PLoS ONE: Multiple-to-molteplici relazioni tra microRNA e geni bersaglio di cancro gastrico

Estratto

I microRNA (miRNA) agiscono come regolatori trascrizionali e giocano un ruolo cardine nella carcinogenesi. Secondo database di destinazione miRNA, un miRNA possono disciplinare molti geni come i suoi obiettivi, mentre un gene può essere bersaglio di molti miRNA. Questi risultati indicano che le relazioni tra miRNA ei loro obiettivi non possono essere uno-a-uno. Tuttavia, molte relazioni hanno descritto solo uno-a-uno, uno-a-multiple o multiplo ad-uno tra miRNA e il suo gene bersaglio in tumori umani. Quindi, è necessario determinare se una combinazione di alcuni miRNA regolerebbe bersagli multipli ed essere coinvolti nella carcinogenesi. Per trovare alcuni gruppi di miRNA che possono sinergicamente regolare i loro obiettivi nel cancro gastrico umano (GC), abbiamo ri-analizzato i nostri dati miRNA precedente espressione di array e abbiamo trovato che 50 miRNA sono up-regolati sul trattamento con 5-aza-2'-deossicitidina in una linea cellulare GC. Il database di destinazione miRNA "TargetScan" previsto che alcuni di questi miRNA hanno geni bersaglio comuni. Abbiamo anche fatto riferimento alla banca dati GEO per l'espressione di questi geni bersaglio comuni in GC umana, che potrebbero essere correlati alla cancerogenesi gastrica. In questo studio, abbiamo analizzato due combinazioni di miRNA, miR-224 e -452, e miR-181 quater e -340. Over-espressione di entrambe le combinazioni miRNA drammaticamente down-regolato i loro geni bersaglio, DPYSL2
e KRAS
, e KRAS
e MECP2
, rispettivamente. Queste combinazioni miRNA sinergicamente diminuita proliferazione cellulare su di trasfezione. Inoltre, abbiamo rivelato che questi miRNA sono stati down-regolati attraverso ipermetilazione del promotore in cellule GC. Pertanto, è probabile che i rapporti tra miRNA ei loro bersagli non sono uno-a-uno, ma multiple-to-multiple in GC, e che queste relazioni complesse possono essere riportate carcinogenesi gastrica

Visto:. Hashimoto Y, Y Akiyama, Yuasa Y (2013) multiple-to-molteplici relazioni tra microRNA e geni bersaglio di cancro gastrico. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10.1371 /journal.pone.0062589

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Giappone

Ricevuto: December 14, 2012; Accettato: 24 marzo 2013; Pubblicato: May 8, 2013

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal A3 Foresight Programma della Società giapponese per la Promozione della Scienza (JSP) (YY), e le borse di ricerca del JSPS per giovani scienziati (YH). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

i microRNA (miRNA), una classe di piccoli RNA non codificanti proteine, sono stati identificati come un nuovo tipo di gene regolatore che si legano alle regioni 3'-non tradotte (UTR) di mRNA bersaglio, ottenendo in tal modo in degradazione dell'mRNA o il blocco della traduzione dell'mRNA [1]. È generalmente noto che le alterazioni miRNA sono associati tumorigenesi [1]. Secondo database di destinazione miRNA, un miRNA possono disciplinare molti geni come i suoi obiettivi, mentre un gene può essere bersaglio di molti miRNA. Tuttavia, numerosi studi hanno rivelato una relazione uno a uno tra miRNA e il suo gene bersaglio. E 'stato anche riportato che multipla o un gruppo di miRNA co-operativamente regolamentazione di un gene, che è legato alla carcinogenesi [2] - [4]. D'altro canto, più geni sono mirati da uno miRNA [3], [4]. Anche più a molteplici relazioni tra miRNA e gli obiettivi sono stati riportati utilizzando analisi computazionali [5], [6]. Tuttavia, ci sono stati solo pochi documenti sperimentalmente convalida relazioni multiple-to-multiple nelle cellule tumorali.

cancro gastrico è la quarta malattia maligna umana più comune e la seconda causa più frequente di morte per cancro in tutto il mondo, con una stima di un milione di nuovi casi all'anno [7]. tumori gastrici sono istologicamente classificate in due tipi principali, i tipi intestinali e diffuse [8]. Diffuse-tipo GC è spesso intrattabile e presenta una prognosi infausta paziente. Recentemente, abbiamo dimostrato che la perdita delle funzioni CDH1 e Trp53 induce tipo diffuso GC utilizzando modelli murini [9]. Anche se questo risultato ci aiuterà a sviluppare nuove terapie umane cancro gastrico, ulteriori indagini sulla carcinogenesi gastrica meccanismi molecolari alla base necessarie per sviluppare altri approcci per la terapia mirata.

Promotore CpG isola ipermetilazione è uno dei meccanismi più comuni per cui i geni soppressori tumorali vengono inattivati ​​nei tumori umani [10]. Recentemente, è diventato evidente che alcune miRNA sono anche obiettivi di silenziamento epigenetico nei tumori [11]. I nostri e di altri gruppi hanno già dimostrato che farmacologica o l'alterazione del gene metilazione del DNA in linee cellulari di cancro induce up-regolazione di un numero considerevole di miRNA [12] - [15]. Questi dati hanno portato alla individuazione di candidati miRNA tumore soppressiva cui silenziamento è associata a CpG isola metilazione. Finora, la metilazione dei familiari miR-124 è stato identificato nel cancro del colon-retto e nei tumori di altri organi [11]. Inoltre, il /c di cluster miR-34b ha una tipica isola CpG, ed è down-regolato attraverso frequente metilazione del colon-retto e cancro gastrico [12]. Allo stesso modo, abbiamo scoperto che miR-181 quater metilazione è associata a carcinogenesi gastrica attraverso la regolazione dei geni oncogeni KRAS
e NOTCH4
[13]. Down-regolazione di molti miRNA attraverso la metilazione avviene contemporaneamente nelle cellule tumorali, e può migliorare le relazioni multiple-to-multiple tra miRNA e gli obiettivi.

In questo studio, per convalidare multiple-to-molteplici relazioni tra miRNA e obiettivi nelle cellule tumorali, abbiamo dimostrato che due coppie di molteplici miRNA, miR-224 e -452, e miR-181 quater e -340, avevano più geni bersaglio e sinergicamente diminuiscono la proliferazione cellulare attraverso la regolamentazione dei loro bersagli nelle cellule umane di GC.

Risultati

50 miRNA sono stati up-regolati in un GC linea cellulare, KATO-III, dopo 5-aza-2'-deossicitidina trattamento

Per identificare miRNA candidati che influenzano la loro sinergicamente geni bersaglio, abbiamo ri-analizzato i nostri dati di microarray precedenti (GEO adesione n GSE16006) [13]. Abbiamo considerato che i livelli di miRNA sono up-regolati il ​​5-aza-2'-deossicitidina (5-AZA-CdR) trattamento quando le intensità netto di particolari 3 punti sono stati più di 1,5 volte. miRNA Inoltre, abbiamo anche selezionato di cui sono state trovate le medie per aumentare più di 3 volte su analisi microarray. Sulla base di questi nuovi criteri, abbiamo riscontrato che 50 miRNA sono stati up-regolate in una linea cellulare GC, KATO-III (Tabella S1). Abbiamo confermato l'up-regolazione di 5 su 6 miRNA rappresentative precursori, cioè, miR-145, -148a, -152, -224 e -340, dopo 5-AZA-CdR trattamento mediante RT-PCR (Figura 1A).

TargetScan predetto geni bersaglio comune dei miRNA candidati

per determinare se epigeneticamente miRNA regolamentati siano dotati di geni bersaglio comuni, abbiamo cercato il database TargetScan (versione 5.1) per i loro obiettivi comuni. Secondo TargetScan, 50 miRNA potrebbero essere classificati in 46 gruppi in base alle loro sequenze di semi. TargetScan anche mostrato che questi 46 gruppi possono indirizzare 6.460 geni. Tra questi geni bersaglio, abbiamo selezionato 13 dei quali è stato segnalato espressione essere aumentato in GC nel database GEO (GEO adesione n GSE2685) o essere correlato alla carcinogenesi gastrica (Tabella S2). Qui, ci concentriamo su quattro miRNA, miR-152, -181c, -224 e -340, perché abbiamo già riferito che miR-181 quater è epigeneticamente down-regolato in GC [13] e isole CpG si trovano nelle regioni a monte di altri tre miRNA (Figura 2A e C, e la figura S1). Figura 2a rivela anche che miR-452 è in cluster con miR-224. TargetScan previsto che i cinque miRNA possono regolare obiettivi comuni. Per esempio, DPYSL2
(diidropirimidasi-like 2, noto anche come il collasso risposta mediatore proteine ​​2, CRMP2
) viene preso di mira da miR-224, -452, e -181c, KRAS
da miR-224, -452, -181c, -340 e -152, e MECP2
(metil CpG binding protein 2) da miR-181 quater e -340, rispettivamente (Figura 3).

l'espressione di miR-224, -452, -152 e -340 Diminuzione sul DNA ipermetilazione in GC linee cellulari

Abbiamo esaminato il coinvolgimento dei cambiamenti epigenetici in down-regolazione dei miRNA. L'espressione del miR-224, -340 e -152 è stata aumentata di 5-AZA-CdR trattamento in diverse linee cellulari GC (Figura 1B). Abbiamo analizzato quantitativamente espressione matura miR-224 in 9 linee di cellule GC e una linea di cellule di cancro del colon-retto (CRC). Nessuna espressione di miR-224 è stato rilevato in 7 delle 10 linee di cellule di cancro (Figura 1C). Abbiamo anche analizzato il cambiamento espressione del cluster miR-224 /-452 nelle cellule KATO-III trattati con una bassa dose di 5-AZA-CdR (0,2 mmol /l), un inibitore dell'istone deacetilasi, tricostatina A (TSA, 0,3 micromol /l), o una combinazione di questi due farmaci. cellule KATO-III con il trattamento a basso dosaggio 5-AZA-CdR esposti up-regolazione del cluster miR-224 /-452, mentre TSA da solo non ha causato up-regulation. Il cluster miR-224 /-452 è stata sinergicamente up-regolata nelle cellule KATO-III con combinato 5-aza-CdR e il trattamento TSA (Figura 1D). Questi risultati indicano che miR-224 e miR-452 possono essere down-regolati attraverso la metilazione del DNA in linee cellulari GC come la stessa unità di trascrizione.

E 'stato riportato che miRNA intronic sono regolati tramite metilazione del promotore del loro ospite geni [14], [15]. Secondo i risultati di analisi computazionale, il miR-224 /-452 cluster e miR-340 si trovano in introni 6 in Gabre
e introne 2 in RNF130
rispettivamente, entrambi i quali contenere dense isole CpG soltanto nelle regioni promotrici di loro geni host (Figura 2A e C). Abbiamo studiato la relazione fra i livelli di espressione di questi miRNA e lo stato di metilazione dei geni ospitanti in linee cellulari GC mediante analisi MSP. linee di cellule GC senza miR-224 espressione esposto solo segnali di metilazione, mentre le linee cellulari di espressione-positivi hanno mostrato forti modelli unmethylation (Figura 2b). Una relazione simile è stato individuato per miR-340 in linee cellulari di GC (Figura 2D). Questi dati indicano che l'espressione di questi miRNA in linee cellulari GC può essere messa a tacere attraverso metilazione del promotore dei geni ospitanti.

epigeneticamente miRNA regolamentati potrebbe essere correlato al GC Cell Proliferation

Per determinare se epigeneticamente regolata miRNA sono tumore soppressiva o no, abbiamo valutato l'effetto di 5-AZA-CdR in siDICER1 transfettate KATO-III e DICER1 KO HCT116 (D1KO) cellule (Figura 4A). Le cellule non trattate HCT116 KATO-III e genitori hanno mostrato la proliferazione rallentata dopo il trattamento con 5-AZA-CdR. D'altra parte, nelle cellule KATO-III e D1KO siDICER1 transfettate, l'effetto di 5-aza-CdR trattamento sulla proliferazione cellulare è diventato debole in entrambi i casi. Questi risultati suggeriscono che l'effetto di 5-aza-CdR era diminuita in cellule basse o nulle DICER1, e che miRNA epigeneticamente regolamentati svolgono un ruolo importante in GC e cellule di CRC.

Per analizzare il rapporto tra queste miRNA e 13 geni bersaglio indicate nella Tabella S2, abbiamo transfettate cellule KATO-III con siDICER1 e /o trattati con 5-AZA-CdR. Anche se, espressione di 3 ( DPYSL2
, KRAS
e MECP2
) dei 13 geni erano diminuiti dopo 5-AZA-CdR trattamento, l'espressione di questi geni ha fatto non modificare il 5-AZA-CdR trattamento seguito da trasfezione di siDICER1 (Figura 4B).

Combinazionali Transfection di miR-224 e -452 repressa proliferazione cellulare GC

trasfettate linee di cellule GC con miR-224 e /o -452 imita come un rappresentante di cluster miRNA, o un controllo negativo, e poi eseguite tetrazolio-8 saggi (WST-8)-risolto acqua. Settantadue ore dopo la trasfezione, abbiamo osservato che l'espressione ectopica di miR-224 o -452 soppressa la crescita di due linee cellulari, Kato-III e AGS (Figura 5A). In particolare, trasfezione combinatoria del miR-224 e -452 imita ampiamente diminuita la crescita delle linee cellulari due GC (Figura 5A).

Il miR-224 /-452 Cluster Co-operatorio Espressione Diminuzione di DPYSL2
e KRAS

per indagare se il cluster miR-224 /-452 è in realtà legata alla regolazione del DPYSL2
e KRAS
, abbiamo analizzato l'espressione di DPYSL2
dopo la transfezione di cellule KATO-III e AGS con soli o insieme il cluster miR-224 /-452. Abbiamo effettuato RT-PCR e analisi Western Blot. Il DPYSL2
e KRAS
livelli di mRNA sono stati diminuiti dopo trasfezione con il miR-224 o miR-452 mimica (Figura 5B). È interessante notare che, nel caso di trasfezione combinatorio con miR-224 e -452, espressione di questi geni bersaglio era più in basso-regolato (Figura 5B). Il down-regolazione di DPYSL2 è stata osservata anche a livello proteico nelle due linee cellulari (Figura 5C). Abbiamo anche esaminato i livelli di espressione di altri cinque geni, MECP2, MYC, JunB, MUC1
e SETDB1
, che non sono stati mostrato come obiettivi per miR-224 o -452 da TargetScan. Come previsto, nessuna modifica espressive di questi cinque geni sono stati trovati in cellule KATO-III dopo trasfezione con miR-224 o -452 (figura S2). Questi dati suggeriscono che miR-224 e -452 specificamente down-regolato DPYSL2
e KRAS
.

DPYSL2
è stata associata con GC proliferazione cellulare

Abbiamo esaminato l'effetto di atterramento di DPYSL2
, che ha dimostrato di essere un obiettivo del cluster miR-224 /-452, sulla proliferazione delle cellule. La trasfezione di DPYSL2
siRNA chiaramente diminuito i livelli del DPYSL2
trascrizioni (Figura 5D), e ha inibito la crescita delle cellule AGS e KATO-III 72 ore dopo l'atterramento di DPYSL2
(Figura 5E), che indica che DPYSL2 ha un'attività oncogeno.

Combinazionali Transfection di miR-340 e GC -181c repressa proliferazione cellulare, e indotta down-regulation di KRAS
e MECP2
Espressione

Come secondo esempio di relazioni multiple-to-multiple tra microRNA e geni bersaglio, abbiamo analizzato la relazione tra miR-340 /-181c e KRAS /MECP2 .
Quando miR-340 e miR-181 quater sono state trasfettate in cellule KATO-III, la proliferazione era sinergicamente down-regolato da due miRNA (Figura 6a). Per determinare se epigeneticamente regolata miR-340 e miR-181 quater co-operativamente influenzare i loro obiettivi, abbiamo analizzato i livelli di mRNA di KRAS
e MECP2.
On analisi RT-PCR, KRAS
e MECP2
sono stati trovati ad essere down-regolato da miR-340 e miR-181 quater da solo, o trasfezione combinatoria nelle cellule KATO-III (Figura 6B). Per quanto riguarda i quattro geni, MYC, JunB, MUC1
e SETDB1
, senza mostrare i siti previsti per questi due miRNA da TargetScan, i livelli di espressione non sono stati cambiati in questo studio. dati rappresentativi sono mostrati in figura 6B. Così, gli effetti di miR-340 e -181c possono essere specifici per i loro geni bersaglio comuni e miR-224 e -452.

L'espressione e la metilazione stato di miR-224 e -340, cause primarie GC

Abbiamo esaminato lo stato di metilazione di miR-224 e -340 in casi GC primari. modelli metilati di miR-224 sono stati rilevati in 15 su 26 (57,7%) i tessuti GC primari (figura 7a e Tabella 1). Accoppiato mucose gastriche non-cancerose difficilmente esposto un modello di metilazione di miR-224. Successivamente, abbiamo esaminato quantitativamente i livelli di miR-224 nei tessuti GC primarie e corrispondente mucose non-cancerose da TaqMan RT-PCR. Una riduzione significativa di espressione di miR-224 nei tessuti GC è stata osservata in casi di cancro metilazione-positivo rispetto a quelli di metilazione-negativi e mucose gastriche non-cancerose (Figura 7C).

Abbiamo inoltre analizzato la DPYSL2
livelli di mRNA nel confronto con lo stato di metilazione di miR-224 nei tessuti GC: GC con miR-224 metilazione (Ca miR-224 Mt), GCs con miR-224 unmethylation (Ca miR-224 Un), e non tessuti -cancerous con unmethylation (N miR-224 oNU). Il DPYSL2
livello di mRNA nel gruppo "Ca miR-224 Mt" era significativamente più alta rispetto a quelli del "N miR-224 Un" e "Ca miR-224 un" gruppi, p = 0,049 ep = 0,035, rispettivamente (figura 7D). Quindi, vi è una correlazione tra lo stato di metilazione di miR-224 e DPYSL2
espressione nei tessuti GC.

La frequenza di metilazione miR-340 è stata relativamente bassa nei tessuti GC primari provati (4 di 26, 15,4%) (Figura 7B e Tabella 1), mentre nessuno dei 26 accoppiato non-cancerosa mucose gastriche esposto metilazione apparenti di miR-340. Per quanto riguarda il miR-152 analisi di metilazione, abbiamo provato tre set di primer disegnati nella regione a monte del miR-152 che contengono isole CpG (Figura S1), ma nessuno di loro completamente abbinato miR-152 espressione su MSP analisi (dati non riportati).

Discussione

Anche se è stato riportato che l'espressione di alcuni miRNA è diminuita in molti tipi di cancro attraverso la metilazione del DNA, la maggior parte dei rapporti descritto che il rapporto tra l'espressione aberrante di miRNA e dei suoi geni bersaglio era uno-a-uno, uno-a-multipla o multiple-a-uno. Per esaminare la possibilità di relazioni multiple-to-multiple tra miRNA e obiettivi nelle cellule tumorali, ci siamo concentrati su due combinazioni di miRNA in cellule di GC, il miR-224 /-452 cluster e miR-181 quater e -340, in questo studio . Abbiamo trovato che le due serie di miRNA, miR-224 e -452, e miR-181 quater e -340, avevano più geni bersaglio, DPYSL2
e KRAS
, e KRAS Comprare e MECP2
rispettivamente, e sinergicamente diminuita proliferazione cellulare in linee cellulari umane GC. È da notare che un oncogene, KRAS
[16], è stato trovato per essere preso di mira da quattro miRNA, anche se candidati siti di legame dei quattro miRNA sono diversi nel 3'-UTR di KRAS
(TargetScan). Abbiamo precedentemente riportato che il miR-181 quater down-regolato NOTCH4
troppo [13]. Così, multiple-to-molteplici relazioni tra miRNA e gli obiettivi sono stati indicati non solo dal database di analisi, ma anche per gli esperimenti di trasfezione che coinvolgono le cellule umane.

MIR-224- e /o -340-espressione-negativi linee cellulari GC segnali hypermethylation esposti su analisi MSP e l'espressione di miR-224 e -340 ripristinati sul trattamento agente demethylating. Inoltre, ipermetilazione di miR-224 e -340 è stata più frequentemente osservata in GC primaria rispetto corrispondente mucose noncancerous. Nei casi di metilazione-positivo miR-224, espressione di miR-224 era significativamente più bassa rispetto a quelli di metilazione-negativo. Questi dati indicano chiaramente che aberrante metilazione del DNA è uno dei meccanismi chiave alla base down-regolazione di miR-224 e -340 in cellule di GC.

Abbiamo dimostrato che l'inibizione del trattamento miRNA da siDICER1 trasfezione o utilizzando DICER1 knockout cellule diminuito l'effetto di 5-aza-CdR, cioè, riduzione della proliferazione cellulare e down-regolazione dei geni bersaglio, in GC e cellule di CRC. E 'stato riportato che l'abbondanza di DICER1, l'enzima che catalizza la fase finale di miRNA maturazione è direttamente associata a progressione tumorale [17]. Questi risultati suggeriscono che la regolamentazione aberrante di miRNA maturazione contribuisce alla GC e la formazione di CRC.

Abbiamo trovato che il cluster miR-224 /-452 è stato aberrante down-regolato in GC attraverso hypermethylation. espressione aberrante di miR-224 è stata riportata anche in altri tumori. L'espressione di miR-224, let-7f e miR-516a è diminuita nel cancro ovarico, e in sinergia regolare l'espressione di peptidasi kallikrein legati 10 (KLK10) [18]. miR-224 è down-regolato in linee cellulari di CRC metotressato resistente rispetto a nelle cellule sensibili [19]. Qui si ha anche rivelato che lo stato di metilazione di miR-224 è stata correlata con il DPYSL2
livello GC umano. Presi insieme, miR-224 svolge un ruolo importante come miRNA tumore soppressiva in GC così come in molti altri tipi di cancro. Al contrario, miR-224 è up-regolato nei carcinomi epatocellulari [20] e [21] medulloblastomas rispetto nei tessuti normali. Così, ulteriori studi sono necessari per chiarire il ruolo di miR-224 nella carcinogenesi.

Abbiamo studiato gli obiettivi comuni di miRNA epigeneticamente down-regolato. DPYSL2
ha dimostrato di essere down-regolato da miR-224 e -452. DPYSL2 svolge un ruolo importante nella creazione di polarità neuronale [22]. DPYSL2 è anche coinvolto in percorsi che regolano la proliferazione delle cellule non neuronali attraverso la sua fosforilazione da proteine ​​regolatrici. DPYSL2 subisce cambiamenti dinamici fosforilazione in risposta al contatto quiescenza inibizione indotta e iperfosforilazione di DPYSL2 si verifica in un tumore [22]. Anche se il ruolo di DPYSL2 in GC non è chiaro, il nostro atterramento siRNA a base di espressione DPYSL2 indotto una riduzione della proliferazione delle due linee di cellule GC, suggerendo l'attività oncogenica di DPYSL2.

In sintesi, i nostri risultati indicano che multiple-to-molteplici relazioni tra miRNA e geni bersaglio esistono realmente in GC. E 'probabile che la metilazione aberrante riduce l'espressione dei miRNA multiple tumore soppressiva, come miR-224, -452, -340 e -181c, che poi inducono sovra-espressione di più geni oncogeni, come KRAS
, DPYSL2
, e MECP2
. Queste anomale relazioni multiple-to-multiple tra miRNA e obiettivi sarebbe uno dei meccanismi importanti sottostante carcinogenesi gastrica. È quindi altamente possibile che i farmaci epigenetici possono normalizzare l'espressione non solo geni tumore-soppressiva ma anche più miRNA tumore-soppressiva, con conseguente diminuzione dei anormali rapporti multipli-to-multiple tra miRNA e target, e quindi può diventare farmaci terapeutici eccellenti contro il cancro.

Materiali e Metodi

etica Dichiarazione

consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti, e il comitato etico di Tokyo Medical and Dental University School of Medicina approvato questa ricerca.

linee cellulari e campioni di tessuto

Sono stati studiati 9 linee di cellule GC (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 e GCIY), 2 linee cellulari CRC (HCT116 e DICER1
knock out HCT116 [23]), e 26 casi GC primari. MKN45, MKN74, TGBC11TKB e GCIY sono stati acquistati dalla banca di cellule RIKEN, e KATO-III e AGS erano da ATCC (di tipo americano cellulare Collection). HSC59, HSC43 e HSC58 sono stati ottenuti da Dr. Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO-III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 e HSC58 sono state coltivate in RPMI 1640, e AGS, TGBC11TKB, GCIY e le due linee di cellule CRC a Dulbecco di modificare mezzo di Eagle, mezzo essenziale minimo o 5A di McCoy, supplementato con 10% fetale bovino siero. esemplari resezione chirurgica da 26 pazienti CG primari sono stati ottenuti in modo casuale dalla Ospedale Affiliato della School of Medicine, Tokyo Medical and Dental University.

analisi in silico

Abbiamo fatto riferimento al database GEO per miRNA e profili di espressione genica (GEO adesione n GSE16006 e GSE2685). Abbiamo anche usato miRNA database di destinazione "TargetScan".

Il trattamento della droga di celle e RNA Estrazione

Per gli studi di demetilazione, le cellule sono state trattate con i giorni 5 mmol /l 5-AZA-CdR (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) per 72 ore. Abbiamo anche trattati cellule con 0,3 mmol /l TSA da solo, e con una combinazione di 0,2 mmol /l 5-aza-CdR e TSA. L'RNA totale è stato isolato utilizzando il reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) o un kit miRNeasy mini (Qiagen, Hilden, Germania).

quantitativa in tempo reale trascrizione inversa-Polymerase Chain Reaction

in tempo reale reazione a catena inversa trascrizione-polimerasi (RT-PCR) analisi sono state effettuate utilizzando un StepOne real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq master Mix con ROX (Roche, Mannheim, Germania), una TaqMan Reverse kit Trascrizione (Applied Biosystems), e saggi TaqMan miRNA (Applied Biosystems), in base alle istruzioni del fabbricante. I livelli di espressione di miRNA sono calcolati sulla base della quantità di bersaglio miRNA rispetto a quello di RNU6B come controllo per normalizzare l'input iniziale di RNA totale.

La metilazione Analisi

trattamento bisolfito di DNA era eseguito con Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). reazione a catena della polimerasi (MSP) analisi metilazione-specifica sono state eseguite come descritto in precedenza [26]. Le sequenze di primer e le dimensioni dei prodotti di PCR sono riportati nella tabella S3.

sintetica miRNA Transfection

cellule KATO-III e AGS sono state transfettate con una molecola precursore imitando miR-224, -452, -340 o -181c, o una sequenza scrambled miRNA (Sigma) per dare una concentrazione finale di 25-50 nmol /l utilizzando un elettroporatore, Neon (Invitrogen), secondo le istruzioni del produttore. A 24-72 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte per la RT-PCR o analisi Western Blot.

Proliferation Assay
cellula cellule

miR-mimico-trasfettate KATO-III e AGS sono stati placcati a 1 × 10 ^{3 o 1 × 10 4 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. La proliferazione cellulare è stata valutata nei giorni 1-4 dopo la trasfezione determinando il numero di cellule con la proliferazione cellulare reagente WST-8 (Dojindo Tecnologie Molecolari, Inc., Mashikimachi, Giappone), secondo le istruzioni del produttore.}

miRNA Previsione target e Western Blotting

Gli obiettivi previsti dei miRNA ei loro siti bersaglio sono stati analizzati utilizzando TargetScan. I livelli di espressione di mRNA degli obiettivi previsti in cellule trasfettate sono state analizzate 24 ore dopo la trasfezione mediante RT-PCR. analisi Western blot sono stati eseguiti come precedentemente descritto [26]. L'anticorpo primario utilizzato era di coniglio anti-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Cell Signaling Tecnologia, Danvers, MA). Abbiamo usato topo anti-α-tubulina (1:1000; SC-8085, Santa Cruz Biotechnology) come controllo interno per Western blotting. Gli anticorpi secondari utilizzati erano fosfatasi alcalina coniugato anti-IgG di coniglio anti-IgG di topo (1:2000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Macchie sono stati sviluppati con ImmunoStar AP substrato (Bio-Rad Laboratories).

informazioni di supporto
Figura S1.
Rappresentazione schematica del COPZ2
regione contenente miR-152. scatole piene rappresentano gli esoni di COPZ2
A e una casella vuota indica la regione non tradotta di COPZ2
. Una freccia piegata indica il sito di inizio trascrizione di COPZ2
. Una freccia verticale indica la posizione del miR-152. Le linee verticali indicano i siti CpG. Punte di freccia indicano le regioni esaminate per MSP
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s001
(TIFF)
Figura S2.
Effetti della trasfezione di miR-224 e -452 in cellule KATO-III. RT-PCR analisi dopo trasfezione con miR-224 e /o -452. L'espressione di geni bersaglio è stato analizzato 48h successivamente mediante RT-PCR. miR-224 e -452 specificamente down-regolato DPYSL2
e KRAS
, ma non altri cinque geni esaminati, che siano coerenti con i risultati delle analisi del database (Figura 3).
doi: 10.1371 /journal.pone.0062589.s002
(TIFF)
Tabella S1.
espressione profiling di miRNA umani in cellule KATO-III dopo il trattamento 5-AZA-CdR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s003
(XLSX)
Tabella S2.
Elenco dei geni bersaglio di cui espressione abbiamo esaminato mediante RT-PCR dopo il trattamento, con o senza 5-AZA-CdR, e trasfezione con 20 nmol /L di siDICER1 o scrambled siRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone .0062589.s004
(XLSX)
Tabella S3.
sequenze di primer utilizzati in questo studio
doi: 10.1371. /journal.pone.0062589.s005
(XLSX)

Riconoscimenti

Si ringraziano il Dott Bert Vogelstein per la fornitura del knock-out linea cellulare HCT116 DICER1.

• PLoS ONE: ipossia Stimola la EMT delle cellule cancro gastrico attraverso Autocrina TGFβ Signaling
• PLoS ONE: Flotillin2 espressione è correlata con i livelli di HER2 e prognosi infausta a gastrico Cancer