PLOS ONE: Multiple-to-múltiplas relações entre microRNAs e genes alvo em gástrica Cancer

Sumário

Os microRNAs (miRNAs) agem como reguladores da transcrição e têm um papel central na carcinogênese. De acordo com os bancos de dados alvo de miRNA, um miRNA pode regular muitos genes como os seus alvos, enquanto um gene pode ser alvo de muitos miRNAs. Estes achados indicam que as relações entre os seus alvos miARNs e pode não ser um-para-um. No entanto, numerosos relatórios têm descrito apenas de um-para-um, um-para-múltipla ou de múltipla-para-um entre miARN e do seu gene alvo em cancros humanos. Assim, é necessário para determinar se ou não uma combinação de algumas miARNs regularia múltiplos alvos e ser envolvidos na carcinogénese. Para encontrar alguns grupos de miRNAs que podem sinergicamente regulam as suas metas no cancro gástrico humano (GC), nós re-analisados ​​os dados de matriz expressão miRNA anterior e descobriu que 50 miRNAs foram regulados positivamente no tratamento com 5-aza-2'-desoxicitidina numa linha celular de GC. O "TargetScan" banco de dados alvo miRNA previu que alguns destes miRNAs têm genes alvos comuns. Também se refere à base de dados GEO para a expressão desses genes-alvo comuns em GCs humana, que podem estar relacionados à carcinogênese gástrica. Neste estudo, foram analisadas duas combinações de miRNA, miR-224 e -452, e miR-181C e -340. Sobre-expressão de ambas as combinações de miRNA dramaticamente regulada para baixo seus genes-alvo, DPYSL2
e KRAS
, e KRAS Comprar e MECP2
, respectivamente. Estas combinações de miARN sinergicamente diminuição da proliferação de células por transfecção. Além disso, revelou que estes miRNAs foram regulada através de hipermetilação do promotor em células GC. Assim, é provável que as relações entre os seus alvos miARNs e não são um-para-um, mas de múltipla-a múltiplos em GC, e que estes relacionamentos complexos podem ser relacionadas com a carcinogénese gástrica

citação:. Hashimoto Y, Akiyama Y, Yuasa Y (2013) Multiple-to-múltiplas relações entre microRNAs e genes alvo em câncer gástrico. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10.1371 /journal.pone.0062589

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 14 Dezembro, 2012; Aceito: 24 de março de 2013; Publicado em: 08 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hashimoto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Programa Foresight A3 da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) (AA) e bolsas de investigação da JSPS para Jovens cientistas (YH). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNAs (miARNs), uma classe de pequenos RNAs não codificante-proteína, foram identificadas como um novo tipo de regulador do gene que se ligam às regiões não traduzidas 3 '(UTRs) de ARNm alvo, resultando assim na degradação do mRNA ou o bloqueio da tradução de ARNm [1]. É geralmente conhecido que as alterações de miARN estão associados com tumorigénese [1]. De acordo com os bancos de dados alvo de miRNA, um miRNA pode regular muitos genes como os seus alvos, enquanto um gene pode ser alvo de muitos miRNAs. No entanto, numerosos estudos revelaram uma relação de um-para-um entre miARN e do seu gene alvo. Também tem sido relatado que múltiplo ou um agrupamento de miARNs cooperativamente regular um gene, que está relacionada com a carcinogénese [2] - [4]. Por outro lado, vários genes são alvo de um miARN [3], [4]. Mesmo múltipla-to-múltiplas relações entre miRNAs e metas têm sido relatados por meio de análises computacionais [5], [6]. No entanto, tem havido apenas alguns documentos validando experimentalmente relações múltiplas-a-múltiplos em células cancerosas.

O câncer gástrico é a quarta doença maligna humana mais comum ea segunda causa mais frequente de morte relacionada ao câncer em todo o mundo, com uma estimativa de um milhão de novos casos por ano [7]. cancros gástricos são histologicamente classificados em dois tipos principais, os tipos intestinal e difuso [8]. -Tipo difuso GC é muitas vezes intratável e apresenta um prognóstico pobre paciente. Recentemente, foi demonstrado que a perda das funções CDH1 e Trp53 induz tipo GC difusa utilizando modelos de ratos [9]. Embora esta descoberta vai nos ajudar a desenvolver novas terapias humanas gástricas cancro, novas investigações sobre a carcinogênese gástrica mecanismos moleculares subjacentes são necessário desenvolver outras abordagens para a terapia-alvo.

Promotor CpG ilha hipermetilação é um dos mecanismos mais comuns pelo qual os genes supressores de tumores são inactivados em cancros humanos [10]. Recentemente, tornou-se evidente que alguns miRNAs também são alvos de silenciamento epigenético em cânceres [11]. Os nossos e outros grupos demonstraram anteriormente que farmacológica ou perturbação genética de metilação de ADN em linhas celulares de cancro induz a sobre-regulação de um número substancial de miARNs [12] - [15]. Estes dados levou à identificação de miARNs tumor-supressor candidatos cuja silenciamento está associada com CpG island methylation. Até agora, a metilação dos membros da família de miR-124 foi identificado no cancro colo-rectal e em tumores de outros órgãos [11]. Além disso, o cluster /c miR-34b tem uma ilha típica CpG, e é regulada através de metilação frequente em colorectal e cancro gástrico [12]. Da mesma forma, verificou-se que a metilação do miR-181C está associada a carcinogênese gástrica através da regulação de genes oncogénicos KRAS Comprar e NOTCH4
[13]. Infra-regulação de muitos miRNAs através de metilação ocorre simultaneamente nas células cancerosas, e pode melhorar as relações múltiplas-to-múltipla entre miRNAs e metas.

Neste estudo, para validar múltiplos-to-múltiplas relações entre miRNAs e metas em células cancerosas, demonstramos que dois pares de vários miRNAs, miR-224 e -452, e miR-181C e -340, teve vários genes-alvo e sinergicamente diminuiu a proliferação celular através da regulação de seus alvos em células GC humanos.

resultados

50 miRNAs foram regulados positivamente em uma linha de células GC, KATO-III, depois de 5-aza-2'-desoxicitidina Tratamento

Para identificar miRNAs candidatos que afetam sinergicamente sua genes-alvo, nós re-analisados ​​os nossos dados de microarranjos anteriores (adesão GEO No. GSE16006) [13]. Considerou-se que os níveis de miARN foram regulados positivamente no tratamento com 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza-CdR), quando as intensidades líquidas de 3 pontos particulares foram mais do que 1,5 vezes. miARNs Além disso, também seleccionados dos quais foram encontradas as médias de ser aumentada mais do que 3 vezes na análise de microarray. Com base nesses novos critérios, descobrimos que 50 miRNAs foram up-regulada de uma linha de células de GC, KATO-III (Tabela S1). Foi confirmada a sobre-regulação de 5 de 6 miARNs precursores representativos, isto é, o miR-145, -148a, -152, -224 e -340, depois de 5-aza-CdR tratamento por RT-PCR (Figura 1A).

TargetScan Previsto genes alvo comum dos miRNAs candidatos

para determinar se ou não epigenetically miRNAs regulados têm genes alvo comuns, que procurou o banco de dados TargetScan (versão 5.1) para os seus objectivos comuns. De acordo com TargetScan, 50 miARNs poderiam ser classificados em 46 grupos com base nas suas sequências de sementes. TargetScan também mostrou que esses 46 grupos podem atingir 6.460 genes. Entre estes genes alvo, que seleccionado de 13 expressão que foi relatado para ser aumentada em GC na base de dados GEO (adesão GEO No. GSE2685) ou pode ser relacionada com a carcinogénese gástrica (Tabela S2). Aqui, vamos nos concentrar em quatro miRNAs, miR-152, -181c, -224 e -340, porque temos já informou que miR-181C é epigenetically regulada para baixo em GC [13] e ilhas CpG estão localizados nas regiões a montante de três outros miARNs (Figura 2A e C, e a Figura S1). Figura 2a também revela que miR-452 está agrupado com o miR-224. TargetScan previu que os cinco miRNAs pode regular alvos comuns. Por exemplo, DPYSL2
(dihydropyrimidinase-like 2, também conhecido como colapso resposta proteína mediador 2, CRMP2
) é alvo de miR-224, -452 e -181c, KRAS
por miR-224, -452, -181c, -340 e -152, e MECP2
(proteína de ligação metil CpG 2) por miR-181C e -340, respectivamente (Figura 3).

a expressão de miR-224, -452, -152 e -340 Diminuição no DNA hipermetilação em linhas de células GC

Foi examinado o envolvimento de alterações epigenéticas em infra-regulação dos miRNAs. A expressão de miR-224, -340 e -152 foi aumentado de 5-aza-CdR tratamento em várias linhas celulares de GC (Figura 1B). Nós analisada quantitativamente expressão madura miR-224 em 9 linhas de células de GC e uma linha celular de cancro colorrectal (CRC). Nenhuma expressão de miR-224 foi detectado em sete das 10 linhas celulares de cancro (Figura 1C). Também foi avaliada a alteração do aglomerado de miR-224 /-452 em células KATO-III tratados com uma dose baixa de 5-aza-CdR (0,2 umol /L), um inibidor da histona desacetilase expressão, tricostatina A (TSA, 0,3 umol /l), ou uma combinação das duas drogas. células KATO-III com tratamento de baixa dose de 5-aza-CdR exibiram sobre-regulação do aglomerado de miR-224 /-452, ao passo que o TSA por si só não provocou a sobre-regulação. O cluster de miR-224 /-452 foi sinergicamente regulados positivamente em células KATO-III com o combinado de 5-aza-CdR e tratamento de TSA (Figura 1D). Estes resultados indicam que o miR-224 e miR-452 pode ser regulada para baixo através de metilação de ADN em linhas de células de GC como a mesma unidade de transcrição.

tem sido relatado que miARNs intrónicas são regulados através de metilação do promotor do seu hospedeiro genes [14], [15]. De acordo com os resultados da análise computacional, o miR-224 /-452 aglomerado e miR-340 está localizado no intrão 6 em GABRE
e o intrão 2 em RNF130
, respectivamente, ambas as quais contêm ilhas CpG densas apenas nas suas regiões promotoras de genes hospedeiros (Figura 2A e C). Foi investigada a relação entre os níveis de expressão destes miARNs e o estado de metilação de seus genes do hospedeiro em linhas celulares por análise de GC MSP. linhas celulares GC sem miR-224 expressão exibiram apenas sinais de metilação, enquanto que as linhas celulares de expressão positivo exibiram fortes padrões unmethylation (Figura 2B). Uma relação semelhante foi detectada para miR-340 em linhas de células de GC (Figura 2D). Estes dados indicam que a expressão destes miRNAs em linhas de células de GC pode ser silenciado através de metilação do promotor de seus genes do hospedeiro.

epigenetically miRNAs regulamentados possam estar relacionados com GC Proliferação Celular

Para determinar se epigenetically regulamentada miARNs são tumor-supressor ou não, foi avaliado o efeito de 5-aza-CdR em siDICER1-transfectadas KATO-III e células DICER1 KO HCT116 (D1KO) (Figura 4A). As células HCT-116 não tratadas KATO-III e parentais mostrou proliferação desacelerado após o tratamento com 5-aza-CdR. Por outro lado, em células KATO-III e D1KO siDICER1-transfectadas, o efeito de 5-aza-CdR de tratamento na proliferação celular tornou-se fraca em ambos os casos. Estes resultados sugerem que o efeito de 5-aza-CdR foi diminuída em células de baixa ou nula DICER1, e que miARNs epigeneticamente regulamentados desempenham um papel importante no GC e as células de CRC.

A fim de analisar a relação entre estes miARNs e 13 genes-alvo indicadas na Tabela S2, que transfectadas células KATO-III com siDICER1 e /ou tratadas com 5-aza-CdR. Embora, a expressão de 3 ( DPYSL2
, KRAS
e
MECP2) dos 13 genes foram diminuiu após 5-aza-CdR tratamento, a expressão destes genes fez não alterar a 5-aza-CdR tratamento seguido por transfecção de siDICER1 (Figura 4B).

combinacional transfecção de miR-224 e -452 reprimida GC Proliferação celular

transfectadas com linhas celulares GC miR-224 e /ou -452 imita como um representante de aglomerados de miARN, ou um controlo negativo, e, em seguida, levada a cabo ensaios resolvido em água de tetrazólio (WST-8-8). Setenta e duas horas após a transfecção, observou-se que a expressão ectópica de miR-224 ou -452 suprimiu o crescimento de duas linhas celulares, KATO-III e AGS (Figura 5A). Notavelmente, a transfecção de combinações do miR-224 e -452 imita amplamente diminuiu o crescimento das linhas de células de dois GC (Figura 5A).

O miR-224 /-452 Cluster Co-operatório diminuição da expressão de DPYSL2
e KRAS

para investigar ou não o cluster miR-224 /-452 é realmente relacionados com a regulação da DPYSL2
e KRAS
, analisou-se a expressão de DPYSL2
após a transfecção de células KATO-III e AGS com o cluster de miR-224 /-452 isoladamente ou em conjunto. Realizou-se RT-PCR e análise de Western blot. O DPYSL2
e KRAS
níveis de mRNA foram reduzidos após a transfecção com o miR-224 ou miR-452 mímico (Figura 5B). Interessantemente, no caso de combinações de transfecção com miR-224 e -452, a expressão destes genes alvo era ainda mais regulada para baixo (Figura 5B). A infra-regulação de DPYSL2 também foi observada ao nível das proteínas nas duas linhas celulares (Figura 5C). Também examinamos os níveis de outros cinco genes de expressão, MECP2, MYC, JUNB, MUC1
e SETDB1
, que não foram mostrados como metas para miR-224 ou -452 por TargetScan. Como esperado, não há alterações Expressional destes cinco genes foram encontrados em células KATO-III após a transfecção com o miR-224 ou -452 (Figura S2). Estes dados sugerem que miR-224 e -452 especificamente regulada DPYSL2
e KRAS
.

DPYSL2
foi associado à proliferação celular GC

foi examinado o efeito do knockdown de DPYSL2
, que foi demonstrado ser um alvo do aglomerado de miR-224 /-452, sobre a proliferação celular. A transfecção de DPYSL2
siRNA diminuiu claramente os níveis da DPYSL2
transcrições (Figura 5D) e inibiu o crescimento de células AGS e KATO-III 72 horas após o knockdown de DPYSL2
(Figura 5E), indicando que DPYSL2 tem uma actividade oncogénica.

combinacional transfecção de miR-340 e -181c reprimida Proliferação GC celular, e induziu Down-regulação da KRAS
e MECP2
Expressão

Como um segundo exemplo de relações múltiplas-to-múltipla entre microRNAs e genes-alvo, foi analisada a relação entre miR-340 /-181c e KRAS /MECP2 .
Quando o miR-340 e miR-181C foram usados ​​para transfectar células KATO-III, a proliferação foi sinergicamente sub-regulada por dois miARNs (Figura 6A). Para determinar se ou não epigenetically regulada miR-340 e miR-181C co-operatório afetam seus alvos, foram analisados ​​os níveis de mRNA de KRAS Comprar e MECP2.
Na análise de RT-PCR, KRAS Comprar e MECP2
foram encontrados para ser regulada por miR-340 e miR-181C sozinho, ou transfecção de combinações em células KATO-III (Figura 6B). Como para os quatro genes, MYC, JUNB, MUC1
e SETDB1
, mostrando nenhuns locais previstos para estes dois miARNs por TargetScan, os níveis de expressão foram alterados não neste estudo. Os dados representativos são apresentados na Figura 6B. Assim, os efeitos de miR-340 e -181c podem ser específicos para seus genes-alvo comuns, bem como miR-224 e -452.

Expressão e estado de metilação de miR-224 e -340 nos processos de GC primárias

Foi examinado o estado de metilação de miR-224 e -340 em casos GC primários. padrões metilados de miR-224 foram detectados em 15 dos 26 (57,7%) GC tecidos primários (Figura 7A e Tabela 1). Emparelhado mucosa gástrica não-cancerosas dificilmente exibiu um padrão de metilação do miR-224. A seguir, examinou quantitativamente os níveis de miR-224 em tecidos GC primárias e mucosa não-canceroso correspondente por TaqMan RT-PCR. Observou-se uma redução significativa da expressão de miR-224 em tecidos de GC nos casos de câncer de metilação-positivos em comparação com aqueles em metilação-negativas e mucosas gástrica não-cancerosos (Figura 7C).

Nós ainda analisada a DPYSL2
níveis de mRNA em comparação com o estado de metilação de miR-224 em tecidos GC: GCs com miR-224 metilação (Ca miR-224 MT), GCs com miR-224 unmethylation (Ca miR-224 Un), e não tecidos -cancerous com unmethylation (N miR-224 ONU). O DPYSL2
nível de mRNA no grupo "Ca miR-224 Mt" foi significativamente maior do que os do "N miR-224 Un" e "Ca miR-224 un" grupos, p = 0,049 e p = 0,035, respectivamente (Figura 7D). Assim, existe uma correlação entre o estado de metilação de miR-224 e expressão DPYSL2
em tecidos GC.

A frequência de metilação miR-340 foi relativamente baixa nos tecidos GC primários ensaiados (4 de 26, 15,4%) (Figura 7B e na Tabela 1), enquanto que nenhum dos 26 emparelhado mucosa gástrica não-canceroso exibiram padrões de metilação aparentes de miR-340. Como para miR-152 a análise de metilação, tentámos três conjuntos de iniciadores concebidos na região a montante de miR-152 que contêm ilhas CpG (Figura S1), mas nenhum deles completamente compensada miR-152 expressão em MSP análises (dados não mostrados).

Discussão

Embora tenha sido relatado que a expressão de alguns miARNs é diminuída em vários cancros através de metilação do DNA, a maior parte dos relatórios descreveram que a relação entre a expressão aberrante de miARNs e seus genes alvo era um-para-um, um-para-múltipla ou múltiplos-para-um. Para examinar a possibilidade de relações múltiplas-to-múltipla entre miRNAs e alvos em células cancerosas, nós nos concentramos em duas combinações de miRNAs em células de GC, o miR-224 /-452 cluster, e miR-181C e -340, neste estudo . Nós descobrimos que os dois conjuntos de miRNAs, miR-224 e -452, e miR-181C e -340, teve vários genes-alvo, DPYSL2
e KRAS
, e KRAS
e MECP2
, respectivamente, e diminuiu sinergicamente a proliferação celular em linhas de células humanas de GC. É notável que um oncogene, KRAS
[16], foi encontrada a ser alvo de quatro miRNAs, embora sítios de ligação candidatos dos quatro miRNAs são diferentes no 3'-UTR de KRAS
(TargetScan). Nós relatado anteriormente que miR-181C-regulada NOTCH4
também [13]. Assim, multiple-to-múltiplas relações entre miRNAs e metas foram indicadas não só pelo banco de dados de análises, mas também por experiências de transfecção envolvendo células humanas.

linhas celulares GC miR-224- e /ou -340-expressão-negativos sinais hipermetilação exibidas em análise MSP ea expressão de miR-224 e -340 restaurado em tratamento com o agente de desmetilação. Além disso, a hipermetilação de miR-224 e -340 foi mais frequentemente observada em GCs primários do que mucosas não canceroso correspondente. Em miR-224 casos de metilação-positiva, expressão de miR-224 foi significativamente menor do que nas de metilação-negativo. Estes dados indicam fortemente que a metilação de ADN aberrante é um dos mecanismos fundamentais subjacentes a sub-regulação de miR-224 e -340 em células de GC.

mostrou que a inibição do processamento por miARN siDICER1 ou transfecção utilizando DICER1 nocaute células diminuiu o efeito de 5-aza-CdR, isto é, diminuição da proliferação celular e sub-regulação de genes alvo, em GC e células de CRC. Tem sido relatado que a abundância de DICER1, a enzima que catalisa o passo final de miARN maturação, está directamente relacionado com a progressão tumoral [17]. Estes resultados sugerem que a regulação aberrante de miRNA maturação contribui para GC e formação de CRC.

Nós descobrimos que o cluster de miR-224 /-452 foi aberrante regulada em GCs através hipermetilação. expressão aberrante de miR-224 também foi relatada em outros tumores. Expressão de miR-224, deixe-7f e miR-516a é diminuída em cancro do ovário, e eles sinergicamente regular a expressão da peptidase relacionados com calicreína 10 (KLK10) [18]. miR-224 é regulada negativamente em linhas celulares de CRC metotrexato resistente em comparação com células sensíveis, em [19]. Aqui nós também revelou que o estado de metilação de miR-224 foi correlacionada com a DPYSL2
nível em GCs humano. Tomados em conjunto, o miR-224 desempenha um papel importante como um miARN tumor-supressor em GC, bem como em vários outros tipos de cancro. Em contraste, o miR-224 é regulado para cima em carcinomas hepatocelulares [20] e [21] meduloblastomas em comparação com nos tecidos normais. Assim, mais estudos são necessários para esclarecer o papel de miR-224 na carcinogênese.

Nós investigamos as metas comuns de miRNAs epigenetically down-regulamentados. DPYSL2
foi mostrado para ser regulada por miR-224 e -452. DPYSL2 desempenha um papel importante no estabelecimento da polaridade neuronal [22]. DPYSL2 também está envolvida nas vias que regulam a proliferação de células não neuronais através da sua fosforilação por proteínas reguladoras. DPYSL2 sofre alterações dinâmicas de fosforilação em resposta ao contacto induzida por inibição quiescência e hiperfosforilação de DPYSL2 ocorre num tumor [22]. Embora o papel do DPYSL2 em GC não é claro, a knockdown à base de ARNsi de expressão DPYSL2 induziu uma redução da proliferação nas duas linhas de células de GC, sugerindo actividade oncogénica de DPYSL2.

Em resumo, os nossos resultados indicam que multiple-to-múltiplas relações entre miRNAs e genes-alvo realmente existem na GC. É provável que a metilação aberrante diminui a expressão de múltiplos miARNs-supressora de tumor, tais como o miR-224, -452, -340 e -181c, que, em seguida, induzir a sobre-expressão de múltiplos genes oncogénicos, como KRAS
, DPYSL2
, e MECP2
. Estas relações múltiplas-a-múltiplos anormais entre miARNs e alvos seria um dos importantes mecanismos de carcinogénese gástrica subjacente. É, portanto, altamente possível que as drogas epigenética pode normalizar a expressão de não apenas os genes de tumor-supressor, mas também vários miARNs tumor-supressor, que resultam em diminuições de relações múltiplas-a-múltiplos anormais entre miARNs e objectivos, e assim pode tornar-se excelentes drogas terapêuticas contra o câncer.

Materiais e Métodos

ética Declaração

o consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos, eo comitê de ética da Tokyo Medical and Dental University School of medicina aprovou esta pesquisa.

linhas celulares e Amostras de Tecido

Foram estudados 9 linhas de células GC (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 e GCIY), 2 linhas celulares de CRC (HCT116 e DICER1
nocautear HCT116 [23]), e 26 casos GC primários. MKN45, MKN74, TGBC11TKB e GCIY foram adquiridos a partir de banco de células RIKEN e KATO-III e AGS eram de ATCC (American Type Coleção celular). HSC59, HSC43 HSC58 e foram obtidas do Dr. Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO-III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 e HSC58 foram cultivadas em meio RPMI 1640, e AGS, TGBC11TKB, GCIY e as duas linhas celulares de CRC em Dulbecco modificado meio de Eagle, meio essencial mínimo ou de McCoy 5A, suplementado com 10% de fetal de bovino sérum. espécimes cirurgicamente ressecados de 26 pacientes GC primários foram obtidos aleatoriamente do Hospital Afiliado da Faculdade de Medicina da Tokyo Medical and Dental University.

análise in silico

Nós nos referimos ao banco de dados GEO para miRNA e perfis de expressão gênica (adesão GEO No. GSE16006 e GSE2685). Nós também utilizado banco de dados alvo miRNA "TargetScan".

Droga tratamento de células e RNA Extração

Para estudos desmetilação, as células foram tratadas diariamente com 5 mmol /l 5-aza-CdR (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) durante 72 h. Também células tratadas com 0,3 mmol /l de TSA por si só, e com uma combinação de 0,2 umol /L de 5-aza-CdR e TSA. O ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou uma miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha).

quantitativo em tempo real Transcrição Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase

em tempo real reacção em cadeia com transcrição reversa da polimerase (RT-PCR), as análises foram realizadas utilizando um StepOne real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq master Mix com ROX (Roche, Mannheim, Alemanha), uma Reversa TaqMan kit de transcrição (Applied Biosystems), e ensaios de miARN TaqMan (Applied Biosystems), de acordo com as instruções dos fabricantes. Os níveis de miARN de expressão foram calculados com base na quantidade de miARN alvo em relação à de RNU6B como um controlo para normalizar a entrada inicial de ARN total.

análise de metilação

o tratamento com bissulfito de ADN foi realizada com Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). reacção em cadeia da polimerase (MSP) análises específicas da metilação foram realizados como descrito anteriormente [26]. As sequências dos iniciadores e tamanhos de produtos PCR são mostrados na Tabela S3.

Sintético miARN Transfecção

células KATO-III e AGS foram transfectadas com um precursor da molécula que imita o miR-224, -452, -340 ou -181c, ou sequência mexidos miARN (Sigma) para dar uma concentração final de 25-50 nmol /L usando um electroporador, néon (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. No 24-72 h após a transfecção, as células foram colhidas para análise de Western blot RT-PCR ou.

células

miR-mímica-transf KATO-III e AGS Ensaio de Proliferação
celulares foram semeadas a 1 × 10 ^{3 ou 1 × 10 4 culas por po em placas de 96 poços. A proliferação celular foi avaliada nos dias 1-4 após a transfecção através da determinação do número de células com o reagente de proliferação celular WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japão), de acordo com as instruções do fabricante.}

miARN Previsão Target e Western Blotting

As metas previstas de miRNAs e seus locais-alvo foram analisados ​​utilizando TargetScan. Os níveis dos objectivos previstos em células transfectadas transitoriamente expressão de ARNm foram analisadas 24 h após a transfecção por RT-PCR. As análises de Western blot foram realizados tal como descrito anteriormente [26]. O anticorpo primário utilizado foi o de coelho anti-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Utilizou-se anti-rato α-tubulina (1:1000; sc-8085, Santa Cruz Biotechnology) como um controlo interno para a transferência de Western. Os anticorpos secundários utilizados foram conjugado com fosfatase alcalina anti-IgG de coelho e anti-IgG de ratinho (1:2000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As manchas foram desenvolvidos com ImmunoStar AP Substrato (Bio-Rad Laboratories).

Informações de Apoio
Figura S1.
Representação esquemática do COPZ2 e região contendo miR-152. caixas cheias representam os exons de COPZ2
A e uma caixa em branco denota a região não traduzida de COPZ2
. Uma seta curvada indica o local de início da transcrição da COPZ2
. A seta vertical indica o local de miR-152. As linhas verticais indicam locais de CpG. As setas indicam as regiões examinadas para MSP
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s001
(TIFF)
Figura S2.
Efeitos de transfecção de miR-224 e -452 em células KATO-III. análises de RT-PCR após a transfecção com o miR-224 e /ou -452. A expressão de genes alvo foi analisada 48 horas mais tarde por RT-PCR. miR-224 e -452 especificamente regulada DPYSL2
e KRAS
, mas não outras cinco genes analisados, que são consistentes com os resultados da análise de banco de dados (Figura 3).
doi: 10.1371 /journal.pone.0062589.s002
(TIFF)
Tabela S1.
Perfil de expressão miRNAs humanos em células KATO-III após o tratamento 5-aza-CdR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s003
(XLSX)
Tabela S2. : Lista de genes alvo cuja expressão foi examinada por RT-PCR após o tratamento com ou sem 5-aza-CdR, e transfecção com 20 nmol /L de siDICER1 ou mexidos siARN
doi:. 10.1371 /journal.pone .0062589.s004
(XLSX)
Tabela S3.
Seqüências de primers utilizadas neste estudo
doi: 10.1371. /journal.pone.0062589.s005
(XLSX)

Reconhecimentos

Queremos agradecer Dr. Bert Vogelstein para fornecer a linha celular HCT116 knock-out DICER1.

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• PLOS ONE: Flotillin2 expressão se correlaciona com níveis de HER2 e mau prognóstico no câncer gástrico