PLoS ONE: HIF-1α Induziert multidrug resistance in Magenkarzinomzellen durch Induzierung MiR-27a

Abstrakt

Ziel dieser Studie war die Korrelation zwischen HIF-1α und Ausdruck miR-27a zu bestimmen und die Wirkung zu bewerten Hemmung von HIF-1α-Expression auf miR-27a-Expression und Medikamentenresistenz bei Magenkrebs (GC). In der vorliegenden Studie, Echtzeit-PCR und Western Blot wurden durchgeführt, um die Expression von HIF-1α in GC Geweben und Zelllinien zu erkennen. Dann wurden OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen, die mit HIF-1α-siRNA, einem miR-27a mimischen oder pcDNA-HIF-1α und das Überleben der Zellen wurde über den MTT-Test bestimmt. Die Expression von HIF-1α, miR-27a, und MDR-Genen wurde mittels Echtzeit-PCR und Western-Blot gemessen. ChIP und Dual-Luciferase-Aktivitätsassays wurden durchgeführt, die transkriptionelle Regulation von HIF-1α und miR-27a zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Transfektion mit HIF-1α-siRNA deutlich die Niveaus von miR-27a verringert, was zu einer erheblich verbesserten Hemmung der Proliferationsrate von OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen. Im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen wurde die Überlebensrate in den Zellen signifikant reduziert, transfiziert mit HIF-1α-siRNA nach der Behandlung mit L-OHP. Die Zellüberlebensrate war signifikant in OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen mit dem miR-27a mimischen transfiziert erhöht, während HIF-1α-Überexpression in keiner deutliche Veränderung in das Überleben der Zelle zur Folge haben. Die Ergebnisse des dualen Luciferase-Aktivitätstest zeigte, dass HIF-1α die Transkriptionsaktivität des Promotors in miR27a Zellen mit einem Reportergen-Plasmid, enthaltend das stromaufwärtige Promotor-Region miR27a zusammen mit pcDNA-HIF-1α transfiziert verbessert. ChIP-Analyse vorgeschlagen, dass HIF-1α bindet direkt an die Promotorregion von miR27a. Die Hemmung von HIF-1α oder miR27a Ausdruck verringerte MDR1 /P-gp, LRP und Bcl-2-Expression in OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen. So fanden wir, dass HIF-1α eng mit MDR in GC verbunden ist, und dass HIF-1α durch Hemmen miR-27a Ausdruck

Citation MDR1 /P-gp, LRP und Bcl-2-Expression zu unterdrücken. Zhao Q, Li Y, Tan Bb, Fan Lq, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α induziert multidrug resistance in Magenkarzinomzellen von miR-27a induziert wird. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10.1371 /journal.pone.0132746

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, UNITED STATES

Empfangen: 5. Januar 2015; Akzeptiert: 17. Juni 2015; Veröffentlicht: 20. August 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

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Finanzierung:.. die Landes Natural Science Foundation der Provinz Hebei (Nr H2013206311 zu Qun Zhao)

: Diese Arbeit wurde durch die folgende Zuschuss unterstützt wurde konkurrierende Interessen:. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) gehört zu den häufigsten bösartigen Erkrankungen, verursacht weltweit einen ernsthaften Schaden [1, 2] Nach Jahren technologische Fortschritte in der Diagnose und Behandlung von GC haben ihre Inzidenz und Mortalität sank weltweit aber in den asiatischen Ländern hoch bleiben [3, 4]. Derzeit ist Magenresektion die einzige verfügbare Methode GC zu heilen. Es ist jedoch schwierig, eine vollständige Heilung trotz der chirurgischen Entfernung des Tumors zu erreichen, weil die meisten Patienten mit fortgeschrittenem GC leiden bei der Diagnose [5, 6]. Deshalb spielt die Chemotherapie eine extrem wichtige Rolle in der Gesamtbehandlung von GC. Obwohl die Chemotherapie stark in Bezug auf die Behandlung von fortgeschrittenem GC fortschritt, [7, 8] die Prognose von GC bleibt unzureichend, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 30% [9]. Diese Prognose ist mit dem multidrug resistance (MDR) von GC-Zellen zurückzuführen. MDR in GC führt häufig zum Ausfall der Chemotherapie [10-12]. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen vielversprechende therapeutische Strategien zu entwickeln, um effektiv MDR in GC reduzieren.

Sauerstoffmangel ist weit verbreitet in soliden Tumoren und ist mit einer Vielzahl von biologischen Funktionen in Verbindung gebracht. Derzeit Hypoxie-induzierbaren Faktor (HIF) -1α betrachtet wird eng mit Hypoxie assoziiert ist. HIF-1α wird in einer Vielzahl von malignen Tumoren [13, 14] und wirkt als ein wesentlicher Faktor zur Regulierung der Anpassung von Tumorzellen auf Hypoxie [15] stark exprimiert. HIF-1α wurde eng vorgeschlagen werden, die mit GC MDR [16, 17]. Es ist jedoch unklar, welche Weg die Rolle von HIF-1α in GC MDR vermittelt.

In den letzten Jahren hat sich die Rolle von microRNAs (miRNAs) in der Krebstherapie hat ein weit untersuchte Mechanismus der Tumorinitiierung und Behandlung werden. miR-27a, ein Mitglied der miRNA-Familie, wurde mit dem MDR von GC zu beeinflussen gezeigt [18]. Ferner wird die Expression von miR-27a in einer hypoxischen Umgebung erhöht [19]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HIF-1α kann die Expression von miR-27a und beeinflussen GC MDR regulieren. Jedoch haben die spezifischen Regulationsmechanismen noch aufgeklärt werden. Die vorliegende Studie zeigte, dass die Expression von HIF-1α und miR-27a signifikant hochreguliert in GC Geweben und Zelllinien, insbesondere in resistenten Zelllinien waren.

Transfection mit einem bestimmten kleinen interferierenden RNA endogenen HIF zu blockieren -1α führte zu einer Reduktion in miR-27a-Expression und die Linderung von MDR in GC-Zelllinien. Diese neuen Befunde legen nahe, dass die Hemmung der HIF-1α-Expression unterdrückt die Transkription der MDR-verwandte Gene MDR1 /P-gp, LRP und Bcl-2 MDR von GC-Zellen zu dämpfen durch noch miR-27a-Expression.

Materialien und Methoden

1.1 Werkstoffe

Magen-Zelllinie OCUM-2MD3 von Professor Masakazu Yashiro in Japan Oita Medical Chirurgie war [20]. Die stabile arzneimittelresistente Zelllinie OCUM-2MD3 /L-OHP2 wurde über Züchtung und Auswahl von unserer Arbeitsgruppe erhalten. Die GSE-1-Zelllinie wurde aus der Zelle Resource Center in Shanghai Institutes for Biological Sciences der Chinesischen Akademie der Wissenschaften erworben. RPMI 1640 Kulturmedium und Trypsin wurden von Gibco Company erworben; Trizolreagenz und Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz wurden von Invitrogen bezogen. Die Reverse Transkription-Kit und Fluoreszenz quantitative PCR Reagenzien wurden von Promega Corporation erhalten. PCR-Primer und small interfering RNA wurden von Shanghai Biologische Engineering Company synthetisiert. Das Protein-Extraktions-Kits wurde von Beyotime Company, China erhalten. Primäre Antikörper gegen HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2, TS oder GAPDH wurden von Santa Cruz gekauft. MTT wurde von Sigma erhalten. Unsere Studie wurde von der Ethikkommission der Vierten Affiliated Hospital der Medizinischen Universität Hebei genehmigt.

1.2 Klinische Probenvorbereitung

Alle 65 Patienten mit GC nach Magen-Resektion und pathologische Bestätigung in der Vierten ausgewählt wurden Krankenhaus der Medizinischen Universität Hebei, darunter 42 Männer und 23 Frauen im Alter von 60,5 ± 8,1 Jahre, die keine präoperative Strahlentherapie oder Chemotherapie erhalten hatten. Krebs und para-Karzinomgewebe (etwa 1,0 cm × 0,5 cm × 0,5 cm) wurden von jedem Patienten entnommen und die Proben wurden in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren und anschließend auf -80 ℃ Erhaltungs übertragen. Alle Teilnehmer unterzeichneten die informierte Zustimmung.

1.3 Zellkultur und Transfektion

Die OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OHP und GSE-1-Zelllinien in RPMI 1640-Medium, ergänzt kultiviert wurden, mit 10% fötales Rinderserum (FBS), 100 U /ml Penicillin und 100 mg /ml Streptomycin. Bemerkenswerterweise wurde das Medium der OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen mit L-OHP bei einer Konzentration von 75μg /ml behandelt, um ihre Arzneimittel-Resistenz-Phänotyp zu erhalten, eine Woche vor der Operation, um die Behandlung zu stoppen. . Die Zellen wurden in einem befeuchteten 5% CO _{2 -Atmosphäre bei 37 ° C}

drei HIF-1α-siRNA-Sequenzen wurden unter Verwendung Designer BLOCK-iT RNAi entworfen inkubiert (Sequenz 1: GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; Sequenz 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; Sequenz 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), von denen jede mit ihrer komplementären Sequenz transfiziert und jeweils in die OCUM-2 MD3 /L-OHP GC Zellen geglüht wurde. Eine nicht-spezifische siRNA-Sequenz (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) wurde als Negativkontrolle verwendet. Die miR27a mimetischen Sequenz war 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 '. Mensch voller Länge HIF-1α coden Sequenz wurde in pcDNA3.1-Vektor subkloniert. pGL3-miR27a-luc, pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic und pRL-TK-Plasmide wurden in unserem Labor aufgebaut und konserviert.

Die GC-Zellen in 6-Well-Platten für 24 h vor der Transfektion ausgesät wurden bei eine Dichte von 4 × 10 ^{5 Zellen /ml. Die Plasmidvektoren, siRNA oder miR27a mimic wurde in die GC-Zellen oder arzneimittelresistenten Zellen transfiziert Lipofectamine unter Verwendung des Transfektionsreagenz Anweisungen des Herstellers folgend. Dann wurden die Zellen mit serumfreiem RPMI 1640 fehlen Antibiotika gewaschen. Die Transfektionseffizienz wurde 24 h später gemessen, die von den nachfolgenden Versuchen gefolgt.}

1.4 MTT-Test

GC Gewebe und normalen para-Karzinomgewebe wurde homogenisiert, durch Filtrieren durch eine 300 Einzelzellsuspensionen herzustellen -Mesh Kupfergitter. Die GC-Zellen verdaut 0,02% EDTA-0,25% Trypsin wurden in einer Dichte von 5 x 10 ^{4 Zellen /ml in 96-Well-Platten ausgesät. Sobald die Zellen etwa 60% Konfluenz, HIF-1α-siRNA erreicht wurde, transfiziert oder ein chemotherapeutisches Medikament (150 ug /ml L-OHP) angewendet wurde. Jede Gruppe bestand aus sechs Brunnen. Dann wird 20 ul von 5 mg /ml MTT wurde 4 h vor dem Ende des Experiments zugegeben. Die Zellen wurden für 4 h kultiviert, und dann wurde das Kulturmedium verworfen. Als nächstes 150 ul DMSO wurde in jede Vertiefung gegeben, und die OD-Werte bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät gemessen wurden, nachdem die Platte für 15 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Die Experimente wurden dreimal wiederholt.}

1.5 RNA-Isolierung und quantitative RT-PCR

Gesamt-RNA extrahiert wurde Trizol Ein-Schritt-Verfahren, und 2 ug RNA wurde für die reverse Transkription verwendet Matrizen-cDNA zu erzeugen. Die relativen mRNA-Spiegel wurden mittels quantitativer PCR bestimmt, diente GAPDH als interne Referenzgens. Die PCR-Parameter waren wie folgt: 95 ° C für 5 min von 45 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 30 s und Tempern bei 60 ° C für 30 s. Die Primer-Sequenzen wurden unter Verwendung Primer 5.0 entworfen und wurden auf ihre Spezifität gesucht. Die Primersequenzen sind wie folgt: HIF-1α (93 bp): (F) 5'-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 'und (R) 5'-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3'; MDR1 (126 bp): (F) 5'-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 'und (R) 5'-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3'; GST-π (151 bp): (F) 5'-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 'und (R) 5'-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3'; Bcl-2 (98 bp): (F) 5'-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 'und (R) 5'-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3'; LRP (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'und (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; TS (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'und (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; und GAPDH (138bp): (F) 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 'und (R) 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'. Die quantitativen PCR-Ergebnisse wurden die 2 berechnet ^{-ΔΔCt Methode}

1.6 Western-Blot

Die Gewebe- und Zellproben lysiert wurden unter Verwendung von RIPA Lysepuffer. 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,2 mM Na3VO4, 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 0,5% NP-40. Gleiche Mengen der Proteinproben wurden auf den Polyacrylamid-SDS-Gelen (SDS-PAGE) von 10% abgetrennt und wurden auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran (Amersham Pharmacia Biotech) elektrotransferiert. Die Membranen wurden mit 5% BSA für 2 h inkubiert und mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C blockiert. Die Membranen wurden für 2 h in einem Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert. Die Zielbänder wurden unter Verwendung einer verstärkten Chemilumineszenz (ECL) Detection Kit (Santa Cruz, USA) nachgewiesen. β-Actin wurde als endogene Kontrolle Gen verwendet. Das Experiment wurde dreimal wiederholt.

1,7 Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -Assay

ChIP-Tests wurden durchgeführt nach dem Verfahren von Wang et al. [21]. Zellen mit unterschiedlichen Behandlungs wurden für 15 min bei Raumtemperatur mit 1% Formaldehyd fixiert und mit einer Endkonzentration von 0,125 M Glycin beendet. Dann wurden die Zellen unter Verwendung von 300 ul Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,5% Desoxycholat, und Protease-Inhibitoren). Die Zelllysate wurden in Eiswasserbad beschallt an Chromatin-Fragmente etwa 600 bp ergeben, wie durch Agarose-Gelelektrophorese beurteilt. Nach Zentrifugation für 10 min bei 13000 Upm wurden die Überstände entnommen und 15 min mit 30 ul Protein A-Sepharose-Kügelchen bei 4 ° C über Inkubation vorge gelöscht und Lachssperma-DNA geschert. Nach Zentrifugation für 5 min bei 13000 rpm wurden die Überstände in drei gleiche Teile unterteilt: eine für die Eingabe, die beiden anderen für die Immunpräzipitation mit oder ohne HIF-1α-Antikörper. Am nächsten Tag wurden die Immunkomplexe wurden mit Protein A-Sepharose-Kügelchen gefällt und Lachssperma-DNA geschert, dann wurden die Perlen gesammelt, nachdem zweimal mit Waschpuffer I (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl, 0,1% gewaschenen SDS, 1% Triton X-100 und 2 mM EDTA), gefolgt von Waschpuffer II (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 und 2 mM EDTA) und Waschpuffer III (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,25 M LiCl, 1% Nonidet P-40, 1% Desoxycholat und 1 mM EDTA), und die endgültige Waschpuffer IV (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, und 1 mM EDTA). Die Immunpräzipitate wurden durch 200 ul Elutionspuffer (1% SDS und 0,1 M NaHCO _{3), gefolgt von Inkubation bei 65 ° C über Nacht eluiert. Am nächsten Tag wurde die DNA jeder Probe isoliert, und die PCR wurde ausgeführt, um die Promotorsegmente zu verstärken, um eine HIF-1α-Bindungsstelle enthält.}

1.8 Luciferasetests

Zellen zu 70% Konfluenz gezüchtet und dann wurden in dreifacher Ausfertigung mit pGL3-miR-27a-luc, pcDNA-HIF-1α oder pGL3-Basic, zusammen mit pRL-TK transfiziert. Nach 48 h der Transfektion wurden die Zellen gesammelt und die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung des Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) gemessen nach dem Protokoll des Herstellers. Die Luciferase-Aktivitäten von pRL-TK wurden als interne Kontrolle diente.

1.9 Statistische Analyse

Die Ergebnisse werden als Mittel ± S. D. präsentiert ANOVA und Dunnett-Test wurde mit SPSS 11.5 Software.

Ergebnisse |

1 HIF-1α und miR27a differentiell zwischen Magen-para-Karzinomgewebe und GC Gewebe

Die ausgedrückt Expression von HIF-1α in GC Gewebe verglichen mit Magen para-Karzinomgewebe wurde mittels qRT-PCR und Western-Blot und die Empfindlichkeit von L-OHP-Zellen wurde durch den MTT-Assay bestimmt. HIF-1α (1A, 1B und 1C, qPCR und Western-Blot) und miR27a (1D, qPCR Ergebnisse) wurden hochreguliert in GC Gewebe verglichen magen para-Karzinomgewebe. Der MTT-Test zeigte, dass die Zellüberlebensrate in GC Gewebe größer war als im Magen-para-Karzinomgewebe, wenn L-OHP auf die Einzelzellgewebesuspensionen (1E, Histogramm-Ergebnisse) hinzugefügt.

2 HIF -1α und miR27a zwischen einer Magenschleimhaut epithelialen Zelllinie und einer GC-Zelllinie

die Expression von HIF-1α war die höchste in OCUM-2MD3 /L-OHP und OCUM-2MD3 Zellen unterschiedlich exprimiert, der Reihe nach, und war die niedrigste in GES-1-Zellen (2A, 2B und 2C, qPCR und Western Blot). Darüber hinaus zeigten die Expression von miR27a den gleichen Trend, bei dem OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen den höchsten Ausdruck angezeigt, gefolgt von OCUM-2MD3 Zellen und GSE-1-Zellen zeigten die niedrigsten Expression von miR-27a (Abb 2D, qPCR Ergebnisse). Der MTT-Test ergab, dass bei der L-OHP zu den drei Zelllinien hinzugefügt wurde, OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen die höchste Zellüberlebensrate zeigte, gefolgt von OCUM-2MD3 Zellen, und dass GSE-1-Zellen zeigten die niedrigste das Überleben der Zelle Rate (2E, Histogramm-Ergebnisse).

3 HIF-1α-siRNA unterdrückt die Expression von miR27a und die Medikamentenresistenz von OCUM-2MD3 /L-OHP Zellen

Western-Blot-Analyse zeigte, dass die mRNA und Proteinmengen von HIF-1α verringert in unterschiedlichem Ausmaß in OCUM-2MD3 /L-OHP mit drei Paaren von HIF-1α-siRNA transfizierten Zellen, während HIF-1α-Expression in den mit Kontroll-siRNA transfizierten Zellen nicht ändern. HIF-1α Expression schien am steilsten sinken, um etwa 90%, HIF-1α-siRNA-2 (3A) verwendet wird. Wie in 3B gezeigt ist, HIF-1α verringerte Expression in diesen Zellen in einer dosisabhängigen Art und Weise, in der HIF-1α-Expression von mehr als 95% in Zellen, die mit 80 nM HIF-1α-siRNA-2, verringert wird, wenn HIF bei einer Dosis von 20 nM, 40 nM oder 80 nM 1α-siRNA-2 wurde weiter transfiziert. Zusätzlich wurde die maximale Hemmwirkung 48 h nach der Transfektion (3C) festgestellt.

miR27a Expression wurde signifikant verringert nach Transfektion der OCUM-2 MD3 /L-OHP-Zellen mit HIF-1α-siRNA-2 (Fig 3D). Der MTT-Assay zeigte an, dass die Zellüberlebensrate signifikant nach der Behandlung von HIF-1α-siRNA-2-transfizierten OCUM-2 MD3 /L-OHP-Zellen mit L-OHP Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen (Fig 3E) reduziert wurde.

4 Effekte von miR27a auf dem MDR von OCUM-2MD3 /L-OHP Zellen

die Expression von miR27a hochreguliert wurde, als die miR27a Mimik war Co- Transfektion in diese arzneimittelresistenten GC-Zellen, die mit HIF-1α-siRNA (4A) transfiziert worden waren. Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied in der Expression von HIF-1α detektiert in OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen nach Transfektion (4B und 4C, qPCR und Western Blot).

Der MTT-Test, dass das Überleben zeigten Rate von OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen wurde nach der Transfektion mit dem miR27a Mimik (4D, Histogramm-Ergebnisse) deutlich erhöht.

5 HIF-1α induziert die Transkription von miR27a in OCUM-2MD3 Zellen

die Expression von HIF-1α wurde in OCUM-2MD3 Zellen, transfiziert mit dem eukaryontischen Expressionsplasmid pcDNA-HIF-1α für 48 h (5A) signifikant erhöht. Darüber hinaus war miR27a Ausdruck deutlich hochreguliert (5B). Somit vorgeschlagen diese Ergebnisse, dass HIF-1α ein kritischer Faktor ist, der die Transkription von miR27a auswirkt. Daher haben wir ein Luciferase-Reportergen-Plasmid, das ein 2 kb Sequenz stromaufwärts der Promotorregion des miR27a trägt, die mit pcDNA-HIF-1α in die Zellen co-transfiziert. Die DLA Daten zeigten, dass HIF-1α die Promotoraktivität von miR27a folgenden Cotransfektion (Fig 5C) verbessert. ChIP-Analyse bestätigte ferner, dass HIF-1α direkt gebunden an die Promotorregion von miR27a (5D). Die Ergebnisse zeigten, dass HIF-1α durch direkte Bindung an die Promotorregion von miR27a.

6 Hemmung der HIF-1α Verwendung siRNA unterdrückt die Expression von Arzneimittel-Resistenz-bezogene die Transkription miR27a in OCUM-2MD3 Zellen fördern Gene

Wie in 6 gezeigt, ist die Hemmung von HIF-1a dramatisch die Expression von MDR1 /P-gp unterdrückt, LRP und Bcl-2 in OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen, aber nicht signifikant verändern die Expression von GST-π oder TS. (Bild 6).

7 Hemmung von miR27a reduziert der Arzneimittelresistenz-verbundene Genexpression in OCUM-2MD3 /L-OHP Zellen

miR27a wurde in arzneimittelresistenten GC verdrängten OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen, transfiziert mit dem Anti-miR27a Sequenz (7A). Darüber hinaus nach dieser Transfektion die Expression von MDR1 /P-gp, LRP und Bcl-2 wurde signifikant verringert, während kein signifikanter Unterschied in der Expression von GST-π oder TS detektiert wurde (7B, 7C und 7D, qPCR und West Blot). (Bild 7)

Diskussion

Obwohl die weltweite Inzidenz von GC scheint in den letzten Jahren zurückgegangen zu sein, eine hohe Inzidenz von GC weiterhin besteht, ernsthaft die Gesundheit der Menschen in Asien zu gefährden [22] . Der MDR von GC-Zellen trägt zur schlechten Prognose von GC, in denen Sauerstoffmangel eine entscheidende Rolle spielt. In der vorliegenden Studie haben wir die stabile OCUM-2MD3 /L-OHP-Zelllinie, die auf L-OHP resistent ist. Unsere Daten zeigten, dass GC Geweben und Zelllinien eine etwas stärkere Medikamentenresistenz als normale Magen-epithelialen Geweben und Zelllinien. Wir fanden auch, dass arzneimittelresistente Zellen entwickeln viel stärker MDR. Unsere Ergebnisse zeigten Expression von HIF-1α in GC Geweben und Zelllinien erhöht, und die höchste Expression von HIF-1α wurde in einer arzneimittelresistente Zelllinie detektiert. Deshalb schlagen wir vor, dass HIF-1α die Entwicklung von MDR in GC-Zellen beiträgt.

Das HIF-1α-Gen für ein Protein kodiert, das mit einem Molekulargewicht von 120 kDa von 826 Aminosäuren besteht [23]. Viele Studien haben bestätigt, dass eine erhöhte Expression von HIF-1α stark mit dem Auftreten und die Entwicklung von Tumoren [24-28] zugeordnet ist. Andere Studien haben vorgeschlagen, dass eine Überexpression von HIF-1α die arzneimittelresistenten Eigenschaften einer Vielzahl von Tumorzellen erhöht [29-32]. Darüber hinaus ist unsere Studie zeigte, dass GC Geweben und Zelllinien eine etwas stärkere Resistenz gegenüber Chemotherapeutika als Magen-para-Karzinom Gewebe und Magenschleimhaut Zelllinien. Wir haben festgestellt auch die stärkste Medikamentenresistenz in GC-Zellen. Jedoch sind die Mechanismen, durch die HIF-1α reguliert MDR noch deutlich in GC-Zellen identifiziert werden. Daher untersuchten wir die Effekte von HIF-1α an den MDR Eigenschaften von GC-Zellen über Gen Störungen und Klonierungstechniken. RNA-Interferenz (RNAi) hat Vorteile in der Spezifität, Effizienz und Haltbarkeit für die Regulation der Expression des Zielgens angezeigt [33]. Unsere Daten zeigen, dass die Hemmung von HIF-1α signifikant drug resistance reduziert in OCUM-2MD3 /L-OHP-Zellen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Arzneimittelresistenz drastisch erhöht wurde, als pcDNA-HIF-1α, die verwendet wurde, HIF-1α überexprimiert, in nicht-arzneimittelresistenten GC-Zelllinien transfiziert wurde. Unsere Ergebnisse zeigten, dass HIF-1α eine wichtige Rolle in der Entwicklung von MDR in GC spielt.

Neue Studien haben gezeigt, dass MDR eng mit miRNAs in Tumoren [34-36] in Beziehung steht. Hu hat berichtet, dass miR-27a Inaktivierung der MDR Eigenschaften von GC-Zellen können umgekehrt [18]. Außerdem wurde berichtet, dass miR-21, miR-27a, miR-210 und miR-181b wurden hochreguliert über das HIF-Weg in der hypoxischen Umgebung basierend auf einem Gen-Chip-Assay [19]. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen, HIF-1α war positiv mit der Expression von miR-27a in GC Geweben und Zelllinien verbunden sind, und die Hemmung der HIF-1α verringert miR-27a. Im Gegensatz dazu ist die Überexpression von HIF-1α induzierte die Expression von miR-27a. Diese Ergebnisse zeigten, dass HIF-1α, die Expression von miR-27a reguliert. Darüber hinaus ist unsere Studie zeigte, dass miR-27a ahmt die Arzneimittelresistenz Eigenschaften von HIF-1α-Zellen gerettet Knockdown. Am wichtigsten ist, HIF-1α bindet direkt an und fördert miR27a Transkription, die anzeigt, dass HIF-1α die MDR von GC über miR-27a reguliert.

Wir gekennzeichnet die Expression von Genen, die eng verknüpft sind mit MDR, einschließlich MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2 und TS, vor und nach der Modulation von HIF-1α-Expression in GC-Zellen durch die den Mechanismus aufzuklären die HIF-1α-miR-27a-Weg des MDR von GC reguliert . Wir haben gezeigt, dass die Hemmung von HIF-1α Expression die Expression von MDR1 /P-gp, LRP und Bcl-2 reduziert. Die Expressionsniveaus dieser Gene wurden signifikant erhöht, wenn die Zellen mit dem miR-27a transfiziert wurden mimic, während die Expression von GST-π und TS nicht signifikant verändert. In Übereinstimmung mit diesem Befund Überexpression von HIF-1a-potent die Expression von MDR1 /P-gp, LRP und Bcl-2 in der GC OCUM-2MD3 Zelllinie nach oben reguliert. Deshalb zeigen unsere Daten, dass die HIF-1α-miR-27a Weg GC MDR Eigenschaften in durch Induktion MDR1 /P-gp, LRP und Bcl-2-Expression vermittelt.

Unsere Studien zeigen, dass HIF-1α und miR -27a sind in GC Geweben und Zelllinien hochreguliert. HIF-1α wirkt als stromauf Regulator der miR-27a. HIF-1α-miR-27a-Signalisierung verbessert die Eigenschaften von MDR durch Induktion der Expression von MDR1 /P-gp, LRP und Bcl-2 in GC. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die HIF-1α-miR-27a-Weg eine entscheidende Rolle bei der Initiierung von MDR in menschlichen GC spielt, die als neuartiges therapeutisches Ziel für MDR in GC dienen kann.

Hintergrundinformationen
S1 Datei. Daten von MTT und Western Australia doi:. 10.1371 /journal.pone.0132746.s001
(ZIP)

• PLoS ONE: Multidrug-Resistance Verwandte Lange nicht-kodierenden RNA-Expression Profil Analyse von Magenkrebs
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