Plos ONE: HIF-1α inducira rezistenco v želodcu raka celic, ki jih indukcijo MIR-27a

Povzetek

To študijo za določitev korelacije med HIF-1 a in miR-27a izražanja in oceniti učinek zaviranje HIF-1 a izraz na miR-27a izražanja in odpornosti na zdravila za zdravljenje raka želodca (GC). V tej študiji so realnem času PCR in izvedli Western blot za odkrivanje ekspresije HIF-1 a v GC tkiv in celičnih linij. Nato smo OCUM-2MD3 /L-presevne delovne projektorje celice transficirane z HIF-1 a-siRNA, ki miR-27a posnemajo ali pcDNA-HIF-1 a in preživetje celic smo določili s pomočjo MTT testu. Izraz HIF-1 a, MIR-27a in povezanih MDR genov smo izmerili s pomočjo v realnem času-PCR in Western blot. Chip in dvojna luciferazne teste aktivnosti so bile izvedene za oceno transkripcijski uredbi o HIF-1 a in pokoj-27a. Rezultati so pokazali, da transfekciji z HIF-1 a-siRNA izrazito znižala raven pokoj-27a, zaradi česar je močno izboljšano inhibicijo stopnjo proliferacije OCUM-2MD3 /L-OHP celic. V primerjavi z netransfektiranih celic, je bila stopnja preživetja znatno zmanjša v celicah, transfektiranih s HIF-1 a-siRNA po zdravljenju z L-OHP. Stopnja preživetja celic je v OCUM-2MD3 /L-OHP celice vnese miR-27a posnemajo znatno povečal, medtem ko HIF-1α prekomerno ni privedlo do jasne spremembe v preživetje celic. Rezultati dvojnega testu luciferazne aktivnosti pokazali, da HIF-1α povečuje transkripcijsko aktivnost promotorja miR27a v celicah, transfektiranih s reporterskega plazmida, ki vsebuje gorvodno promotorsko regijo miR27a skupaj z pcDNA-HIF-1 a. Analiza čip predlagal, da HIF-1α direktno veže na promotorsko regijo miR27a. Zaviranje HIF-1 a ali miR27a izražanja zmanjšala MDR1 /P-gp, LRP, in Bcl-2 izraza v OCUM-2MD3 /L-presevne delovne projektorje celice. Tako smo ugotovili, da je HIF-1α tesno povezana z MDR v GC in da HIF-1α lahko zavre MDR1 /P-gp, LRP in Bcl-2 izražanje z zaviranjem miR-27a izraz

Navedba sklicevanja. Zhao Q, Li Y, Tan Bb, Fan LQ, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α inducira rezistenco v želodcu raka celic, ki jih indukcijo MIR-27A. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10,1371 /journal.pone.0132746

Urednik: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, UNITED STATES

Prejeto: 5. januar 2015; Sprejeto: 17. junij 2015; Objavljeno: 20. avgust 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. To delo je bilo podprto z naslednjimi donacijo. Deželna Natural Science Foundation province Hebei (št H2013206311 do Qun Zhao)

konkurenčnih interesov. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je eden izmed najbolj pogostih malignih bolezni, ki povzroča veliko škodo po vsem svetu [1, 2] Po letih tehnološki napredek v diagnostiki in zdravljenju GC, so njena pojavnost in smrtnost v svetu zmanjšalo, vendar še vedno visoko v azijskih državah [3, 4]. Trenutno želodca resekcija je na voljo samo metoda za zdravljenje GC. Vendar pa je težko doseči popolno ozdravitev kljub kirurški odstranitvi tumorja ker je pri večini bolnikov trpijo napredovalo GC po diagnozi [5, 6]. Zato, kemoterapija igra zelo pomembno vlogo pri celostni obravnavi GC. Čeprav kemoterapija zelo napredovala glede na zdravljenje napredovalega GC, [7, 8] prognoza GC je še vedno nezadostna, s 5-letno stopnjo preživetja manj kot 30% [9]. Ta napoved je predvsem zaradi odpornosti proti več (MDR) z GC celic. MDR v GC pogosto vodi do propada kemoterapije [10-12]. Zato je nujno treba razviti nove obetavne terapevtske strategije za učinkovito zmanjšanje MDR v GC.

pomanjkanje kisika prevladuje v solidnih tumorjev in je povezana z različnimi bioloških funkcij. Trenutno hipoksija-inducibilnih faktor (HIF) -1α se šteje, da je tesno povezana s hipoksijo. HIF-1α močno izražena v različnih malignih tumorjev [13, 14] in deluje kot bistven dejavnik za urejanje prilagajanje tumorskih celic na hipoksijo [15]. HIF-1α je bilo predlagano, da se tesno povezana z GC MDR [16, 17]. Vendar pa ni jasno, katero pot posreduje vlogo HIF-1 a v GC MDR.

V zadnjih letih je vloga microRNAs (miRNAs) pri raku je postal zelo raziskovali mehanizem tumorja začetku in zdravljenje. miR-27a, član družine miRNA, je bilo dokazano, da vplivajo na MDR z GC [18]. Nadalje je izraz miR-27a v hipoksične okolja [19] povečala. Te ugotovitve kažejo, da lahko HIF-1α uravnavajo izražanje pokoj-27a in vpliva GC MDR. Vendar pa imajo posebne regulativne mehanizme še ni pojasnjen. Sedanja Študija je pokazala, da so izraz HIF-1 a in pokoj-27a precej up-urejena v GC tkiv in celičnih linij, predvsem v celičnih linijah, odpornih.

Transfekcija s posebno male interferenčne RNA, da blokira endogenega HIF -1α povzročilo zmanjšanje miR-27a izražanja in zmanjševanju MDR v celičnih linijah GC. Te nove ugotovitve kažejo, da zaviranje HIF-1 a izražanja zavira transkripcijo povezanih-MDR genov MDR1 /P-gp, LRP, in Bcl-2 za ublažitev MDR GC celic, ki jih zatira miR-27a izraz.

materiali in metode

1.1 materiali
bila

želodca celične linije OCUM-2MD3 profesorja Masakazu Yashiro na Japonskem Oita Medical kirurgijo [20]. Stabilna drog odporna celična linija OCUM-2MD3 /L-OHP2 smo pridobili s pomočjo kultiviranja in izbora, ki ga naše raziskovalne skupine. celično linijo GSE-1 je bila kupljena iz celice Resource Center v Šanghaju inštitutov za biološke vede kitajske akademije znanosti. RPMI 1640 gojišče in tripsina smo nabavili pri Gibco družbe; Trizol reagent in Lipofectamine 2000 transfekciji reagent smo nabavili pri Invitrogen. Za povratne prepis kit in fluorescence kvantitativno PCR reagenti so bili pridobljeni iz Promega Corporation. PCR in mala motečih RNA smo sintetizirali Shanghai biološki Engineering Company. Komplet ekstrakcijo protein je bila pridobljena iz Beyotime Company, Kitajska. Primarna protitelesa proti HIF-1 a, MDR1 /P-gp, GST-Õ, LRP, Bcl-2, TS ali GAPDH so bile kupljene od Santa Cruz. MTT smo dobili od Sigma. Naša raziskava je odobril odbor za etiko četrte odvisnimi bolnišnici Hebei Medical University.

1.2 Priprava kliničnih vzorcev

smo izbrali Vseh 65 bolnikov z GC po želodca resekcijo in patološkega potrditev v četrti bolnišnica Hebei Medical University, vključno s 42 moških in 23 žensk, starih 60,5 ± 8,1 let, ki še niso prejeli preoperativno obsevanje ali kemoterapijo. Rak in para-karcinoma tkiva (približno 1,0 cm x 0,5 cm x 0,5 cm) so bili odvzeti iz vsakega pacienta, in so bili osebki hitro zamrznili v tekočem dušiku in nato prenese na -80 ℃ ohranitev. Vsi udeleženci podpisali soglasje za informirano.

1,3 celične kulture in transfekciji

OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OHP in GSE-1 celične linije smo kultivirali v RPMI 1640 medija dopolniti z 10% fetalni goveji serum (FBS), 100U /ml penicilina in 100 mg /ml streptomicina. Predvsem je medij za OCUM-2MD3 /L-OHP celic zdravijo z L-PDP v koncentraciji 75μg /ml, da ohranijo svoj drog odpornost fenotip, en teden pred operacijo za zdravljenje prekiniti. Celice smo inkubirali v navlaženi 5% CO _{2 atmosferi pri 37 ° C}

Tri HIF-1α-siRNA sekvenc so namenjeni uporabi BLOK-iT RNAi Designer (zaporedje 1:. GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; zaporedje 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; sekvenca 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), od katerih vsak je žarimo z njihovo komplementarno sekvenco in transfektiramo oziroma v OCUM-2 MD3 /L-OHP GC celicah. Ne-specifični siRNA sekvenca (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) smo uporabili kot negativno kontrolo. Je posnemovalna zaporedje miR27a je 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 '. Human celovečerni HIF-1α CODEN zaporedje subkloniramo v pcDNA3.1 vektor. pGL3-miR27a-luc, so bili zgrajeni pcDNA-HIF-1α, pGL3-Osnovna in PRL-TK plazmida in ohranjeni v našem laboratoriju.

GC celice zasejemo v 6 vdolbinami 24 ur pred transfekciji na gostoto 4 x 10 ^{5 celic /ml. Vektorji plazmid, siRNA ali miR27a posnemajo transficiramo v GC celice ali celice zdravila odpornih uporabo transfekciji reagenta Lipofectamine naslednje navodila proizvajalca. Nato smo celice izprali z antibiotiki brez seruma RPMI 1640 primanjkuje. Učinkovitost transfekciji smo merili 24 ur kasneje, nato pa v naslednjih poskusih.}

1,4 MTT test

GC tkiva in normalno para-karcinom tkiva smo homogenizirali za pripravo suspenzije posamezne celice s filtriranjem skozi 300 -mesh baker omrežje. GC celice razgrajene s pomočjo 0,02% EDTA-0,25% tripsina smo zasejali v gostoti 5 x 10 ^{4 celic /ml v 96-vdolbinami. Ko celice dosegel okoli 60% konfluenco, je HIF-1α-siRNA transfektirana ali je bil uporabljen kemoterapevtik droga (150μg /ml L-OHP). Vsaka skupina je sestavljena iz šestih vrtin. Potem 20μl 5 mg /ml MTT dodamo 4 ure pred koncem poskusa. Celice gojimo 4 ure, nato pa smo gojišče zavreči. Naslednji je 150μl DMSO dodamo v vsako jamico in vrednosti OD smo izmerili pri 490 nm s pomočjo bralnika mikroploščnega po stresanju ploščo 15 minut pri sobni temperaturi. Poskuse smo ponovili trikrat.
Izolacija}

1,5 RNK in kvantitativno RT-PCR

Celotna RNA je bila ekstrahirana z uporabo TRIzola metodi enostopenjski in 2 u.g RNA je bila uporabljena za reverzno transkripcijo ustvariti cDNA predlogo. Relativne ravni mRNA smo določili s pomočjo kvantitativne PCR, GAPDH služil kot interni referenčni gena. Parametri PCR so bili, kot sledi: 95 ° C za 5 minut, čemur sledi 45 ciklov denaturacijo pri 94 ° C za 30 sekund in žarjenje pri 60 ° C za 30 sekund. V začetnih oligonukleotidov sekvence so namenjeni uporabi Primer 5.0 in so iskali posebnosti. Temeljni premaz sekvence so naslednji: HIF-1α (93 bp): (F) 5'-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 'in (R) 5'-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3'; MDR1 (126 bp): (F) 5'-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 'in (R) 5'-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3'; GST-π (151 bp): (F) 5'-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 'in (R) 5'-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3'; Bcl-2 (98 bp): (F) 5'-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 'in (R) 5'-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3'; LRP (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'in (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; TS (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 "in (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3 '; in GAPDH (138bp): (F) 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 'in (R) 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'. Kvantitativne rezultate PCR so bili izračunani z uporabo 2 ^{-ΔΔCt metodo}

1,6 Western blot

Vzorci tkiv in celic smo lizirali z uporabo RIPA lize buffer. 1% Triton X-100, 150 mM NaCI, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,2 mM Na3VO4, 0,2 mM fenilmetilsulfonil fluorid in 0,5% NP-40. Enake količine vzorcev beljakovinskih smo ločili na 10% poliakrilamidnih gelih SDS (SDS-PAGE) in so bili elektrotransferiramo na poliviniliden fluorid (PVDF) membrane (Amersham Pharmacia Biotech). Membrane smo blokirali s 5% BSA 2 uri in inkubiramo s primarnim protitelesom preko noči pri 4 ° C. Membrane inkubiramo 2 uri v hrenovo peroksidazo konjugiranih sekundarnega protitelesa. Ciljne trakovi so odkrili s pomočjo povečano kemiluminescenca (ECL) odkrivanja komplet (Santa Cruz, ZDA). β-aktin uporabimo kot endogenega gena kontrole. Poskus smo ponovili trikrat.

1,7 kromatin imunoprecipitacije (chip) preizkus

čip teste smo izvedli po metodi iz Wang et al. [21]. Celice z različno obdelavo bile določene z 1% formaldehida 15 minut pri sobni temperaturi in končamo s končno koncentracijo 0,125 M glicin. Nato smo celice lizirali z uporabo 300μl liznega pufra (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet zaviralci P-40, 0,5% deoksiholat in proteaz). Celične lizate smo sonicirali v ledeni kopeli, da smo dobili kromatina fragmente okoli 600 bp, kot je bilo ocenjeno z agarozno gelsko elektroforezo. Po centrifugiranju pri 13000 obratih na minuto za 10 minut, so bili supernatante in predhodno žogo za 15 minut pri 4 ° C preko inkubacijo s 30μl proteinskih kroglice A-sefaroze in strižejo DNA lososove sperme. Po centrifugiranju pri 13000 obratih na minuto za 5 min smo supernatante razdeljena na tri enake dele: eno za vhod, druga dva za imuno z ali brez HIF-1α protitelesa. Naslednji dan smo imunski kompleksi oborimo z beljakovin A-sefaroze kroglice in strižejo DNA lososove sperme, nato pa so bile krogljice zbrali po dvakrat speremo s pufrom za spiranje I (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCI, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 in 2 mM EDTA), ki ji sledi pranje pufrom II (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 in 2 mM EDTA) in pranje varovalni III (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,25 M LiCl, 1% Nonidet P-40, 1% deoksiholat, in 1 mM EDTA) in končno pranje varovalni IV (10 mM Tris-HCl, pH 8.1 in 1 mM EDTA). Je immunoprecipitates smo eluirali z 200μl elucijskim pufrom (1% SDS in 0,1 M NaHCO _{3), čemur sledi inkubacija pri 65 ° C preko noči. Naslednji dan smo izolirali DNK vsakega vzorca, in PCR smo izvedli, da pomnožimo segmente promotor vsebujejo HIF-1α vezavno mesto.}

1,8 luciferazne teste

Celice gojijo do 70% konfluence in nato smo transfektirali v treh izvodih z pGL3-pokoj-27a-Luc, pcDNA-HIF-1 a ali pGL3-Basic, skupaj z PRL-TK. Po 48 urah po transfekciji smo celice zbrali in merimo luciferazno aktivnost z Dual-luciferaza reporterskega testa sistem (Promega, Madison, WI) po protokolu proizvajalca. Luciferazni dejavnosti PRL-TK so služila kot notranje kontrole.

1.9 Statistična analiza

Rezultati so prikazani kot sredstva ± SD ANOVA in Dunnettov Test je bil izveden s pomočjo SPSS 11,5 programske opreme.

Rezultati

1 HIF-1α in miR27a so različno izražena med želodčno para-karcinoma tkiva in GC tkiva

The izraz HIF-1 a v GC tkivu primerjavi z želodčno para karcinom tkiva smo določili s pomočjo QRT-PCR in Western blot in občutljivost L-OHP celic smo določili s pomočjo MTT testu. HIF-1α (slika 1A, 1B in 1C, qPCR in Western blot) in miR27a (slika 1D, rezultati qPCR) so se regulirane v GC tkivu v primerjavi z želodčno para-karcinoma tkiva. MTT test je pokazala, da je bila stopnja preživetja celic v GC tkiva večja kot v želodčni para-karcinoma tkiva, ko je L-OHP dodana opustitve enocelični tkiva (slika 1E, rezultati histogramov).

2 HIF -1α in miR27a so različno izražena med želodčne sluznice epitelijskih celic linijo in linijo
GC celic

izraz HIF-1 a je bila najvišja v OCUM-2MD3 celic OCUM-2MD3 /L-PDP-ju in, zaporedoma, in je bila najnižja v GES-1 celic (slika 2A, 2B in 2C, qPCR in Western blot). Poleg tega je izraz miR27a prikaže enak trend, v katerem OCUM-2MD3 /L-presevne delovne projektorje celice prikaže najvišji izraz, ki mu sledi OCUM-2MD3 celice in celice GSE-1 prikaže najnižjo izraz pokoj-27a (sl 2D, Rezultati qPCR). MTT testom so pokazali, da, ko je L-OHP dodali tri celičnih linij, OCUM-2MD3 /L-presevne delovne projektorje celice razstavljena najvišjo stopnjo preživetja celica, ki ji sledi OCUM-2MD3 celicah, in da celice GSE-1 razstavljena najnižjo celično preživetje stopnja (slika 2E, rezultati histogramov).

3 HIF-1α-siRNA zavira izražanje miR27a in odpornost na zdravila za OCUM-2MD3 /L-OHP celic

Western analiza blot je pokazala, da ravni mRNA in proteinske HIF-1 a znižal na različnih stopnjah v OCUM-2MD3 /L-OHP celice transfektirane s tremi pari HIF-1 a-siRNA, medtem HIF-1α izraz ni spremenil v celicah transfekciji s krmilno-siRNA. HIF-1α izraz pojavil upadati najbolj strmo, za približno 90%, z uporabo HIF-1 a-siRNA-2 (slika 3A). Kot je prikazano na sliki 3B, HIF-1α izraz zmanjšal v teh celic na način, odvisen od odmerka, pri čemer HIF-1α ekspresija v celicah znižala za več kot 95%, transfektiranih s 80 nm HIF-1α-siRNA-2, ko HIF- 1α-siRNA-2 smo nadalje transfektirali v dozi 20 nM, 40 nM in 80 nM. Poleg tega je bila maksimalna zaviralni učinek zaznali 48 ur po transfekciji (slika 3C).

miR27a izraz se je občutno zmanjšala po transfekciji od MD3 /L-OHP celic OCUM-2 z HIF-1α-siRNA-2 (slika 3D). MTT testom so pokazali, da je bila stopnja preživetja celic znatno zmanjšano naslednjo obdelavo HIF-1α-siRNA-2-transfektirana OCUM-2 MD3 /L-presevne delovne projektorje celice z L-OHP v primerjavi s celicami, ki niso transficirane (Slika 3E).

4 Učinki miR27a o MDR v OCUM-2MD3 /L-OHP celic

izraz miR27a je up-urejena v OCUM-2MD3 /L-OHP celic, ko je bil miR27a mimic so- transfektirali v teh GC celice zdravila odpornih, ki so bile transficirane z HIF-1 a-siRNA (slika 4A). Vendar pa ni bilo bistvene razlike v izražanju HIF-1 a odkrili v OCUM-2MD3 /L-OHP celic po transfekciji (slika 4B in 4C, qPCR in Western blot).

MTT test je pokazala, da je preživetje stopnja OCUM-2MD3 /L-OHP celic je bilo jasno povečal naslednje transfekciji z miR27a posnemajo (slika 4D, rezultati histogramov).

5 HIF-1α inducira transkripcijo miR27a v OCUM-2MD3 celic

izraz HIF-1 a je v OCUM-2MD3 celic transfekciji s evkariontskih izraz plazmida pcDNA-HIF-1 a za 48 ur (slika 5A) bistveno povečala. Poleg tega miR27a izraz je jasno up-urejena (slika 5B). Tako ti rezultati kažejo, da je HIF-1α odločilni faktor, ki vpliva na transkripcijo miR27a. Zato smo vzpostavili luciferazno reporterski gen plazmida, ki nosi zaporedje 2 kb gorvodno od promotorske regije miR27a, ki je sočasno transfektirana z pcDNA-HIF-1 a v celicah. Podatki DLA je pokazala, da pri sočasni transfekciji (slika 5C) HIF-1α okrepljeno aktivnost promotorja miR27a. Analiza čip potrjuje, da HIF-1α direktno vezan na promotorsko regijo miR27a (Slika 5D). Rezultati so pokazali, da se lahko HIF-1α spodbujanje transkripcijo miR27a v OCUM-2MD3 celic neposredno vezavo na promotorsko regijo miR27a.
-Povezana odpornosti

6 Zaviranje HIF-1 a uporabo siRNA zavira izražanje drog geni

Kot je prikazano na sliki 6, zaviranje HIF-1 a dramatično zatreti izražanje MDR1 /p-gp, LRP, in BCL-2 v OCUM-2MD3 /L-OHP celic, vendar ni bistveno spremenila izraz GST-π ali TS. (Slika 6).

7 Zaviranje miR27a zmanjšuje z drogami povezanih z odpornostjo genske ekspresije v OCUM-2MD3 /L-OHP celic

miR27a bila zatrta v drog odpornega GC OCUM-2MD3 /L-presevne delovne projektorje celice, transfektirane z anti-miR27a sekvence (slika 7A). Poleg tega, po tem transfekciji izraz MDR1 /P-gp, LRP in Bcl-2 se je bistveno zmanjšal, medtem ko ni bilo bistvene razlike zaznati v izražanju GST-π ali TS (slika 7B, 7C in 7D, qPCR in zahodne blot). (Slika 7)

Pogovor

Čeprav se zdi svetu stopnja pojavnosti GC, da se je v zadnjih letih visoka pojavnost GC izgine, resno ogroža zdravje posameznika v Aziji [22] . MDR GC celic prispeva k slabo prognozo GC, v katerem igra pomanjkanje kisika odločilno vlogo. V tej študiji smo vzpostavili stabilne OCUM-2MD3 /L-OHP celične linije, ki je odporen na L-PDP-ju. Naši podatki kažejo, da GC tkiva in celične linije kažejo večjo odpornost na zdravila, kot pri navadnih želodca epitelijskih celic in celičnih linij. Prav tako smo ugotovili, da celice drog odporne razvije veliko močnejšo MDR. Naši rezultati so pokazale povečano ekspresijo HIF-1 a v GC tkiv in celičnih linij in najvišji izraz HIF-1 a je bila odkrita v celične linije odporna na zdravila. Zato priporočamo, da HIF-1α prispeva k razvoju MDR v GC celicah.

gen HIF-1α kodira protein, ki je sestavljen iz 826 amino kislin z molekulsko maso 120 kDa [23]. Številne študije so potrdile, da se poveča izražanje HIF-1 a močno povezana z nastankom in razvojem tumorjev [24-28]. Druge študije so pokazale, da prekomerno ekspresijo HIF-1 a izboljšuje lastnosti, odpornih proti zdravilom iz različnih tumorskih celic [29-32]. Poleg tega je naša raziskava pokazala, da GC tkiva in celične linije kažejo večjo odpornost na citostatikov, kot želodcu para-karcinomom tkiv in želodčne sluznice celičnih linij. Prav tako smo odkrili najbolj močan drog odpornost na GC celicah. Vendar pa so mehanizmi, s katerimi HIF-1α ureja MDR še treba jasno opredeliti v GC celicah. Zato bomo še naprej raziskovali učinke HIF-1 a o lastnostih MDR GC celic prek vmešavanja genov in tehnike kloniranja. RNA interferenca (RNAi) je pokazala prednosti v specifičnosti, učinkovitost in trajnost za urejanje ciljne genske ekspresije [33]. Naši podatki kažejo, da inhibicija HIF-1 a bistveno zmanjša odpornost na zdravila v OCUM-2MD3 /L-OHP celic. Poleg tega smo pokazali, da je odpornost na zdravila močno povečala, ko pcDNA-HIF-1α, ki je bila uporabljena za čezmerno HIF-1 a, smo transfektirali v non-zdravilo, odpornih GC celičnih linijah. Naši rezultati so pokazali, da ima HIF-1α ključno vlogo pri razvoju MDR v PK.

Nedavne študije so pokazale, da se MDR tesno povezana z miRNAs v tumorjih [34-36]. Hu je poročala, da se inaktivira MIR-27A se obrne lastnosti MDR GC celic [18]. Poleg tega je bilo poročali, da miR-21, miR-27a so miR-210 in miR-181b navzgor regulirano preko HIF poti v hipoksične okolju, ki temelji na testu gen-chip [19]. V skladu z našimi rezultati smo HIF-1α pozitivno povezana z izražanjem miR-27a GC tkiv in celičnih linij in zaviranje HIF-1 a zmanjšala MIR-27a. V nasprotju s prekomerno ekspresijo HIF-1 a inducirano ekspresijo miR-27a. Ti rezultati so pokazali, da HIF-1α uravnava izražanje miR-27a. Poleg tega je naša raziskava pokazala, da miR-27a posnema rešili lastnosti drog nosilnosti HIF-1 a-rasklapanje celic. Najpomembneje je, HIF-1α neposredno veže in spodbuja miR27a transkripcijo, kar kaže, da HIF-1α ureja MDR z GC preko pokoj-27a.

značilno izražanje genov, ki so tesno povezano z MDR, vključno MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2 in TS, pred in po modulacijo HIF-1α izražanja v GC celicah za pojasnitev mehanizma, s katerim HIF-1α-miR-27a pot regulira MDR z GC . Pokazali smo, da je zaviranje HIF-1 a izražanja zmanjšala izražanje MDR1 /P-gp, LRP in BCL-2. Stopnje izraženosti teh genov so bili bistveno povečala, ko so celice transficirane z miR-27a posnema, pri čemer so ekspresijski nivoji GST-π in TS niso bistveno spremenila. V skladu s to ugotovitvijo, prekomerno ekspresijo HIF-1 a močno navzgor regulirano ekspresijo MDR1 /P-gp, LRP in Bcl-2 v celični liniji GC OCUM-2MD3. Zato so naši podatki kažejo, da je HIF-1α-miR-27a pot posreduje MDR lastnosti v GC z indukcijo MDR1 /P-gp, LRP in Bcl-2 izraz.

Naše študije kažejo, da HIF-1α in miR -27a so up-urejena v GC tkiv in celičnih linij. HIF-1α deluje kot nabavnem regulator pokoj-27a. HIF-1α-miR-27a signalizacijo povečuje lastnosti MDR z indukcijo izražanja MDR1 /P-gp, LRP in BCL-2 v GC. Ti rezultati kažejo, da ima HIF-1α-miR-27a pot ključno vlogo pri začetku MDR v človeški GC, ki lahko služi kot nove terapevtske tarče za MDR v GC.

Podpora Informacije
S1 datoteke. Podatki MTT in zahodne
doi:. 10,1371 /journal.pone.0132746.s001
(ZIP)

• Plos ONE: multiplo Odpornost Related Long nekodiranih Analiza RNA Izražanje Profil želodčnega raka
• Plos ONE: Zakonsko predpisani B Cell Funkcija zavirajo kajenje in debelost pri H. pylori preiskovancih, okuženih in je povezano s povečano tveganje za Rak želodca