PLOS ONE: Multiple-till-flera relationer mellan MicroRNAs och målgener i Gastric Cancer

Sammanfattning

MicroRNAs (miRNA) fungera som transkriptionsregulatorer och spela avgörande roller i karcinogenes. Enligt miRNA mål databaser, kan en miRNA reglera många gener som sina mål, medan en gen kan riktas av många miRNA. Dessa upptäckter indikerar att förhållanden mellan miRNA och deras mål inte kan vara ett-till-ett. Emellertid har många rapporter beskrivs endast en en-till-en, en-till-flera eller multipel-till-ett förhållande mellan miRNA och dess målgen i humana cancrar. Således är det nödvändigt att bestämma huruvida eller inte en kombination av vissa miRNA skulle reglera flera mål och vara delaktiga i cancer. Att hitta några grupper av miRNA som synergistiskt kan reglera sina mål i human magcancer (GC), vi åter analyserade våra tidigare miRNA uttryck array data och fann att 50 miRNAs var uppregleras vid behandling med 5-aza-2'-deoxicytidin i en GC-cellinje. Den "TargetScan" miRNA måldatabasen förutspådde att en del av dessa miRNA har gemensamma målgener. Vi hänvisade också till GEO databas för expression av dessa gemensamma mål gener i human GC, som kan ha samband med gastric cancer. I denna studie analyserade vi två miRNA kombinationer, MIR-224 och -452, och MIR-181c och -340. Överuttryck av både miRNA kombinationer dramatiskt nedregleras deras målgener, DPYSL2 Köpa och KRAS
och KRAS Mössor och MECP2
, respektive. Dessa miRNA kombinationer minskade synergistiskt cellproliferation vid transfektion. Dessutom visade vi att dessa miRNA var nedregleras genom promotor hypermethylation i GC-celler. Således är det troligt att förhållandena mellan miRNA och deras mål är inte ett-till-ett men multipla-till-multipel i GC, och att dessa komplexa förhållanden kan vara relaterade till gastric carcinogenesis

Citation:. Hashimoto Y, Akiyama Y, Yuasa Y (2013) Multiple-till-flera relationer mellan MicroRNAs och målgener i magcancer. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10.1371 /journal.pone.0062589

Redaktör: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Mottagna: 14 december 2012, Accepteras: 24 mars 2013, Publicerad: 8 maj 2013

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från A3 framsynsprogrammet i Japan Society för främjande av Science (JSPS) (YY), och forskningsstipendier JSPS för unga forskare (YH). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

MicroRNAs (miRNA), en klass av små icke-protein-kodande RNA, har identifierats som en ny typ av gen regulator som binder till 3'-otranslaterade regioner (UTR) av mål-mRNA, vilket resulterar i mRNA nedbrytning eller blockaden av mRNA-translation [1]. Det är allmänt känt att miRNA förändringar är associerade med tumorgenes [1]. Enligt miRNA mål databaser, kan en miRNA reglera många gener som sina mål, medan en gen kan riktas av många miRNA. Men många studier visade en ett-till-ett-förhållande mellan miRNA och dess målgenen. Det har även rapporterats att multipel eller ett kluster av miRNA kooperativt reglera en gen, som är relaterad till karcinogenes [2] - [4]. Å andra sidan, finns flera gener måltavla för ett miRNA [3], [4]. Även flera till flera relationer mellan miRNAs och mål har rapporterats med hjälp av beräknings analyser [5], [6]. Däremot har det funnits bara ett fåtal tidningar experimentellt validera flera till flera relationer i cancerceller.

Gastric cancer är den fjärde vanligaste mänskliga maligna sjukdomar och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i hela världen, med uppskattningsvis en miljon nya fall per år [7]. Gastric cancer histologiskt indelas i två huvudtyper, tarm och diffusa typer [8]. Diffusa-typ GC är ofta svår och uppvisar en dålig patient prognos. Nyligen visade vi att förlusten av Cdh1 och Trp53 funktioner inducerar diffus typ GC med hjälp av musmodeller [9]. Även om detta konstaterande kommer att hjälpa oss att utveckla nya mänskliga gastric cancerterapier, ytterligare undersökningar på de molekylära mekanismerna bakom gastric cancer är nödvändigt att utveckla andra metoder för riktad terapi.

Promoter CpG-ö hypermethylation är en av de vanligaste mekanismerna genom vilken tumörsuppressorgener inaktiveras i humana cancrar [10]. På senare tid har det blivit uppenbart att vissa miRNA är också mål för epigenetisk tysta i cancer [11]. Våra och andra grupper har tidigare visat att farmakologisk eller genetisk störning av DNA-metylering i cancercellinjer inducerar uppreglering av ett stort antal miRNA [12] - [15]. Dessa data har lett till identifiering av kandidattumör undertryckande miRNA vars tysta associeras med CpG-ö metylering. Hittills har metylering av MIR-124 familjemedlemmar identifierats i kolorektal cancer och i tumörer i andra organ [11]. Dessutom har Mir-34b /c kluster en typisk CpG-ö, och nedregleras genom täta metylering i kolorektal och gastric cancer [12]. På samma sätt fann vi att MIR-181c metylering är associerad med gastrisk cancer via reglering av onkogena gener KRAS Mössor och NOTCH4
[13]. Nedreglering av många miRNA genom metylering samtidigt sker i cancerceller, och kan öka flera till flera relationer mellan miRNAs och mål.

I denna studie att validera flera till flera relationer mellan miRNA och mål i cancerceller, visade vi att två par av flera miRNA, mIR-224 och -452, och mIR-181c och -340, hade flera målgener och minskade synergistiskt celltillväxt genom reglering av sina mål i humana GC-celler.

Resultat

50 miRNAs var upp-reglerade i en GC cellinje KATO-III, efter 5-aza-2'-deoxicytidin behandling

För att identifiera kandidat miRNAs som synergistiskt påverkar deras målgener, vi åter analyserat vår tidigare microarray uppgifter (GEO anslutning nr GSE16006) [13]. Vi ansåg att miRNA-nivåer var uppreglerat på 5-aza-2'-deoxicytidin (5-aza-CdR) behandling när nettointensiteterna för särskilda 3 fläckar var mer än 1,5-faldigt. Dessutom är vi också utvalda miRNA vars medelvärden befanns ökas mer än tre gånger på microarray analys. Baserat på dessa nya kriterier, fann vi att 50 miRNAs var uppreglerat i en GC-cellinje, KATO-III (tabell S1). Vi bekräftade uppreglering av 5 av 6 representativa prekursor-miRNA, det vill säga miR-145, -148a, -152, -224 och -340, efter 5-aza-CdR behandling med RT-PCR (Figur 1A).

TargetScan Predicted gemensamma målgener av kandidat miRNAs

för att avgöra om eller inte epigenetiskt reglerade miRNA har gemensamma målgener, vi sökte TargetScan databasen (version 5.1) för deras gemensamma mål. Enligt TargetScan kunde 50 miRNAs delas in i 46 grupper baserat på deras utsäde sekvenser. TargetScan visade också att dessa 46 grupper kan rikta 6,460 gener. Bland dessa målgener, valde vi 13 som uttryck rapporterades ökas i GC i GEO-databasen (GEO anslutning nr GSE2685) eller vara relaterade till gastric cancer (Tabell S2). Här fokuserar vi på fyra miRNA, MIR-152, -181c, -224 och -340, eftersom vi har redan rapporterat att MIR-181c är epigenetiskt nedregleras i GC [13] och CpG-öar är belägna i uppströms regioner tre andra miRNA (figur 2A och C, och figur S1). Figur 2a visar också att MIR-452 är klustrade med MIR-224. TargetScan förutspådde att de fem miRNA kan reglera gemensamma mål. Till exempel, DPYSL2
(Dihydropyrimidinas liknande 2, även känd som kollapsande respons medlare protein 2, CRMP2
) riktar av MIR-224, -452, och -181c, KRAS Musik av mIR-224, -452, -181c, -340 och -152, och MECP2
(metyl CpG-bindande protein 2) av mIR-181c och -340, respektive (Figur 3).

Uttryck av mIR-224, -452, -152 och -340 Minskade på DNA Hypermetylering i GC cellinjer

Vi undersökte inblandning av epigenetiska förändringar i nedreglering av miRNA. Uttrycket av MIR-224, -340 och -152 ökades med 5-aza-CdR behandling i flera GC cellinjer (Figur 1B). Vi analyserade kvantitativt moget miR-224 uttryck i 9 GC cellinjer och kolorektal cancer (CRC) cellinje. Inget uttryck av MIR-224 detekterades i 7 av 10 cancercellinjer (Figur 1C). Vi analyserade också uttryck ändring av Mir-224 /-452 kluster i KATO-III-celler som behandlats med en låg dos av 5-aza-CdR (0,2 mikromol /l), en histondeacetylasinhibitor, trichostatin A (TSA, 0,3 fimol /l), eller en kombination av dessa två läkemedel. KATO-III-celler med låg dos 5-aza-CdR behandling uppvisade uppreglering av Mir-224 /-452 kluster, medan TSA ensamt inte orsakar uppreglering. Mir-224 /-452 kluster var synergistiskt uppreglerat i KATO-III-celler med kombinerad 5-aza-CdR och TSA-behandling (figur 1D). Dessa resultat tyder på att MIR-224 och MIR-452 kan nedregleras genom DNA-metylering i GC-cellinjer som samma transkriptionsenheten.

Det har rapporterats att intron miRNA regleras genom promotor metylering av sin värd gener [14], [15]. Enligt resultaten av beräknings analys, Mir-224 /-452 kluster och MIR-340 finns i intron 6 i Gabre Mössor och intron 2 i RNF130
respektive, som båda innehålla täta CpG-öar endast i promotorregioner i deras värdgener (Figur 2A och C). Vi undersökte förhållandet mellan de expressionsnivåer av dessa miRNA och metylering status för deras värdgener i GC-cellinjer genom MSP-analys. GC cellinjer utan miR-224-expressions uppvisade endast metylering signaler, medan expressionspositiva cellinjer uppvisade starka unmethylation mönster (Figur 2B). En liknande relation upptäcktes för MIR-340 i GC-cellinjer (figur 2D). Dessa data indikerar att uttryck av dessa miRNA i GC cellinjer kan tystas genom promotor metylering av värdgener.

epigenetiskt reglerade miRNA kan vara relaterat till GC Cell Proliferation

För att avgöra om epigenetiskt regleras miRNA är tumör-undertryckande eller inte, utvärderade vi effekten av 5-aza-CdR i siDICER1-transfekterade KATO-III och DICER1 KO HCT116 (D1KO) celler (Figur 4A). De obehandlade KATO-III och föräldra HCT116 celler visade bromsade proliferation efter behandling med 5-aza-CdR. Å andra sidan, i siDICER1-transfekterade KATO-III och D1KO celler, effekten av 5-aza-CdR behandling på cellproliferation blev svag i båda fallen. Dessa resultat tyder på att effekten av 5-aza-CdR minskades i låga eller noll DICER1 celler, och att epigenetiskt reglerade miRNA spelar en viktig roll i GC och CRC-celler.

För att analysera förhållandet mellan dessa miRNA och 13 målgener som visas i tabell S2 transfekterade vi KATO-III-celler med siDICER1 och /eller behandlas med 5-aza-CdR. Även uttrycket av tre ( DPYSL2
, KRAS Mössor och MECP2
) av de 13 generna minskade efter 5-aza-CdR behandling, uttrycket av dessa gener gjorde inte ändra på 5-aza-CdR behandling följt av transfektion av siDICER1 (Figur 4B).

kombinato transfektion av mIR-224 och -452 förträngda GC Cell Proliferation

Vi transfekterade GC cellinjer med mIR-224 och /eller -452 härmar som en representant för miRNA kluster, eller en negativ kontroll, och genomförs sedan för vatten löst tetrazolium-8 (WST-8) -analyser. Sjuttiotvå timmar efter transfektion, observerade vi att ektopisk expression av MIR-224 eller -452 undertryckte tillväxten av två cellinjer, KATO-III och AGS (Figur 5A). Noterbart kombinations transfektion av Mir-224 och -452 härmar minskade i stor utsträckning tillväxten av två GC cellinjer (Figur 5A).

Mir-224 /-452 Kluster kooperativt minskat uttryck av DPYSL2 Mössor och KRAS

för att undersöka huruvida MIR-224 /-452 kluster är faktiskt kopplad till regleringen av DPYSL2 Köpa och KRAS
, analyserade vi uttrycket av DPYSL2
efter transfektion av KATO-III och AGS-celler med Mir-224 /-452 kluster ensam eller tillsammans. Vi utförde RT-PCR och Western blot-analyser. DPYSL2 Mössor och KRAS
mRNA-nivåer minskade efter transfektion med Mir-224 eller MIR-452 härma (Figur 5B). Interestingly, i fallet med kombinations transfektion med MIR-224 och -452, expression av dessa målgener var längre nedregleras (figur 5B). Den nedreglering av DPYSL2 observerades också vid proteinnivån i de två cellinjerna (figur 5C). Vi undersökte också de expressionsnivåer av andra fem gener, MECP2, MYC, JUNB, MUC1 Mössor och SETDB1
, som inte visades som mål för MIR-224 eller -452 av TargetScan. Som förväntat kunde inga uttrycksförändringar hos dessa fem gener som finns i KATO-III-celler efter transfektion med MIR-224 eller -452 (figur S2). Dessa data tyder på att MIR-224 och -452 specifikt nedregleras DPYSL2 Mössor och KRAS
.

DPYSL2
var associerad med GC Cell Proliferation

Vi undersökte effekten av knockdown av DPYSL2
, som visade sig vara ett mål för Mir-224 /-452 kluster på celltillväxt. Transfektion av DPYSL2
siRNA minskade klart nivåerna av DPYSL2
transkript (figur 5D), och hämmade tillväxten av AGS och KATO-III-celler 72 timmar efter knockdown av DPYSL2
(Figur 5E), vilket indikerar att DPYSL2 har en onkogen aktivitet.

kombinato Transfektion av mIR-340 och -181c undertryckta GC Cell Proliferation, och Induced nedreglering av KRAS
och MECP2
Expression

som ett andra exempel av flera till flera relationer mellan mikroRNA och målgener, analyserade vi förhållandet mellan mIR-340 /-181c och KRAS /MECP2 .
När miR-340 och mIR-181c transfekterades i KATO-III-celler, proliferation var synergistiskt nedregleras av två miRNAs (Figur 6A). För att avgöra om eller inte epigenetiskt regleras miR-340 och MIR-181c kooperativt påverka sina mål, analyserade vi mRNA-nivåer av KRAS Mössor och MECP2.
RT-PCR-analys, KRAS Mössor och MECP2
befanns vara nedregleras av mIR-340 och mIR-181c ensam eller kombinations transfektion i KATO-III-celler (Figur 6B). När det gäller de fyra generna, MYC, JUNB, MUC1 Mössor och SETDB1
, visar inga förutspådda platser för dessa två miRNA av TargetScan, uttrycksnivåer ändrades inte i denna studie. Representativa data visas i Figur 6B. Sålunda kan effekterna av MIR-340 och -181c vara specifika för deras gemensamma målgener samt MIR-224 och -452.

Expression och metylering status miR-224 och -340 i primära GC målen

Vi undersökte metylering status miR-224 och -340 i primär GC fall. Metylerade mönster av MIR-224 detekterades i 15 av 26 (57,7%) primära GC vävnader (Figur 7A och tabell 1). Parade godartade gastric slemhinnor knappast uppvisade en metylering mönster av MIR-224. Därefter undersökte vi kvantitativt Mir-224 nivåer i primära GC vävnader och motsvarande icke-cancer slemhinnor genom TaqMan RT-PCR. En betydande minskning av MIR-224 uttryck i GC vävnader observerades i metylering-positiv cancerfall jämfört med i metylering-negativa ettor och godartade gastric slemhinnor (figur 7C).

Vi analyserade vidare DPYSL2
mRNA-nivåer jämfört med metylering status miR-224 i GC vävnader: GC med mIR-224 metylering (Ca mIR-224 Mt), GCS med mIR-224 unmethylation (Ca miR-224 Un), och icke -cancerous vävnader med unmethylation (N mIR-224 Un). DPYSL2
mRNA-nivå i "Ca miR-224 Mt" gruppen var betydligt högre än de i "N miR-224 Un" och "Ca miR-224 Un" grupper, p = 0,049 och p = 0,035, respektive (Figur 7D). Således, det finns ett samband mellan metylering status miR-224 och DPYSL2
uttryck i GC vävnader.

Mir-340 metylering frekvensen var relativt låg i de primära GC testade vävnader (4 av 26, 15,4%) (figur 7B och tabell 1), medan ingen av 26 parade godartade gastric slemhinnor uppvisade uppenbara metyleringsmönster av mIR-340. När det gäller MIR-152 metylering analys, försökte vi tre primeruppsättningar utformade i uppströmsregionen av MIR-152 innehållande CpG-öar (figur S1), men ingen av dem helt matchade miR-152 uttryck på MSP analyser (data visas ej).

Diskussion

Även om det har rapporterats att uttrycket av vissa miRNAs minskas i flera cancerformer genom DNA-metylering, de flesta av de rapporter som beskrivs att förhållandet mellan avvikande uttryck av miRNA och dess målgener var en-till-en, en-till-flera eller multipel-till-ett. För att undersöka möjligheten av flera till flera relationer mellan miRNAs och mål i cancerceller, har vi fokuserat på två kombinationer av miRNAs i GC-celler, Mir-224 /-452 kluster, och MIR-181c och -340, i denna studie . Vi fann att de två uppsättningarna av miRNA, MIR-224 och -452, och MIR-181c och -340, hade flera målgener, DPYSL2 Köpa och KRAS
och KRAS Köpa och MECP2
minskade respektive och synergistiskt celltillväxt i humana GC cellinjer. Det är anmärkningsvärt att en onkogen, KRAS
[16], befanns vara måltavla för fyra miRNA, även om kandidatbindningsställen för de fyra miRNAs är olika i 3'-UTR av KRAS
(TargetScan). Vi rapporterade tidigare att MIR-181c nedregleras NOTCH4
också [13]. Således, flera till flera relationer mellan miRNAs och mål angavs inte bara av databasen analyser utan också genom transfektion experiment med mänskliga celler.

MIR-224- och /eller -340 uttryck negativa GC cellinjer uppvisade hypermetylering signaler på MSP analys och uttryck av mIR-224 och -340 restaurerade på demetyliseringsmedel behandling. Dessutom hypermetylering Mir-224 och -340 ades mer frekvent hos primära GC än motsvarande noncancerous slemhinnor. I miR-224 metylering-positiva fall, uttryck av MIR-224 var betydligt lägre än i metylering-negativa sådana. Dessa data tyder starkt på att avvikande DNA-metylering är en av de viktigaste mekanismerna bakom nedreglering av MIR-224 och -340 i GC-celler.

Vi visade att hämning av miRNA bearbetning av siDICER1 transfektion eller använda DICER1 knockout celler minskade effekten av 5-aza-CdR, det vill säga minskad cellproliferation och nedreglering av målgener, i GC och CRC-celler. Det har rapporterats att det överflöd av DICER1, det enzym som katalyserar det sista steget av miRNA mognad, direkt är förknippat med tumörprogression [17]. Dessa resultat tyder på att avvikande reglering av miRNA mognad bidrar till GC och CRC-uppställning.

Vi fann att Mir-224 /-452 kluster var avvikande nedregleras i GC genom hypermetylering. Onormalt uttryck av MIR-224 har också rapporterats i andra tumörer. Expression av MIR-224, låt-7f och MIR-516a minskas i äggstockscancer, och de synergistiskt reglera uttryck av kallikrein relaterade peptidas 10 (KLK10) [18]. MIR-224 nedregleras i metotrexatresistenta CRC cellinjer jämfört med i känsliga celler [19]. Här har vi visade också att metylering status miR-224 korrelerade med DPYSL2
nivån i människans GC. Tagna tillsammans, miR-224 spelar en viktig roll som en tumörundertryckande miRNA i GC såväl som i flera andra cancerformer. Däremot är miR-224 uppreglerat i hepatocellulära karcinom [20] och medulloblastom [21] jämfört med i normala vävnader. Således är ytterligare studier krävs för att klargöra vilken roll Mir-224 i cancer.

Vi undersökte de gemensamma målen för epigenetiskt ner reglerade miRNA. DPYSL2
visade sig vara nedregleras av MIR-224 och -452. DPYSL2 spelar en viktig roll i bildandet av neuronala polaritet [22]. DPYSL2 är också involverat i vägar som reglerar proliferation av icke-neuronala celler genom dess fosforylering genom reglerande proteiner. DPYSL2 genomgår dynamiska fosforylering förändringar som svar på kontakt hämning inducerad stillhet och hyperfosforylering av DPYSL2 sker i en tumör [22]. Även om rollen av DPYSL2 i GC är inte klart, vår siRNA baserade knockdown av DPYSL2 expression inducerade en minskning av proliferation i de två GC-cellinjer, vilket tyder på onkogena aktiviteten hos DPYSL2.

Sammanfattningsvis indikerar våra upptäckter att flera till flera relationer mellan miRNAs och målgener verkligen existerar i GC. Det är sannolikt att abnorm metylering minskar uttrycket av multipla tumörundertryckande miRNA, såsom miR-224, -452, -340 och -181c, som sedan inducera överexpression av multipla onkogena gener, som KRAS
, DPYSL2
och MECP2
. Dessa onormala flera till flera relationer mellan miRNA och mål skulle vara en av de viktigaste mekanismerna bakom gastric cancer. Det är därför mycket möjligt att epigenetiska läkemedel kan normalisera uttrycket av inte bara tumörundertryckande gener, utan även flera tumörundertryckande miRNA, vilket resulterar i minskning av de onormala multipla-till-flera relationer mellan miRNA och mål, och kan sålunda bli utmärkta terapeutiska läkemedel mot cancer.

Material och metoder

etik Statement

skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter, och den etiska kommittén i Tokyo Medical and Dental University School of läkemedel som är godkänt denna forskning.

cellinjer och vävnadsprover

Vi studerade 9 GC cellinjer (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 och GCIY) 2 CRC cellinjer (HCT116 och DICER1
slå ut HCT116 [23]), och 26 primära GC fall. MKN45, MKN74, TGBC11TKB och GCIY köptes från RIKEN cellbank, och KATO-III och AGS var från ATCC (American Type Cell Collection). HSC59, HSC43 och HSC58 erhölls från Dr. Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO-III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 och HSC58 odlades i RPMI 1640, och AGS, TGBC11TKB, GCIY och de två CRC-cellinjer i Dulbeccos modifierade Eagles medium, minimalt essentiellt medium eller McCoys 5A, som kompletterats med 10% fetalt bovint serum. Kirurgiskt resekterade prover från 26 primära GC patienter randomiserades erhållits från Anslutna sjukhuset i School of Medicine, Tokyo Medical and Dental University.

I silico analys

Vi hänvisade till GEO databasen för miRNA och genuttrycksprofilerna (GEO anslutning nr GSE16006 och GSE2685). Vi använde också miRNA mål databas "TargetScan".

Läkemedelsbehandling av celler och RNA-extraktion

För demetylering studier cellerna dagligen behandlades med 5 mol /l 5-aza-CdR (sigma- Aldrich, St Louis, MO) under 72 h. Vi behandlade också celler med 0,3 mol /l TSA ensam och med en kombination av 0,2 mikromol /l 5-aza-CdR och TSA. Totalt RNA isolerades med användning av Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) eller en miRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland).

Kvantitativ realtid omvänd transkription-polymeraskedjereaktion

realtid omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) analyser utfördes med användning av en StepOne realtids-PCR-systemet (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq master Mix med ROX (Roche, Mannheim, Tyskland), ett TaqMan Reverse Transcription-kit (Applied Biosystems), och TaqMan miRNA analyser (Applied Biosystems), i enlighet med tillverkarnas instruktioner. De uttrycksnivåer av miRNA beräknades baserat från mängden mål miRNA i förhållande till den av RNU6B som en kontroll för att normalisera den inledande inmatning av totalt RNA.

Metylering analys

bisulfit behandling av DNA utförs med Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). Metylering specifika polymeraskedjereaktion (MSP) analyser utfördes såsom beskrivits tidigare [26]. Primersekvenserna och PCR-produktstorlekarna visas i tabell S3.

syntetisk miRNA Transfektion

KATO-III och AGS-celler transfekterades med en prekursormolekyl mimicking miR-224, -452, -340 eller -181c, eller förvrängd sekvens miRNA (Sigma) för att ge en slutlig koncentration av 25-50 nmol /l genom användning av en elektroporator, Neon (Invitrogen), enligt tillverkarens instruktioner. Vid 24-72 h efter transfektion, skördades cellerna för RT-PCR eller Western blot-analys.

cellprolifereringsanalys

miR-mimic-transfekterade KATO-III och AGS-celler ströks ut med en × 10 ^{3 eller ett × 10 4-celler per brunn på 96-brunnars plattor. Cell proliferation utvärderades på dagarna 1-4 efter transfektion genom att bestämma antalet celler med cellförökning reagens WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japan), enligt tillverkarens instruktioner.}

miRNA mål Prediction och Western blotting

De förutsagda målen för miRNA och deras målställen analyserades med hjälp TargetScan. De mRNA-expressionsnivåer av de förutsagda mål i övergående transfekterade celler analyserades 24 timmar efter transfektion genom RT-PCR. Western blot-analyser utfördes såsom beskrivits tidigare [26]. Den primära antikroppen som användes var kanin-anti-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Cell Signa Technology, Danvers, MA). Vi använde mus-anti-α-tubulin (1:1000, SC-8085, Santa Cruz Biotechnology) som en intern kontroll för Western blotting. De sekundära antikropparna som användes var alkaliskt fosfatas-konjugerad anti-kanin-IgG och anti-mus IgG (1:2000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Blottar framkallades med ImmunoStar AP Substrat (Bio-Rad Laboratories).

Bakgrundsinformation
figur S1.
Schematisk representation av COPZ2
region innehållande miR-152. Fyllda rutor representerar exoner av COPZ2 och en tom låda Review, en betecknar otranslaterade regionen av COPZ2
. En böjd pil indikerar transkriptionsstartplatsen av COPZ2
. En vertikal pil visar var miR-152. Vertikala linjer indikerar CpG platser. Pilspetsar indikerar de regioner som undersökts för MSP
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s001
(TIFF) Review figur S2.
Effekter av transfektion av MIR-224 och -452 i KATO-III-celler. RT-PCR-analyser efter transfektion med MIR-224 och /eller -452. Expressionen av målgener analyserades 48 h senare genom RT-PCR. MIR-224 och -452 specifikt nedregleras DPYSL2 Mössor och KRAS
, men inte andra fem gener undersökas, som är förenliga med resultaten av databasanalys (Figur 3).
doi: 10.1371 /journal.pone.0062589.s002
(TIFF) Review tabell S1.
Expression profilering av mänskliga miRNA i KATO-III-celler efter 5-aza-CdR behandling
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s003
(XLSX) Review tabell S2.
Lista över målgener som uttryck undersökte vi genom RT-PCR efter behandling med eller utan 5-aza-CdR och transfektion med 20 nmol /L siDICER1 eller förvrängd siRNA
doi:. 10,1371 /journal.pone .0062589.s004
(XLSX) Review tabell S3.
Sekvenser av primrar som användes i denna studie
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s005
(XLSX) Review

Bekräftelser

Vi vill tacka Dr. bert Vogelstein för att tillhandahålla den DICER1 knock-out HCT116-cellinjen.

• PLOS ONE: Hypoxi Stimulerar EMT av Gastric cancerceller genom autokrin TGFp Signaling
• PLOS ONE: Flotillin2 Expression korrelerar med HER2 nivåer och dålig prognos i Gastric Cancer