PLoS ONE: Keli iki Keli santykius tarp mikro RNR ir tikslinių genų skrandžio vėžio

Anotacija

mikro RNR (miRNAs) veikia kaip transkripcijos reguliatoriai ir vaidina pagrindinį vaidmenį kancerogenezėje. Pasak Mirna tikslinių duomenų bazėse, vienas Mirna gali reguliuoti daug genų, kaip savo tikslus, o vienas genas gali būti skirta daug miRNAs. Šie rezultatai rodo, kad santykiai tarp miRNAs ir jų tikslai gali būti ne vienas prie vieno. Tačiau daugelis pranešimai aprašyti tik vienas su vienu, vienas su kelių ar kelių su vienu santykių Mirna ir jos tikslinio geno žmogaus vėžiui. Taigi, būtina nustatyti, ar nėra kai kurių miRNAs derinys būtų reguliuoti kelis tikslus ir dalyvauti kancerogenezėje. Norėdami rasti kai kurie iš miRNAs kad gali sąveikauja reguliuoti savo tikslus žmogaus skrandžio vėžiu (GC) grupes, mes vėl analizavo mūsų Ankstesnis Mirna išraiška masyvo duomenis ir nustatė, kad 50 miRNAs buvo iki-reguliuojami gydymo 5-aza-2'-deoksicitidino į GC ląstelių linija. Į "TargetScan" Mirna tikslinės duomenų prognozavo, kad kai kurie iš šių miRNAs turi bendrą tikslą genus. Mes taip pat nurodyta GEO duomenų bazėje išraiškos šių bendrų tikslinių genų žmogaus GCS, kurie gali būti susiję su skrandžio kancerogenezėje. Šiame tyrime mes analizuojami du Mirna kartu, MIR-224 ir -452, ir mir-181C ir -340. Per išraiškos abiejų Mirna derinius dramatiškai žemyn reguliuoja savo tikslinę genus DPYSL2 parsisiųsti ir KRAS
, ir KRAS parsisiųsti ir MeCP2
, atitinkamai. Šie Mirna deriniai sąveikauja sumažėjo ląstelių proliferaciją nuo transfekciją. Be to, mes parodė, kad šie miRNAs buvo žemyn reguliuojama promotoriaus hypermethylation GC ląsteles. Taigi, tikėtina, kad tarp miRNAs ir jų tikslus santykiai yra ne vienas prie vieno, bet kelių iki kartotinio į GCS, ir kad šie sudėtingi santykiai gali būti susiję su skrandžio kancerogenezėje pervežimas

nurodomoji. Hashimoto Y Akiyama Y Yuasa Y (2013) įvairūs iki Keli santykius tarp mikro RNR ir tikslinių genų skrandžio vėžio. PLoS ONE 8 (5): e62589. Doi: 10,1371 /journal.pone.0062589

redaktorius: Hiromu Suzuki, Saporas medicinos universitetas, Japonija

Įstojo: Gruodžio 14, 2012; Priėmė: Kovo 24, 2013 m Paskelbta 8 Gegužė 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Hashimoto et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas buvo iš dalies remiamą dotacijas iš A3 prognozavimo programą iš Japonijos draugijos mokslo skatinimo (JSP) (YY), o moksliniai tyrimai stipendijų iš jaunųjų mokslininkų JSP (YH). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

mikro RNR (miRNAs), mažų nebaltyminės kodavimo RNR klasė, buvo nustatyta, kad naujo tipo geno reguliatoriaus, kad jungiasi prie 3'-neišverstų regionuose (UTRs) tikslinės mRNR, taip sukeldamas į mRNR degradacijos arba mRNR dalimi, vertimo blokados [1]. Ji paprastai yra žinoma, kad mirna pakitimai yra susiję su tumorigenezei [1]. Pasak Mirna tikslinių duomenų bazėse, vienas Mirna gali reguliuoti daug genų, kaip savo tikslus, o vienas genas gali būti skirta daug miRNAs. Tačiau daugybė tyrimų atskleidė "vienas su vienu santykius tarp Mirna ir jos tikslinio geno. Ji taip pat buvo pastebėta, kad antriniai arba klasterio iš miRNAs bendrai operatyviai reguliuoti geną, kuris yra susijęs su kancerogenezėje [2] - [4]. Kita vertus, daugelio genų yra taikomi pagal vieną mirna [3], [4]. Net kelių iki kelių santykių miRNAs ir tikslų buvo pranešta naudojant skaičiavimo analizes [5], [6]. Tačiau yra buvę tik keli dokumentai, patvirtinantys eksperimentiškai kelis iki kelių santykius vėžinių ląstelių.

Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia žmogaus piktybinių ligų ir antra dažniausia priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje, su maždaug vieno milijono naujų atvejų per metus [7]. Skrandžio vėžys yra histologiškai skirstomi į dvi pagrindines rūšis, žarnyno ir pasklidųjų rūšių [8]. Difuzinė tipo GC dažnai sunkiai ir demonstruoja prastą paciento prognozę. Neseniai, mes parodė, kad praradimas Cdh1 ir Trp53 funkcijų sukelia difuzinio tipo GC su pelėmis modelius [9]. Nors ši išvada padės mums kurti naujus žmogaus skrandžio vėžio gydymo metodus, atlikti papildomus tyrimus dėl molekulinius mechanizmus pagrindinės skrandžio kancerogenezėje yra būtina parengti kitus metodus tikslingai terapija.

Rėmėjas CpG sala hypermethylation yra vienas iš labiausiai paplitusių mechanizmų pagal kurį navikas slopintuvas genų inaktyvuotas žmogaus vėžio [10]. Neseniai tapo aišku, kad kai kurie miRNAs taip pat tikslai epigenetinio nuslopinami į vėžio [11]. Mūsų ir kitų grupių anksčiau parodė, kad farmakologinio arba genetinio sutrikimų DNR metilinimo į vėžio ląstelių linijas, skatina iki reguliavimo esminių skaičių miRNAs [12] - [15]. Šie duomenys leido identifikuoti kandidačių naviko slopinančio miRNAs kurių triukšmo slopinimo yra susijęs su CpG salos metilinimo. Iki šiol, metilinimas miR-124 šeimos nariams buvo aptikta gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ir auglių kitų organų [11]. Be to, Mir-34b /c klasteris turi tipišką CPG salą, ir žemyn reguliuojama per dažnai metilinimo gaubtinės ir tiesiosios žarnų bei skrandžio vėžio [12]. Be to, mes nustatėme, kad Pasaulis-181C metilinimas yra susijęs su skrandžio kancerogenezėje per reguliavimo onkogeniniam genų kras parsisiųsti ir NOTCH4
[13]. Žemyn reguliavimo daugelio miRNAs per metilinimo vienu metu atsiranda vėžinių ląstelių ir gali padidinti kelis iki kelių santykius miRNAs ir tikslus.

Šiame tyrime patvirtinti kelių iki kelių santykių miRNAs ir tikslų į vėžio ląsteles, mes parodė, kad dvi poros keliais miRNAs, PPN-224 ir -452 ir miR-181c ir -340, turėjo keletą tikslinių genų ir sąveikauja sumažėjo ląstelių proliferaciją Reglamentu savo taikinius žmogaus GC ląsteles.

rezultatai

50 miRNAs buvo iki reguliuojama į GC ląstelių linija, KATO-III, po 5-aza-2'-dezoksicitidino gydymo

Jei nustatyti kandidates miRNAs kad sinergiškai paveikti jų Tikslinės genai, mes vėl analizavo mūsų ankstesni mikrogardeliq duomenų (geo prisijungimą Nr GSE16006) [13]. Mes laikoma, kad Mirna koncentracija buvo iki-reguliuojami 5-aza-2'-deoksicitidino (5-aza-REC) gydymui, kai grynasis intensyvumas ypač į jo 3 taškų buvo daugiau nei 1,5 karto. Be to, mes taip pat pažymėtus miRNAs kurių buvo nustatyta, kad vidurkiai turi būti didinamas daugiau nei 3 kartus ant mikrogardeliq analizė. Remiantis šiais naujais kriterijais, mes nustatėme, kad 50 miRNAs buvo iki reguliuojama į GC ląstelių linija, KATO-III (lentelė S1). Mes patvirtino UP-reguliavimą 5 6 atstovybių pirmtakų miRNAs, tai yra, PPN-145, -148a, -152, -224 ir -340, po 5-aza-CdR elgesio RT-PCR (1a pav.)

TargetScan prognozuojamai bendrą tikslą genai kandidato miRNAs

Jei nustatyti, ar epigenetically reguliuojami miRNAs turi bendrą tikslą genus, mes Ieškota TargetScan duomenų bazėje (versija 5.1) dėl jų bendrų tikslų. Pasak TargetScan, 50 miRNAs gali būti skirstomi į 46 grupių pagal jų sėklų sekas. TargetScan taip pat parodė, kad šios 46 grupės gali nukreipti 6,460 genų. Tarp šių tikslinių genų, mes išrinkome 13 iš kurių buvo pranešta išraiška būti padidintas GC GEO duomenų bazė (GEO stojimo Nr GSE2685) arba gali būti susijęs su skrandžio kancerogenezėje (lentelė S2). Čia mes skirti keturioms miRNAs, PPN-152, -181c, -224 ir -340, nes mes jau pranešė, kad Pasaulis-181C yra epigenetically žemyn reguliuojama GC [13], ir CpG salos įsikūrę tiekėjų regionuose kiti trys miRNAs (2a ir C paveiksle, o S1 paveiksle). 2a pav taip pat atskleidžia, kad Pasaulis-452 yra susitelkę su miR-224. TargetScan prognozuojama, kad penki miRNAs gali reguliuoti bendrus tikslus. Pavyzdžiui, DPYSL2
(Dihidropirimidinazei-kaip 2, taip pat žinomas kaip griūva reagavimo tarpininkas baltymų 2 CRMP2
) yra orientuota miR-224, -452, ir -181c KRAS
pagal miR-224, -452, -181c, -340 ir -152, ir MeCP2
(metil CpG surišantis baltymas 2) miR-181c ir -340, atitinkamai (3 paveikslas).

išraiška miR-224, -452, -152 ir -340 sumažėjo DNR Hypermethylation GC ląstelių linijų

išnagrinėjo epigenetinių pokyčių žemyn reguliuoti miRNAs dalyvavimą. MiR-224, -340 ir -152 išraiška buvo padidintos 5-aza-CdR gydymo keliose GC ląstelių linijų (1b pav). Mes kiekybiškai išanalizuoti brandaus Pasaulis-224 išraišką 9 GC ląstelių linijų ir tiesiosios žarnos vėžys (VTK) ląstelių eilės. Nėra miR-224 išraiška buvo aptikta 7 iš 10 vėžio ląstelių linijas (1c pav.) Mes taip pat išanalizavo PPN-224 /-452 klasterio Kato-III ląstelių gydomi maža doze 5-aza-CdR (0,2 mkmol /l), histono deacetilazės inhibitorių raiškos kaita, trichostatin A (TSA, 0,3 mikromoliai /l), arba iš šių dviejų vaistų derinys. Kato-III ląstelės su mažų dozių 5-aza-CdR gydymo eksponuojami iki-reguliavimo Mir-224 /-452 klasterį, o TSA vien nesukėlė iki reglamentavimą. Mir-224 /-452 klasteris buvo sąveikauja iki reguliuojama Kato-III ląstelių su apibendrinta 5-aza-CdR ir TSA gydymo (1d pav). Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-224 ir miR-452 gali būti žemyn reguliuojama DNR metilinimo GC ląstelių linijų, kaip to paties transkripcijos vieneto.

Buvo pranešta, kad intronic miRNAs reguliuoja per promotoriaus metilinimo jų priimančiosios genai [14], [15]. Pagal skaičiavimo analizės rezultatais, Mir-224 /-452 klasteris ir Pasaulis-340 yra įsikūręs intronas 6 iš , Gabre parsisiųsti ir intronui 2 RNF130
, atitinkamai, kurie abu yra tankus CpG salas tik promotoriaus regionuose jų šeimininko genus (2a ir C pav.) Mes tyrėme tarp ekspresijos lygį šių miRNAs ir metilinimo statuso jų šeimininko genus GC ląstelių linijas MSP analizės santykius. GC ląstelių linijas be Pasaulis-224 raiškos eksponuojami tik metilinimas signalų, kadangi raiškos teigiamų ląstelių linijų eksponuojami stiprius unmethylation modelius (2b pav.) Panašus santykis buvo aptiktas Mir-340 GC ląstelių linijas (2d pav). Šie duomenys rodo, kad išraiška šių miRNAs GC ląstelių linijų gali būti nutildyti per promotoriaus metilinimo savo šeimininko genus.

Epigenetically Reguliuojami miRNAs gali būti susiję su GC ląstelių proliferaciją

Norėdami nustatyti, ar epigenetically reglamentuoja miRNAs yra auglio slopinančio ar ne, mes įvertino 5-aza-CdR poveikį siDICER1-transfekuota KATO-III ir DICER1 KO HCT116 (D1KO) ląstelių (4a pav.) Negydytos KATO-III ir tėvų HCT116 ląstelės parodė sulėtėjo platinimu po gydymo 5-aza-CdR. Kita vertus, į siDICER1-transfekuotų KATO-III ir D1KO ląstelių, iš 5-aza-CdR gydymo poveikis dėl ląstelių proliferacijos tapo silpnas abiem atvejais. Šie rezultatai rodo, kad 5-aza-CdR poveikis buvo sumažintas žemose ar neapibrėžtų DICER1 ląstelių, ir kad epigenetically reguliuojami miRNAs vaidina svarbų vaidmenį GC CRC ląsteles.

Siekiant išanalizuoti tarp šių santykių miRNAs ir 13 tikslinės genai parodyta S2 lentelė, mes perkeltų KATO-III ląsteles siDICER1 ir /ar apdorotas 5-aza-CdR. Nors, išraiška 3 ( DPYSL2
KRAS parsisiųsti ir MeCP2
) iš 13 genų sumažėjo po 5-aza-CdR gydymo, šių genų ekspresijos padarė nesikeičia nuo 5-aza-CdR gydymo po transfekciją siDICER1 (4b pav.)

kombinacyjnych transfekcijq miR-224 ir -452 represuotų GC ląstelių proliferaciją

perkeltų GC ląstelių linijas su Pasaulis-224 ir /arba -452 imituoja kaip Mirna grupių atstovas, ar neigiama kontrole, o tada atliekamas vandens-išspręsta tetrazolio-8 (WST-8) tyrimų. Septyniasdešimt dvi valandas po to, kai transfekciją, mes nustatėme, kad negimdinis išraiška miR-224 ar -452 slopino dviejų ląstelių linijų, KATO-III ir AGS (5a pav) augimą. Pažymėtina, kombinacyjnych transfekavimas Mir-224 ir -452 imituoja plačiai sumažino dviejų GC ląstelių linijas (5a pav.) Augimą

Mir-224 /-452 klasterio bendradarbiavimo operatyviai Sumažėjęs išraiška DPYSL2 parsisiųsti ir KRAS

Jei ištirti, ar mir-224 /-452 klasteris yra iš tikrųjų susiję su reglamento DPYSL2 parsisiųsti ir KRAS
, mes išanalizavo, DPYSL2
išraišką po transfekciją KATO-III ir AGS ląstelių su atskirai arba kartu mir-224 /-452 klasterius. Mes atlikti RT-PGR ir Vakarų dėmė analizes. DPYSL2 parsisiųsti ir , kras
iRNR koncentracija sumažėjo po transfekciją su Mir-224 arba Pasaulis-452 mimika (5b pav.) Įdomu tai, kad į kombinacyjnych transfekciją su miR-224 ir -452 atveju, išraiška šių tikslinių genų toliau krito reguliuojama (5b pav.) Žemyn-reguliavimas DPYSL2 taip pat buvo stebimas baltymų lygio dviejų ląstelių linijas (5c pav.) Mes taip pat išnagrinėjo raiškos lygius kitų penkių genų MeCP2 Myc, JUNB, MUC1 parsisiųsti ir SETDB1
, kurios nebuvo parodyta, kaip tikslus Mir-224 ar -452 iki TargetScan. Kaip ir tikėtasi, jokių Išsiskiriantis pokyčiai šių penkių genų buvo rasta Kato-III ląstelių po transfekciją su miR-224 ar -452 (S2 pav). Šie duomenys rodo, kad Pasaulis-224 ir -452 specialiai žemyn reguliuojama DPYSL2 parsisiųsti ir KRAS
.

DPYSL2
buvo susijęs su GC ląstelių proliferaciją

išnagrinėjo triuškinantis yra DPYSL2
, kuris buvo įrodyta, kad būti mir-224 /-452 klasterio tikslas, poveikį ląstelių proliferaciją. Iš transfekcija DPYSL2
siRNR akivaizdžiai sumažėjo į DPYSL2
nuorašai (5d pav) lygį ir slopino AGS ir KATO-III ląstelių augimą 72 valandos po to, kai triuškinantis DPYSL2
(5E paveikslas) rodo, kad DPYSL2 turi onkogeninio veiklą.

kombinacyjnych transfekcijq miR-340 ir -181c represuotų GC ląstelių proliferaciją ir sukėlė Down-reguliavimo KRAS
ir MeCP2
išraiška

Kaip antrame pavyzdyje kelių iki kelių santykių tarp mikro RNR ir tikslinių genų, mes analizavo tarp Pasaulis-340 /-181c ir KRAS /MeCP2 santykius .
Kai Pasaulis-340 ir Pasaulis-181C buvo pernešta į KATO-III ląstelių proliferacija buvo sąveikauja žemyn reguliuoja dviejų miRNAs (6a pav.) Norėdami nustatyti, ar epigenetically reglamentuoja MIR-340 ir Pasaulis-181C co-operatyviai įtakos jų tikslus, mes išanalizavo iRNR lygį, KRAS parsisiųsti ir MeCP2.
AT-PGR analizei, KRAS parsisiųsti ir MeCP2
buvo nustatyta, kad žemyn reguliuoja miR-340 ir miR-181c vienas arba kombinacyjnych transfekciją Kato-III ląstelių (6b pav.) Kaip keturių genų MYC, JUNB, MUC1 parsisiųsti ir SETDB1
, nerodo jokių prognozuojamas svetaines šių dviejų miRNAs pagal TargetScan, ekspresijos lygis nebuvo pakeistas šiame tyrime. Reprezentatyvūs duomenys rodomi 6B pav. Taigi, PPN-340 ir -181c poveikis gali būti būdingi jų bendrų tikslinių genų, taip pat miR-224 ir -452.

išraiška bei metilinimo Būsena miR-224 ir -340 Pirminiai GC bylose

išnagrinėjo metilinimo statusą PPN-224 ir -340 pradinėse GC atvejais. Denatūruotu modeliai PPN-224 buvo aptikta 15 26 (57,7%) pradinių GC audinių (7a pav ir 1 lentelė). Suporuotas nevėžinis skrandžio gleivinės sunkiai pasižymėjo metilinimo modelio miR-224. Be to, mes kiekybiškai išnagrinėjo Mir-224 lygių pirminių GC audinių ir atitinkamu nevėžinės gleivinės pagal TaqMan RT-PGR. Nemaža mažinimas Pasaulis-224 raiškos GC audiniuose buvo pastebėtas metilinimas teigiamas vėžio atvejų, palyginti su į metilinimo neigiamas tie nevėžinės skrandžio gleivinės (7c pav.)

Mes taip pat analizuojami DPYSL2
iRNR lygiui palyginti su metilinimo statuso PPN-224 GC audinių: gCS su Pasaulis-224 metilinimo (CA Pasaulis-224 MT), gCS su Pasaulis-224 unmethylation (Ca Pasaulis-224 JT) ir ne -cancerous audiniai, unmethylation (N Pasaulis-224 JT). DPYSL2
iRNR lygis "ca Pasaulis-224 Mt" grupėje buvo reikšmingai didesnis negu "n Pasaulis-224 UN" ir "Ca Pasaulis-224 UN" grupės, p = 0,049 ir ​​p = 0,035, atitinkamai (7D pav.) Taigi, yra koreliacija tarp metilinimo statuso PPN-224 ir DPYSL2
raiškos GC audiniuose.

Mir-340 metilinimas dažnis buvo santykinai mažai tirtų pagrindinis GC audinių (4 26, 15,4%) (7B pav ir 1 lentelė), o nė 26 suporuotas ne vėžiniai skrandžio gleivinės eksponuojami akivaizdžių metilinimas modelius PPN-340. Kaip Mir-152 metilinimo analizei, mes bandėme tris gruntas rinkinius suprojektuoti tiekėjų regione PPN-152, kuriuose CpG salos (S1 paveiksle), tačiau nė vienas iš jų visiškai atitiko Pasaulis-152 išraiška JEP analizuoja (duomenys neparodyti).

Diskusijos

Nors buvo pranešta, kad kai kurių miRNAs išraiška sumažėjo keliais vėžio per DNR metilinimo, dauguma ataskaitas aprašyta, kad tarp nukrypusiu nuo normos išraiškos miRNAs ir jos tikslinių genų santykiai buvo vienas su vienu ", vienas su kelių arba sudėtinis su vienu. Išnagrinėti kelių iki kelių santykių miRNAs ir uždavinių, vėžinių ląstelių galimybė, mes sutelktas į dviejų derinių miRNAs GC ląsteles, Mir-224 /-452 klasteris, ir Pasaulis-181C ir -340, šiame tyrime , Mes nustatėme, kad dvi miRNAs, PPN-224 ir -452 ir miR-181c ir -340, turėjo keletą tikslinių genų DPYSL2 parsisiųsti ir KRAS
, ir KRAS parsisiųsti ir MeCP2
, atitinkamai, ir sąveikauja sumažėjo ląstelių proliferaciją žmogaus GC ląstelių linijų. Pažymėtina, kad onkogeno KRAS
[16] buvo nustatyta, turi būti nukreipta keturių miRNAs, nors rišimosi svetainės keturių miRNAs yra skirtingi 3'-UTR yra KRAS
(TargetScan). Mes anksčiau pranešė, kad Pasaulis-181C žemyn reguliuojama NOTCH4
per [13]. Taigi kelių iki kelių santykių miRNAs ir tikslų buvo nurodyti ne tik duomenų bazės analizę, bet ir transfekcijos eksperimentų su žmogaus ląsteles.

MIR-224- ir /arba -340 išraiška neigiami GC ląstelių linijas eksponuojami hypermethylation signalai MSP analizės ir PPN-224 saviraiškos ir -340 atkurta demetilinimą agentas gydymo. Be to, hypermethylation miR-224 ir -340 buvo dažniau pastebėti pirminių GCS už atitinkamus noncancerous gleivinės. Be Pasaulis-224 metilinimas teigiamas atvejais išraiška miR-224 buvo gerokai mažesnis nei metilinimas neigiamas tie. Šie duomenys aiškiai rodo, kad netipinė DNR metilinimas yra vienas svarbiausių mechanizmų, pagrindinių ir žemyn reguliavimas PPN-224 -340 GC ląsteles.

parodė, kad slopinimas Mirna tvarkymo siDICER1 transfekciją arba naudojant DICER1 nokautas ląstelių sumažėjo 5-aza-CdR poveikį, ty sumažėjo ląstelių proliferaciją ir žemyn reguliavimas tikslinių genų, GC ir CRC ląsteles. Buvo pranešta, kad DICER1, fermento katalizuoja galutinį žingsnį Mirna brendimo gausa, yra tiesiogiai susijęs su naviko progresavimo [17]. Šie rezultatai rodo, kad netipinė reguliavimas Mirna brendimo prisideda prie GC CRC formavimas.

Mes nustatėme, kad Mir-224 /-452 klasteris buvo nenormaliai žemyn reguliuojama GCS per hypermethylation. Nukrypęs nuo normos, išraiška miR-224 taip pat buvo pastebėta kitose navikų. Išraiška miR-224, leisti-7f ir miR-516a yra sumažėjo kiaušidžių vėžio, ir jie sinergetiškai reguliuoti išraiška kalikreino susijusių peptidazės 10 (KLK10) [18]. Pasaulis-224 yra žemyn reguliuojama metotreksato atsparus CRC ląstelių linijų, palyginti su jautriose ląstelėse [19]. Čia mes taip pat atskleidė, kad metilinimas statusas miR-224 buvo susietas su DPYSL2
lygio žmogaus GCS. Kartu, PPN-224 vaidina svarbų vaidmenį kaip naviko-slopinančio Mirna GC, taip pat daugelyje kitų vėžio. Priešingai, PPN-224 yra up-reguliuojami kepenų karcinoma [20] ir, palyginti su įprastomis audinių medulloblastomas [21]. Taigi, tolesni tyrimai reikalingi išaiškinti PPN-224 vaidmenį kancerogenezėje.

ištirtas bendras tikslus epigenetically žemyn reguliuojamų miRNAs. DPYSL2
buvo įrodyta, kad būti žemyn reguliuoja miR-224 ir -452. DPYSL2 vaidina svarbų vaidmenį neuronų poliariškumo [22] įsteigimo. DPYSL2 taip pat dalyvauja kelius, kad reglamentuojančių ne neuronų ląstelių proliferaciją per savo fosforilinimo reguliavimo baltymų. DPYSL2 patiria dinaminius fosforilinimo pokyčius reaguojant susisiekti slopinimas sukeltos ramybės ir hyperphosphorylation iš DPYSL2 pasitaiko naviko [22]. Nors DPYSL2 vaidmuo GCS nėra aišku, mūsų siRNR pagrindu nokdaunas iš DPYSL2 išraiška sukėlė iš platinimu dviejų GC ląstelių linijų sumažinti, o tai rodo onkogeninio aktyvumą DPYSL2.

Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad kelių iki kelių santykių miRNAs ir tikslinių genų tikrai egzistuoja GC. Tikėtina, kad netipinė metilinimas sumažina kelių navikinių-slopinančio miRNAs, pavyzdžiui, miR-224, -452, -340 ir -181c, kuris tada sukeliamas per išraiška keliais onkogeniniam genų, pavyzdžiui, KRAS
išraiška DPYSL2
, ir MeCP2
. Šie nenormalūs daug iki kelių santykiai miRNAs ir tikslus būtų vienas iš svarbiausių mechanizmų, skrandžio kancerogenezėje. Ji yra, todėl, labai įmanoma, kad Epigenetiniai vaistai gali normalizuoti ne tik su augliu slopinančio genų, bet taip pat keliais navikų-slopinančio miRNAs išraiška, todėl sumažėja anomaliąją keliais-į-keletą santykių tarp miRNAs ir tikslų, ir tokiu būdu gali tapti puikios terapinės vaistai nuo vėžio.

medžiagos ir metodai

etika pareiškimas

Parašė informuotas sutikimas buvo gautas iš visų dalykų, ir etikos komitetui Tokijo medicinos ir stomatologijos universiteto mokyklos Medicina patvirtino šiuos tyrimus.

Mobilaus ryšio linijos ir audinių mėginių

studijavo 9 GC ląstelių linijas (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 ir GCIY) 2 CRC ląstelių linijas (HCT116 ir DICER1
išmuštų HCT116 [23]) ir 26 pirminės GC atvejai. MKN45, MKN74, TGBC11TKB ir GCIY buvo įsigytas iš RIKEN ląstelių banką, ir buvo iš ATCC (American Tipas Mobilusis Collection) KATO-III ir AGS. HSC59, HSC43 ir HSC58 buvo gauti iš dr Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. Kato-III MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 ir HSC58 buvo auginami RPMI 1640 ir AGS, TGBC11TKB, GCIY ir du CRC ląstelių linijos Dulbecco modifikuota Eagle terpė, minimalus esminį vidutinio ar McCoy 5A, papildyta su 10% vaisiaus galvijų serume. Chirurginis rezekcijos bandiniai iš 26 pirminių GC pacientų buvo atsitiktinai gauti iš kitų susijusių ligoninės medicinos mokyklos, Tokijo medicinos ir odontologijos universitete.

in silico analizė

nurodyta GEO duomenų bazėje Mirna ir genų ekspresijos profilius (GEO prisijungimas Nr GSE16006 ir GSE2685). Mes taip pat naudojamas Mirna tikslinės duomenų bazę "TargetScan".

Narkotikų gydymas ląsteles ir RNR gavyba

demetilinimu tyrimų, ląstelės buvo kasdien gydomi 5 mkmol /l 5-aza-CdR (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) 72 val. Mes taip pat paveiktų ląstelių su 0,3 mikromoliai /l TSA vieni, ir su 0,2 mkmol /l 5-aza-CdR ir TSA derinys. Iš viso RNR buvo išskirta naudojant Trizol reagentą (Invitrogen, Karlovi Varai, Kalifornija) arba miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Vokietija).

Kiekybiniai Realaus laiko atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija

realaus laiko atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija (PGR) analizuoja buvo atliekami naudojant StepOne realiojo laiko PGR sistema (Applied BIOSYSTEMS Foster Miestas, CA), EagleTaq magistras sumaišykite su ROX (Roche, Manheimas, Vokietija), TaqMan atvirkštinės transkripcijos rinkinys (taikoma BIOSYSTEMS) ir TaqMan Mirna tyrimai (taikomieji BIOSYSTEMS), pagal gamintojo nurodymus. Sąvoka lygiai Mirna buvo apskaičiuotos remiantis iš tikslinės Mirna, lyginant su RNU6B sumą kaip kontrolės normalizuoti pradinį indėlį visos RNR.

Metilinimas analizė

bisulfite gydymas DNR buvo atliekamas su Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). Metilinimo-specifinę polimerazės grandininė reakcija (MSP) analizė buvo vykdomi, kaip aprašyta anksčiau [26]. Grunto sekas ir PGR produktas dydžiai rodomi S3 lentelėje.

Sintetinis Mirna transfekcijq

Kato-III ir AGS ląstelės buvo pernešta su pirmtakas Molekulė mėgdžiodami Pasaulis-224, -452, -340 arba -181c, arba plakta seka Mirna ( "Sigma), kad galutinė koncentracija būtų 25-50 nmol /l, naudojant electroporator, neonas (Invitrogen), pagal gamintojo nurodymus. Tuo 24-72 h po transfekciją, ląstelės buvo paruošta RT-PCR ar Vakarų blot analizė.

ląstelių proliferaciją Analizės

Pasaulis-mimikos-perkeltų KATO-III ir AGS ląstelės buvo pasėja 1 × 10 ^{3 arba 1 × 10 4 ląstelės per gerai apie 96-duobučių lėkštelėse. Ląstelių proliferacija buvo vertinama dienomis 1-4 po transfekciją nustatant ląstelių su ląstelių proliferacija reagento WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc, Mashikimachi, Japonija) skaičių, pagal gamintojo instrukcijas.}

Mirna Tikslinė prognozavimas ir Imunoblotingo

prognozuojama tikslai miRNAs ir jų tikslines svetaines buvo analizuojami naudojant TargetScan. MRNR ekspresijos lygis prognozuojamos taikinius laikinai perkeltų ląstelių buvo analizuojami, po 24 valandų transfekciją RT-PGR. Western Blot analizė buvo vykdomi, kaip aprašyta anksčiau [26]. Pagrindinis antikūnų buvo naudojamas triušio prieš DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Mobilusis Signalizacijos įranga, Danvers, MA). Mes naudojome pelės anti-alfa-tubulino (1:1000; SC-8085, Santa Cruz Biotechnology) kaip vidaus kontrolės imunoblotingo. Naudojami antriniai antikūnai buvo šarminės fosfatazės-konjuguoto anti-triušio IgG ir anti-pelės IgG (1:2000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Dėmės buvo sukurta su ImmunoStar AP Substratas (Bio-Rad Laboratories).

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
schema atstovavimas COPZ2 pervežimas regione, kuriame MIR-152. Įdaryti dėžės atstovauti COPZ2
A ir tuščias langelis žymi neverstą regionas, COPZ2
egzonų. Pasilenkus rodyklė rodo transkripcija pradžios svetainėje COPZ2
. Vertikalios rodyklės rodo, miR-152 vietą. Vertikalios linijos rodo CpG svetainėse. Rodykles rodo regionus tikrintis JEP
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s001
(TIFF)
S2 pav.
poveikis transfekciją PPN-224 ir -452 Kato-III ląsteles. RT-PGR analizuoja po transfekciją su miR-224 ir /arba -452. Tikslinių genų ekspresija buvo analizuojami 48h vėliau RT-PGR. Pasaulis-224 ir -452 specialiai žemyn reguliuojama DPYSL2 parsisiųsti ir KRAS
, bet ne kitus penkis genus išnagrinėjo, kuris yra suderinamas su duomenų bazės analizė (3 paveikslas) rezultatus.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0062589.s002
(TIFF)
S1 lentelėje.
išraiška profiliavimas žmogaus miRNAs Kato-III ląstelių po 5-aza-CdR gydymo
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s003
(XLSX)
lentelė S2.
sąrašas tikslinių genų, kurių išraiškos mes išnagrinėjo RT-PCR po gydymo su arba be 5-aza-CdR ir transfekcija su iš siDICER1 20 nmol /l arba plakta siRNA
Doi:. 10,1371 /journal.pone .0062589.s004
(XLSX)
S3 lentelėje.
sekos gruntai naudojami šiame tyrime
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s005
(XLSX)

Padėka

Mes norime padėkoti dr Bertas Vogelstein už suteiktą DICER1 grandininį iš HCT116 ląstelių linijos.

• PLoS ONE: Hipoksija skatina skrandžio vėžio ląstelių EMT per autokrining TGFβ Signaling
• PLoS ONE: Flotillin2 išraiška koreliuoja su HER2 lygiai ir blogos prognozės skrandžio Cancer