM-2MD3 /L-OHP exhiben la tasa de supervivencia de células más alto, seguido por las células OCUM-2MD3, y que las células GSE-1 exhibió la supervivencia de las células más bajo tasa (figura 2E, los resultados del histograma).

3 HIF-1α-ARNsi suprime la expresión de miR27a y la resistencia a los medicamentos de las células OCUM-2MD3 /L-OHP

Western blot mostró que los niveles de mRNA y proteína de HIF-1α disminuyó en diversos grados en las células L-OHP transfectadas con tres pares de HIF-1α-siRNA OCUM-2MD3 /, mientras que la expresión de HIF-1α no cambió en las células transfectadas con el control de siRNA. HIF-1α expresión pareció disminuir más pronunciada, en aproximadamente un 90%, el uso de HIF-1α-siRNA-2 (Figura 3A). Como se muestra en la figura 3B, la expresión de HIF-1α disminuyó en estas células de una manera dependiente de la dosis, en los que la expresión de HIF-1α disminuyó en más de 95% en las células transfectadas con 80 nM HIF-1α-siRNA-2, cuando HIF 1α-siRNA-2 se transfectó más a una dosis de 20 nM, 40 nM o 80 nM. Además, el efecto inhibidor máximo se detectó 48 h después de la transfección (figura 3C).

expresión miR27a se redujo significativamente después de la transfección de las células MD3 /L-OHP OCUM-2 con HIF-1α-siRNA-2 (Fig 3D). El ensayo MTT se indica que la tasa de supervivencia celular se redujo significativamente después del tratamiento de HIF-1α-siRNA-2-transfectadas OCUM-2 MD3 /células L-OHP con L-OHP comparación con las células no transfectadas (Fig 3E).

4 Efectos de miR27a en la MDR de células OCUM-2MD3 /L-OHP

la expresión de miR27a fue hasta reguladas en las células OCUM-2MD3 /L-OHP cuando el miR27a mímica era co transfectados en estas células GC resistentes a los medicamentos que habían sido transfectadas con HIF-1α-siRNA (Fig 4A). Sin embargo, no se detectó diferencia significativa en la expresión de HIF-1α en células OCUM-2MD3 /L-OHP después de la transfección (Fig 4B y 4C, qPCR y Western blot).

El ensayo MTT demostraron que la supervivencia tasa de células /L-OHP-OCUM 2MD3 se incrementó claramente después de la transfección con el miR27a mímica (figura 4D, los resultados del histograma).

5 HIF-1α induce la transcripción de miR27a en las células OCUM-2MD3

la expresión de HIF-1α fue significativamente mayor en las células OCUM-2MD3 transfectadas con el plásmido de expresión eucariota pcDNA-HIF-1α durante 48 h (Fig 5A). Además, la expresión miR27a fue hasta reguladas (figura 5B). Por lo tanto, estos resultados sugieren que HIF-1α es un factor crítico que afecta a la transcripción de miR27a. Por lo tanto, se estableció una luciferasa del plásmido de gen informador que lleva una secuencia 2 kb aguas arriba de la región promotora de miR27a, que era co-transfectadas con pcDNA-HIF-1α en las células. Los datos de DLA mostró que HIF-1α mejora la actividad del promotor de miR27a siguiente co-transfección (Fig 5C). Chip análisis confirmó además que HIF-1α unido directamente a la región promotora de miR27a (Fig 5D). Los resultados indicaron que HIF-1α puede promover la transcripción de miR27a en células OCUM-2MD3 uniéndose directamente a la región promotora de miR27a.

6 La inhibición de HIF-1α usando siRNA suprime la expresión de resistencia a los medicamentos relacionados genes

Como se muestra en la figura 6, la inhibición de HIF-1a dramáticamente suprimió la expresión de MDR1 /P-gp, LRP, y Bcl-2 en las células OCUM-2MD3 /L-OHP pero no alteró significativamente la expresión de GST-π o TS. (Figura 6).

7 Inhibición de miR27a reduce la expresión de genes relacionados con la resistencia a fármacos en células OCUM-2MD3 /L-OHP

miR27a fue reprimida en GC resistentes a los medicamentos OCUM-2MD3 /células L-OHP transfectadas con la secuencia de anti-miR27a (Fig 7A). Por otra parte, después de esta transfección, la expresión de MDR1 /P-gp, LRP y Bcl-2 se redujo significativamente, mientras que no se detectó ninguna diferencia significativa en la expresión de GST-π o TS (Fig 7B, 7C y 7D, qPCR y Western mancha). (Figura 7)

Discusión

A pesar de que la tasa de incidencia mundial de la GC parece haber disminuido en los últimos años, una alta incidencia de CG persiste, poniendo en grave peligro la salud de las personas en Asia [22] . La MDR de células GC contribuye al mal pronóstico de GC, en el que la deficiencia de oxígeno juega un papel fundamental. En el presente estudio, se estableció la línea celular estable OCUM-2MD3 /L-OHP que es resistente a la L-OHP. Nuestros datos indican que los tejidos y líneas celulares GC exhiben fuerte resistencia a los medicamentos que los tejidos epiteliales gástricas normales y líneas celulares. También se encontró que las células resistentes a los medicamentos desarrollan MDR mucho más fuerte. Nuestros resultados mostraron un incremento en la expresión de HIF-1α en los tejidos y líneas celulares de GC, y se detectó la más alta expresión de HIF-1α en una línea celular resistente a los fármacos. Por lo tanto, sugerimos que HIF-1α contribuye al desarrollo de la MDR en las células de GC.

El gen HIF-1α codifica una proteína que consta de 826 aminoácidos con un peso molecular de 120 kDa [23]. Muchos estudios han confirmado que el aumento de la expresión de HIF-1α está fuertemente asociado con la aparición y el desarrollo de tumores [24-28]. Otros estudios han sugerido que la sobre expresión de HIF-1α mejora las propiedades resistentes a los medicamentos de una variedad de células tumorales [29-32]. Además, nuestro estudio demuestra que los tejidos y líneas celulares GC presentan mayor resistencia a los fármacos quimioterapéuticos que los tejidos para-carcinoma gástrico y líneas de células de la mucosa gástrica. También se detectó la resistencia a los fármacos más potentes en las células de GC. Sin embargo, los mecanismos por los que HIF-1α regula MDR aún no se han identificado claramente en las células de GC. Por lo tanto, se investigó adicionalmente los efectos de HIF-1α en las propiedades resistentes a múltiples fármacos de las células de GC a través de la interferencia de genes y técnicas de clonación. La interferencia de ARN (RNAi) ha mostrado ventajas en la especificidad, la eficiencia y durabilidad para la regulación de la expresión de genes objetivo [33]. Nuestros datos indican que la inhibición de HIF-1α redujo significativamente la resistencia a fármacos en las células OCUM-2MD3 /L-OHP. Por otra parte, hemos demostrado que la resistencia a fármacos se aumentó dramáticamente cuando pcDNA-HIF-1α, que se utilizó para sobreexpresar HIF-1α, se transfectó en las líneas celulares de GC no farmacológico-resistentes. Nuestros resultados indican que HIF-1α juega un papel esencial en el desarrollo de la MDR en GC.

Los estudios recientes han indicado que la MDR está estrechamente relacionado con los miRNAs en los tumores [34-36]. Hu ha informado de que la inactivación de miR-27a puede revertir las propiedades de las células MDR GC [18]. Por otra parte, se ha informado de que el miR-21, miR-27a, miR-210 y miR-181b fueron reguladas por la vía HIF en el ambiente hipóxico basado en un ensayo de chips de genes [19]. De acuerdo con nuestros resultados, HIF-1α se asoció positivamente con la expresión de miR-27a en tejidos y líneas celulares de GC, y la inhibición de HIF-1α disminuyó miR-27a. Por el contrario, la sobreexpresión de HIF-1α inducida por la expresión de miR-27a. Estos resultados indican que HIF-1α regula la expresión de miR-27a. Por otra parte, nuestro estudio mostró que imita el miR-27a rescataron a las propiedades de resistencia a fármacos de las células HIF-1a-desmontables. Lo más importante, HIF-1α se une directamente a la transcripción y promueve miR27a, lo que indica que HIF-1α regula la MDR de GC a través de miR-27a.

Nos caracteriza la expresión de genes que están estrechamente relacionados con la MDR, incluyendo MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2 y TS, antes y después de la modulación de la expresión de HIF-1α en células de GC para dilucidar el mecanismo por el cual la vía de HIF-1α-miR-27a regula la MDR de GC . Hemos demostrado que la inhibición de la expresión de HIF-1α redujo la expresión de MDR1 /P-gp, LRP y Bcl-2. Los niveles de expresión de estos genes se incrementaron significativamente cuando las células se transfectaron con el miR-27a mímica, mientras que los niveles de expresión de GST-π y TS no se alteraron de manera significativa. De acuerdo con este hallazgo, la sobre expresión de HIF-1a potentemente regulado hasta la expresión de MDR1 /P-gp, PRL, y Bcl-2 en la línea celular GC-OCUM 2MD3. Por lo tanto, nuestros datos demuestran que la vía de HIF-1α-miR-27a media propiedades resistentes a múltiples fármacos en la GC mediante la inducción de MDR1 /P-gp, PRL y Bcl-2 expresión
.

Nuestros estudios demuestran que el HIF-1α y MIR -27a están regulados en los tejidos y líneas celulares de GC. HIF-1α actúa como un regulador de aguas arriba de miR-27a. la señalización de HIF-1α-miR-27a mejora las propiedades de MDR mediante la inducción de la expresión de MDR1 /P-gp, PRL y Bcl-2 en GC. Estos resultados sugieren que la vía de HIF-1α-miR-27a juega un papel crucial en la iniciación de la MDR en GC humana, que puede servir como una nueva diana terapéutica para la MDR en GC.

Apoyo a la Información
archivo S1. Los datos de MTT y Western
doi:. 10.1371 /journal.pone.0132746.s001 gratis (postal)

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