Plos ONE: Multiple-to-Multiple odnosih med MicroRNAs in ciljnih genov želodčnega raka

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) deluje kot transkripcijske regulatorje in igra osrednje vloge v rakotvornost. Po ciljnih podatkovnih baz miRNA, lahko ena miRNA uravnavajo številne gene kot svojih ciljev, medtem ko se en gen lahko tarča številnih miRNAs. Te ugotovitve kažejo, da je odnos med miRNAs in njihovih ciljev ne sme biti ena proti ena. Vendar pa je veliko poročil opiše le ena-na-ena, ena-na-multiple ali multiple-v-enem razmerja med miRNA in njenega ciljnega gena v človeški raka. Zato je treba ugotoviti, ali bi ali ne bi kombinacija nekaterih miRNAs urediti več ciljev in biti vključeni v rakotvornost. Najti nekaj skupin miRNAs, ki lahko v sinergiji urejajo svoje cilje človeškega raka želodca (GC), smo ponovno analizirali naše prejšnje miRNA izraz nizov podatkov in ugotovila, da je bilo 50 miRNAs reguliran na zdravljenje s 5-aza-2'-deoksicitidinska v GC celične linije. "TargetScan" target miRNA podatkovna baza napovedal, da so nekateri od teh miRNAs skupnih ciljnih genov. Smo imenovan tudi baze GEO za ekspresijo teh skupnih ciljnih genov v človeškem GK, ki se lahko povezanih z želodčno karcinogenezo. V tej študiji smo analizirali dva Mirna kombinacije, MIR-224 in -452 in MIR-181c in -340. Prekomerno izražanje obeh kombinacij miRNA močno navzdol uredile svoje ciljne gene, DPYSL2
in KRAS
in KRAS
in MeCP2
oz. Te kombinacije MIRNA sinergijsko zmanjšano proliferacijo celic po transfekciji. Poleg tega smo je pokazala, da so bile te miRNAs navzdol urejeno s promotorja hypermethylation v GC celicah. Zato je verjetno, da so odnosi med miRNAs in njihovih ciljev ni ena-na-ena, a multiple-to-večkratnik v GK, in da se ti zapleteni odnosi lahko povezane z želodčno rakotvornost

Navedba:. Hashimoto Y, Akiyama Y, Yuasa Y (2013) Multiple-to-Multiple odnosih med MicroRNAs in ciljnih genov želodčnega raka. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10,1371 /journal.pone.0062589

Urednik: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonska

Prejeto: 14. december 2012; Sprejeto: 24. marec 2013; Objavljeno: 8. maj 2013

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl delno z donacijami A3 predvidevanja programa na Japonsko društvo za promocijo znanosti (JSP) (LL) in raziskovalne štipendije v JSP-jev za mlade znanstvenike (YH). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

MicroRNAs (miRNAs), ki je razred majhnih brez beljakovin kodiranja RNA, so bile opredeljene kot nov tip genskega regulatorja, ki se vežejo na 3'-neprevedenih regijah (UTRs) s ciljnim mRNA, kar ima za posledico degradacijo mRNA ali blokade mRNA prevajanja [1]. Je splošno znano, da so Mirne spremembe, povezane z tumorigeneze [1]. Po ciljnih podatkovnih baz miRNA, lahko ena miRNA uravnavajo številne gene kot svojih ciljev, medtem ko se en gen lahko tarča številnih miRNAs. Vendar pa številne študije pokazale ena proti ena razmerje med miRNA in njenega ciljnega gena. Ugotovljeno je bilo tudi, da je multipla ali skupek miRNAs co-operativno uravnavajo gen, ki je povezano z karcinogenezo [2] - [4]. Po drugi strani pa je več geni usmerjena z enim miRNA [3], [4]. Celo večkratno do različnih razmerij med miRNAs in cilji so poročali s pomočjo računalniških analiz [5], [6]. Vendar pa je bilo le nekaj dokumentov eksperimentalno potrjevanje več-to-multiple odnose v rakavih celicah.

Rak želodca je četrti najpogostejši človeška maligne bolezni in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu, z ocenjenih enega milijona novih primerov na leto [7]. Želodčni rak so histološko razdeljeni v dve veliki skupini, črevesne in razpršenih vrste [8]. Difuzna tip GC je pogosto trdovratne in kaže slabo prognozo pacienta. V zadnjem času, smo pokazali, da je izguba funkcij Cdh1 in Trp53 povzroči razpršeno tipa GC uporabo miši modelov [9]. Čeprav se nam bo ta ugotovitev pomagala razviti nove človeške želodčne zdravljenja raka, nadaljnje preiskave na molekularni mehanizmi osnovnega želodca rakotvornosti so potrebni za razvoj drugih pristopov za usmerjeno terapijo.

Promotor CpG otok hypermethylation je ena izmed najpogostejših mehanizmov s katerimi so tumor supresorski geni inaktiviramo pri človeških rakih [10]. V zadnjem času je postalo jasno, da so tudi nekateri miRNAs cilji epigenetske utišanje v raka [11]. Naši in druge skupine, ki so že pokazali, da farmakološkega ali genetske motnje metilacije DNA v celičnih linijah raka povzroča up-ureditev večjega števila miRNAs [12] - [15]. Ti podatki privedla do identifikacije kandidatk tumorskih-omejevalno miRNAs katerih dušenje zvoka je povezana z CpG otoku metilacije. Doslej je bila metilacija miR-124 družinskih članov, opredeljenih v kolorektalnega raka in tumorjev drugih organov [11]. Poleg tega miR-34b /c grozd ima tipično otok CpG, ki je navzdol regulirano s pogostim metilacije v debelega črevesa in želodca raka [12]. Prav tako smo ugotovili, da je miR-181c metilacija povezana z želodčno kancerogenosti z regulacijo onkogenih genov KRAS
in NOTCH4
[13]. Dol-ureditev mnogih miRNAs preko metilacije hkrati pojavi pri rakavih celic, in lahko poveča več-to-multiple odnose med miRNAs in cilje.

V tej študiji, da bi preverili multiple do različnih razmerij med miRNAs in ciljev v rakavih celicah, smo pokazali, da je imel dva para več miRNAs, mIR-224 in -452, in pokoj-181c in -340, več ciljnih genov in sinergistično zmanjšano proliferacijo celic z regulacijo svojih ciljev v GC celic.

Rezultati

50 miRNAs so up-urejena v celični liniji GC, KATO-III, po 5-aza-2'-deoksicitidin Zdravljenje

Če želite ugotoviti miRNAs kandidatke, ki sinergično vplivajo na njihovo ciljni geni, smo ponovno analizirali naše prejšnje podatkov mikromrež (GEO pristop št GSE16006) [13]. Upoštevali smo, da so ravni Mirna reguliran na 5-aza-2'-deoksicitidinsko (5-aza-CdR) zdravljenja, ko so bili neto intenzivnosti posameznih 3 pike več kot 1,5-krat. Poleg tega smo jih izbrali tudi miRNAs za katere je bilo ugotovljeno povprečen se povečala za več kot 3-krat na analizo mikromrež. Na podlagi teh novih meril, smo ugotovili, da je bilo 50 miRNAs up-urejena v celični liniji GC, KATO-III (tabela S1). Potrdili smo regulacijo navzgor 5 od 6 reprezentativnih miRNAs predhodnikov, da je miR-145, -148a, -152, -224 in -340, po 5-aza-CdR zdravljenjem z RT-PCR (slika 1A).

TargetScan Predvideni skupni cilj geni kandidatk miRNAs

Da bi ugotovili, ali so regulirane miRNAs imajo epigenetically skupne ciljne gene, smo iskali baze podatkov TargetScan (različica 5.1) za njihove skupne cilje. Po TargetScan bi 50 miRNAs uvrstiti v 46 skupin, ki temeljijo na njihovih semen sekvenc. TargetScan tudi pokazala, da se lahko te 46 skupine ciljajo 6,460 gene. Med temi ciljnih genov, smo izbrali 13, od katerih je poročal izraz, ki se v GC se je v GEO baze podatkov (GEO pristopa št GSE2685) ali da so povezane s želodčne rakotvornosti (tabela S2). Tu smo se osredotočili na štiri miRNAs, miR-152, -181c, -224 in -340, ker smo že poročali, da je miR-181c epigenetically navzdol urejeno v GC [13] in CpG otoki se nahajajo v nabavnih regijah tri druge miRNAs (Slika 2A in C, in na sliki S1). Slika 2a razkriva tudi, da je miR-452 gruči z miR-224. TargetScan napovedal, da lahko pet miRNAs ureditev skupnih ciljev. Na primer, DPYSL2
(Dihidropirimidinaza podobnih 2, znan tudi kot zrušiti odzivni mediator protein 2, CRMP2
) je namenjenih miR-224, -452, in -181c, KRAS
s miR-224, -452, -181c, -340 in -152 in MeCP2
(metil CpG veže protein 2), ki ga pokoj-181c in -340, oziroma (slika 3).

Izražanje miR-224, -452, -152 in -340 zmanjšana na DNK Hypermethylation v GC celičnih linijah

preučila smo sodelovanje epigenetskih sprememb v down-regulacijo miRNAs. Izraz miR-224, -340 in -152 je bila v več GC celičnih linij (slika 1B) povečala za 5-aza-CdR zdravljenja. Smo kvantitativno analizirali zrel miR-224 izraz v 9 GC celičnih linij in celične linije kolorektalnega raka (CRC). Ne izraz miR-224 je bila odkrita pri 7 od 10 rak celičnih linij (slika 1C). Analizirali smo tudi spremembo izražanja miR-224 /-452 grozda v celicah KATO-III, zdravljenih z nizkim odmerkom 5-aza-CdR (0,2 mol /l), inhibitor histon-trichostatin A (TSA, 0,3 mol /l), ali s kombinacijo obeh zdravil. KATO-III celic pri zdravljenju z nizkim odmerkom 5-aza-CdR razstavljene up-regulacije miR-224 /-452 grozda, ker TSA sam ni povzročil regulacijo navzgor. MIR-224 /-452 grozda je sinergistično up-urejena v celicah KATO-III s kombiniranim 5-aza-CdR in zdravljenje TSA (Slika 1D). Ti rezultati kažejo, da miR-224 in miR-452 se lahko navzdol urejeno preko metilacije DNA v GC celičnih linijah kot v enakem transkripcijski enoti.

To so poročali, da so intronskih miRNAs urejajo z promotorja metilacije gostiteljem geni [14], [15]. Glede na rezultate računske analize, MIR-224 /-452 grozdov in miR-340 se nahaja v intronu 6 v GABRE
in intron 2 v RNF130
, oziroma, ki sta vsebujejo gosto CpG otokov samo v promotorskih regijah svojih genov gostitelja (slika 2A in C). Raziskovali smo odnos med izražanjem teh miRNAs in metilacijskega statusa njihovih gostiteljskih genov v celičnih linijah GC z analizo PPN. GC celične linije brez miR-224 izražanja razstavljena samo metilacijskih signalov, medtem ko izraz pozitivnih celičnih linijah razstavljena močne unmethylation vzorcev (slika 2B). Podoben odnos je bil odkrit miR-340 v celičnih linijah GC (slika 2D). Ti podatki kažejo, da se izraz teh miRNAs v celičnih linijah GC lahko utišal z promotorja metilacije njihovih genov gostitelja.

Epigenetically regulirani miRNAs Mogoče se Povezano GC Cell širjenju

Če želite ugotoviti, ali epigenetically urejeno miRNAs so tumor-omejevalno ali ne, smo ocenili učinek 5-aza-CdR v siDICER1-transfektirane KATO-III in DICER1 KO HCT116 (D1KO) celic (slika 4A). Pri nezdravljeni KATO-III in starševski HCT116 celice pokazala zavira proliferacijo po zdravljenju s 5-aza-CdR. Po drugi strani pa siDICER1-transfekciji Kato-III in D1KO celic učinek 5-aza-CdR zdravljenje na celično proliferacijo tekmi v obeh primerih šibko. Ti rezultati kažejo, da je bil učinek 5-aza-CdR zmanjšala v nizkih ali null DICER1 celic, in da epigenetically regulirane miRNAs igrajo pomembno vlogo pri GC in CRC celic.

Da bi analizirali odnos med njimi miRNAs in 13 ciljnih genov prikazani v tabeli S2, smo transfektirali celice KATO-III z siDICER1 in /ali obdelani s 5-aza-CdR. Čeprav je izraz 3 ( DPYSL2
, KRAS
in MeCP2
) od 13 genov, ki so bile po 5-aza-CdR zdravljenja zmanjšala, izražanje teh genov storil ne spremeni na 5-aza-CdR zdravljenje sledi transfekciji siDICER1 (slika 4B).

kombinacijske transfekcija miR-224 in -452 zatrta GC Cell orožja

transfektirali celičnih linij GC z miR-224 in /ali -452 posnema kot predstavnik miRNA grozdov ali negativno kontrolo, nato pa izvesti tetrazolijevega-8 teste (WST-8), z vodo rešen. Dvainsedemdeset ur po transfekciji smo ugotovili, da zunajmaternične izraz miR-224 ali -452 zatreti rast dveh celičnih linij, KATO-III in AGS (Slika 5A). Predvsem, kombinacijska transfekcija MIR-224 in -452 posnema veliki meri zmanjšalo rast dveh GC celičnih linij (slika 5A).

MIR-224 /-452 Cluster Co operaciji Zmanjšana Izražanje DPYSL2
in KRAS

da bi raziskali, ali je miR-224 /-452 grozd dejansko povezana z regulacijo DPYSL2
in KRAS
, smo analizirali izražanje DPYSL2
po transfekciji KATO-III in AGS celic s samostojno ali skupaj grozda miR-224 /-452. Izvedli smo RT-PCR in analizami Western blot. DPYSL2
in Kras
ravni mRNA so po transfekciji s miR-224 ali miR-452 posnemajo (slika 5B) zmanjšala. Zanimivo je, da v primeru kombinacijsko transfekciji z miR-224 in -452 je izražanje teh ciljnih genov dalje navzdol regulirano (slika 5B). Navzdol-ureditev DPYSL2 opazili tudi na ravni proteina v obeh celičnih linij (slika 5C). Proučili smo tudi raven izražanja drugih pet genov, MeCP2, MYC, JUNB, MUC1
in SETDB1
, ki niso bili prikazani kot tarče za pokoj-224 ali -452 ga TargetScan. Kot je bilo pričakovati, niso bile ugotovljene izraznih spremembe teh petih genov v celicah KATO-III po transfekciji s miR-224 ali -452 (Slika S2). Ti podatki kažejo, da miR-224 in -452 posebej navzdol urejeno DPYSL2
in KRAS
.

DPYSL2
je bila povezana z GC Cell širjenju

preučila smo vpliv rasklapanje za DPYSL2
, ki je pokazalo, da je cilj mIR-224 /-452 grozda, na proliferacijo celic. Transfekciji DPYSL2
siRNA očitno znižala raven v DPYSL2
prepisi (Slika 5D) in zaviral rast AGS in KATO-III celic 72 ur po rasklapanje za DPYSL2
(slika 5E), kar kaže, da ima DPYSL2 z onkogenega dejavnost.

kombinacijske Transfekcija miR-340 in -181c zatrta GC Cell orožja, in povzročene dol-regulacijo KRAS
in MeCP2
Expression

Kot drugi primer več-to-multiple razmerij med microRNAs in ciljnih genov, smo analizirali odnos med miR-340 /-181c in KRAS /MeCP2 .
Ko so miR-340 in miR-181c transfektirali v celice KATO-III, je širjenje sinergistično z dvema miRNAs (slika 6a) navzdol regulirane. Da bi ugotovili, ali epigenetically urejeno MIR-340 in miR-181c co-operativno vplivajo na njihove cilje, smo analizirali ravni mRNA KRAS
in MeCP2.
Pri analizi RT-PCR, KRAS
in MeCP2
je bilo ugotovljeno, da se navzdol ureja miR-340 in samo pokoj-181c, ali kombinacijsko transfekciji v celicah KATO-III (slika 6B). Kot je za štiri gene, MYC, JUNB, MUC1
in SETDB1
, ki ne kaže nobenih predvidenih mest za ti dve miRNAs po TargetScan, stopnje izraženosti niso spremenili v tej študiji. Reprezentativne podatki so prikazani na sliki 6B. Tako lahko učinki miR-340 in -181c specifičen glede skupnih ciljnih genov, kot tudi miR-224 in -452.

Izražanje in metilacije Status miR-224 in -340 v Primary GC zadevah

preučila smo metilacijskega statusa miR-224 in -340 v osnovnih primerih GC. Denaturirani vzorci miR-224 so odkrili pri 15 od 26 (57,7%) osnovnih GC tkiva (slika 7A in preglednica 1). Paru, ki niso rakave želodca sluznice komaj pokazal metilacijo vzorec miR-224. Dalje, smo kvantitativno preučila raven miR-224 v osnovnih GC tkiv in ustrezno ne-rakasto sluznice s TaqMan RT-PCR. Ugotovljeno je bilo pomembno zmanjšanje miR-224 izražanja v GC tkiv primerov raka metilacijskih pozitivni v primerjavi z na metilacijskih negativnih tiste in ne-rakasto želodčne sluznice (slika 7c).

smo dodatno analizirali DPYSL2
ravni mRNA v primerjavi s statusom metilacijskega miR-224 v GC tkivih: GK z miR-224 metilacije (Ca miR-224 Mt), GCS z miR-224 unmethylation (Ca miR-224 ZN), in ne -cancerous tkiva s unmethylation (N miR-224 Un). DPYSL2
raven mRNA v skupini "Ca miR-224 Mt" je bil precej višji od tistih v "N miR-224 Un" in "Ca miR-224 Un" skupine, p = 0,049 in p = 0,035, oziroma (Slika 7D). Tako, da je korelacija med metilacijskega statusa miR-224 in DPYSL2
izražanja v GC tkivih.

metilacija frekvenca miR-340 je bil v glavni GC tkiv testiranih relativno nizka (4 od 26, 15,4%) (slika 7B in preglednica 1), medtem ko nobena od 26. paru niso rakavi želodca sluznice razstavljena očitne metilacije vzorce miR-340. Kot za miR-152 analizi metilacijskega Poskusili smo tri sete začetnih oligonukleotidov, izdelane v toku regiji miR-152, ki vsebuje CpG otokov (Slika S1), vendar nobeden od njih popolnoma ujema miR-152 ekspresijo v PPN analize (podatki niso prikazani).

Diskusija

Čeprav so poročali, da je izražanje nekaterih miRNAs zmanjšal na več vrst raka preko metilacije DNA, večina poročil opisano, da je razmerje med odklonskega izražanja miRNAs in ciljnih genov ena proti ena, ena proti multipli ali večkratni proti ena. Da bi preučili možnost več-to-multiple razmerij med miRNAs in cilje v rakavih celic, smo se osredotočili na dveh kombinacij miRNAs v GC celicah, MIR-224 /-452 grozd, in miR-181c in -340, v tej študiji . Ugotovili smo, da so imeli dva kompleta miRNAs, miR-224 in -452, in pokoj-181c in -340, več ciljnih genov, DPYSL2
in KRAS
in KRAS
in MeCP2
, v tem zaporedju, in sinergistično zmanjšano proliferacijo celic v GC humanih celičnih linijah. Omembe vredno je, da onkogena, KRAS
[16], je bilo ugotovljeno, da je tarča štirih miRNAs, čeprav so kandidatke veznih mest štirih miRNAs drugačen v 3'-UTR za KRAS
(TargetScan). Smo že poročali, da miR-181c navzdol regulirano NOTCH4
preveč [13]. Tako, multiple do različnih razmerij med miRNAs in cilji so označena ne le baze podatkov analiz, temveč tudi transfekcijskih poskusov, ki vključujejo človeške celice.

MIR-224- in /ali -340-izraz negativni GC celične linije Razstavljeni hypermethylation signali na analizo PPN in izražanje miR-224 in -340 obnovljena zdravljenjem demetiliranjem sredstva. Poleg tega je bila hypermethylation miR-224 in -340 pogosteje opazili pri primarnih GK kot ustreza noncancerous sluznice. V miR-224 metilacijskih pozitivnih primerih je bil izraz miR-224 bistveno nižje kot v metilacijskih negativne narave. Ti podatki jasno kažejo, da je zmotno DNA metilacija eden ključnih mehanizmov, povezanih navzdol ureditev miR-224 in -340 v GC celicah.

Pokazali smo, da zaviranje miRNA predelavo s siDICER1 transfekciji ali z uporabo DICER1 knockout celic zmanjšal učinek 5-aza-CdR, torej zmanjšal proliferacijo in navzdol ureditev ciljnih genov, v GC in CRC celic. Ugotovljeno je bilo, da je številčnost DICER1, encima, ki katalizira zadnjo stopnjo miRNA zorenja, ki je neposredno povezana z napredovanja tumorja [17]. Ti rezultati kažejo, da odstopajoča ureditev miRNA zorenja prispeva k GC in CRC oblikovanja.

Ugotovili smo, da je bil miR-224 /-452 cluster odklonsko navzdol urejeno v GK po hypermethylation. Abnormalnih miR-224 so poročali tudi v drugih tumorjev. Izražanje miR-224, let-7f in miR-516a se zmanjša pri raku jajčnikov, in sinergistično uravnavajo ekspresijo povezanih z kallikrein peptidaze 10 (KLK10) [18]. miR-224 je navzdol urejeno v metotreksatom odporna celičnih linij CRC v primerjavi z na občutljivih celic [19]. Tu je tudi pokazala, da je stanje metilacija miR-224 korelaciji s DPYSL2
ravni v človeški GK. Skupaj, miR-224 igra pomembno vlogo kot tumorski-omejevalno miRNA v PK, kot tudi v nekaterih drugih rakov. V nasprotju s tem je miR-224 up-urejena v hepatoceličnih karcinomov [20] in medulloblastomas [21] v primerjavi z v normalnih tkivih. Zato so potrebne nadaljnje študije za razjasnitev vloge miR-224 v rakotvornost.

smo raziskovali skupne cilje epigenetically navzdol reguliranih miRNAs. DPYSL2
so pokazale, da se navzdol ureja miR-224 in -452. DPYSL2 igra pomembno vlogo pri oblikovanju nevronske polarnosti [22]. DPYSL2 je vključena tudi v poteh, ki urejajo širjenja non-nevronskih celic prek fosforilacije z regulativnimi proteinov. DPYSL2 opravi dinamične spremembe fosforilacijo v odgovor, da se obrnete-inhibicije povzroča mirovanje in hyperphosphorylation od pojavi DPYSL2 v tumorju [22]. Čeprav je vloga DPYSL2 v GK ni jasno, naša, ki temelji na siRNA rasklapanje od DPYSL2 izražanja povzroča zmanjšanje jedrskega orožja v obeh GC celičnih linij, kar kaže onkogenega dejavnost DPYSL2.

Na kratko, naše ugotovitve kažejo, da multiple do različnih razmerij med miRNAs in ciljnih genov res obstaja v GC. Verjetno je, da odklonski metilacija zmanjša ekspresijo različnih tumorskih-supresivno miRNAs, kot miR-224, -452, -340 in -181c, ki potem inducira prekomerno ekspresijo različnih onkogenih genov, kot KRAS
DPYSL2
in MeCP2
. Ti nenormalne več-to-multiple razmerja med miRNAs in cilji bi bil eden od pomembnih mehanizmov osnovne želodca rakotvornost. To je torej zelo verjetno, da lahko epigenetske zdravila normalizira ekspresijo ne le tumorskih-supresivno genov, ampak tudi več tumorskih-supresivno miRNAs, zaradi česar se zmanjša iz nenormalne več do multipla sovisnosti miRNAs in cilji, in tako lahko postanejo odlične terapevtske zdravil proti raku.

Materiali in metode

etika Izjava

Pisna privolitev je bila pridobljena iz vseh predmetov in etiko za Tokyo zdravstvene in zobozdravstvene University School of zdravilo odobreno te raziskave.

celic in tkiv Vzorci

raziskovali smo 9 GC celičnih linij (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 in GCIY), 2 celične linije CRC (HCT116 in DICER1
knock out HCT116 [23]), in 26 primarnih primerov GC. MKN45, MKN74, TGBC11TKB in GCIY so bili kupljeni od celične banke RIKEN in KATO-III in AGS je bilo iz ATCC (ameriški tip Collection Cell). HSC59, HSC43 in HSC58 so bili pridobljeni iz dr Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO-III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 in HSC58 gojimo v RPMI 1640, in AGS, TGBC11TKB, GCIY in dva CRC celičnih linij v Dulbecco je prirejena Eagle je medij, minimalno bistveno srednje ali McCoyev 5A, dopolnjen z govejim ploda 10% seruma. Kirurško odstranjenimi primerki iz 26 bolnikov primarnih GC so naključno pridobljeni iz bolnišnice odvisnimi od School of Medicine, Tokyo zdravstvene in zobozdravstvene University.

V analizo silicij

besedilu smo do podatkovne baze GEO za miRNA in gen izraz profili (GEO pristopno številko GSE16006 in GSE2685). Uporabili smo tudi Mirna ciljne baze podatkov "TargetScan".

drog Zdravljenje celic in RNA Pridobivanje

Za študij demetiliranje smo celice dnevno zdravljenih s 5 mol /l 5-aza-CdR (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) za 72 ur. Smo obdelamo tudi celice z 0,3 mol /l TSA sam in s kombinacijo 0,2 mol /l, 5-aza-CdR in TSA. Celotno RNA smo izolirali s pomočjo TRIzola reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA) ali miRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Nemčija).

Kvantitativna realnem času povratne Transkripcija-polimeraza Verižna reakcija

realnem času reverzna transkripcija-verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR) analize so bile izvedene z uporabo StepOne Real-time PCR sistem (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq Master Mix z Rox (Roche, Mannheim, Nemčija), a TaqMan Povratne Transcription komplet (Applied Biosystems) in TaqMan Mirna teste (Applied Biosystems), v skladu z navodili proizvajalca. Stopnje izraženosti Mirna so bile izračunane na od zneska ciljne miRNA glede na tisto iz RNU6B kot kontrola normalizirati izhodiščnem celotne RNK.

metilacije Analiza

Bisulfite zdravljenje DNK je bila izvaja z Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). verižne reakcije s polimerazo (PPN) Analize metilacije specifične bile izvedene kot je bilo predhodno [26] opisano. V začetnih oligonukleotidov zaporedja in velikosti izdelkov PCR so prikazani v tabeli S3.

Sintetična miRNA Transfekcija

KATO-III in AGS celice smo transfektirali z Predhodnik Molekula posnemanjem miR-224, -452, -340 ali -181c ali zakodirane sekvenca miRNK (Sigma), da smo dobili končno koncentracijo 25-50 nmol /l z uporabo elektroporator, Neon (Invitrogen), v skladu z navodili proizvajalca. Na 24-72 ur po transfekciji smo zbrali celice za RT-PCR ali Western analizo blot.

Cell orožja Vsebnost
celice

miR-posnemajo-transfekcije KATO-III in AGS smo nanesli na 1 x 10 ^{3 ali 1 x 10 4 celic na dobro na 96-vdolbinami. Cell orožja je bila ocenjena na 1-4 dneva po transfekciji z določitvijo števila celic z reagenta proliferacijo celic WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japonska), v skladu z navodili proizvajalca.}

miRNA Ciljna Napoved in Western blot

Napovedane cilji miRNAs in njihovih ciljnih območij so analizirali z TargetScan. Nivoji mRNA ekspresijski predvidenih tarč v prehodno transfektiranih celicah, so analizirali 24 ur po transfekciji s RT-PCR. Zahodni analize blot so bile izvedene kot prej [26] opisano. Primarna protitelesa Uporabljena je bila kunčjega anti-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Cell signalizacije tehnologija, Danvers, MA). Uporabili smo miške anti-alfa-tubulina (1:1000; SC-8085, Santa Cruz biotehnologija) kot notranje kontrole za metodo Western blot. Sekundarna protitelesa, ki se uporabljajo so alkalne fosfataze konjugiranih anti-kunčjega IgG in anti-miške IgG (1:2000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Blots so bili razviti z ImmunoStar AP Substrat (Bio-Rad Laboratories).

Podpora Informacije
sliki S1.
Shematski prikaz COPZ2
regije, ki vsebuje MIR-152. Napolnjene škatle predstavljajo eksonov za COPZ2
A in prazno polje označuje neprevedeno regijo COPZ2
. Zvite Puščica kaže prepis začetno mesto COPZ2
. Vertikalna puščica označuje mesto miR-152. Navpične črte prikazujejo CpG mest. Puščice kažejo regije pregledane za PPN
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s001
(TIFF)
Slika S2.
Učinki transfekciji miR-224 in -452 v celicah KATO-III. RT-PCR analize po transfekciji z miR-224 in /ali -452. Izraz ciljnih genov smo analizirali 48 ur kasneje z RT-PCR. miR-224 in -452 posebej navzdol urejeno DPYSL2
in KRAS
, ne pa tudi drugih pet genov pregleda, ki so v skladu z rezultati analize baze podatkov (slika 3).
doi: 10,1371 /journal.pone.0062589.s002
(TIFF)
Tabela S1.
Expression profiliranje človeških miRNAs v celicah KATO-III po zdravljenju 5-aza-CdR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s003
(XLSX)
Tabela S2.
Seznam ciljnih genov, od katerih ekspresija smo pregledali z RT-PCR po zdravljenju z ali brez 5-aza-CdR in transfekcija s 20 nmol /L siDICER1 ali premešajo siRNA
doi. 10,1371 /journal.pone .0062589.s004
(XLSX)
Tabela S3.
Zaporedja oligonukleotidov, ki se uporabljajo v tej študiji
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s005
(XLSX)

Priznanja

Želimo se zahvaliti Dr. Bert Vogelstein za zagotavljanje DICER1 knock-out celične linije HCT116.

• Plos ONE: hipoksija Stimulira EMT želodčnega raka celic z avtokrin TGFβ Signaling
• Plos ONE: Flotillin2 Expression povezana s HER2 nivoji in slabo prognozo želodčnega Cancer