PLOS NËMMEN: Abberzuel-ze-Abberzuel Relatioun tëscht MicroRNAs an Target Genen vun Gastric Cancer

Wat VerfÜgung

MicroRNAs (miRNAs) Akt als transcriptional Legislateuren an dréien Rollen an carcinogenesis Leeschtung. Laut miRNA Zil- Datenbanken, kann een miRNA vill Genen als hir Ziler regléieren, iwwerdeems een Gentherapie duerch vill miRNAs cibléiert ginn. Dës Conclusiounen weg datt Relatiounen tëscht miRNAs an hiren Ziler net eent-zu-eent kann. Allerdéngs hunn vill Rapporten beschriwwen nëmmen enger eenzeger-zu-eent, eent-ze-Multiple oder Multiple-zu-eent Relatioun tëscht miRNA a seng Zil- Gentherapie zu Mënsch Cancers. Sou, ass et néideg, fir festzestellen, ob oder net eng Kombinatioun vun verschiddenen miRNAs Multiple Ziler regléieren géif an zu carcinogenesis Équipe ginn. Fir verschidde Gruppe vu miRNAs fannen dass synergistically hiren Ziler a mënschlech gastric Kriibs (GC) regléieren kënne mir eis virdrun miRNA Ausdrock vill Donnéeën s-analyséiert a festgestallt, datt 50 miRNAs sech weider-reegelen op Behandlung mat 5-AZA-2'-deoxycytidine zu engem GC Zell Linn. De "TargetScan" miRNA Zil- Datebank virausgesot, datt e puer vun dëse miRNAs gemeinsam Zil Genen hunn. Mir bezeechent och un der Geo Datebank fir Ausdrock vun dëse gemeinsamen Zil Genen am mënschleche GCs, déi zu gastric carcinogenesis Zesummenhang ginn. An dëser Etude, analyséiert mir zwee miRNA Kombinatioune, Mir-224 an -452, a Mir-181c an -340. Iwwer-Ausdrock vun zwou miRNA Kombinatioune dramatesch verwandelt-reegelen hir Zil- Genen, DPYSL2 VerfÜgung a KRAS VerfÜgung, an KRAS VerfÜgung a MECP2 VerfÜgung, bzw.. Dës miRNA Kombinatioune synergistically ofgeholl Zell Prolifératioun op transfection. Doriwwer eraus, datt mir, datt dës miRNAs sech verwandelt-reegelen duerch Promoteur hypermethylation am GC Zellen. Sou, ass et wahrscheinlech, datt d'Relatiounen tëschent miRNAs an hiren Ziler sinn net eent-zu-eent mä Multiple-ze-Pluralitéit vun GCs, an datt dës komplex Relatiounen zu gastric carcinogenesis Zesummenhang kann VerfÜgung

Fro:. Hashimoto Y, Akiyama Y, Yuasa Y (2013) Abberzuel-ze-Abberzuel Relatioun tëscht MicroRNAs an Target Genen vun Gastric Cancer. PLoS NËMMEN 8 (5): e62589. Doi: 10.1371 /journal.pone.0062589 VerfÜgung

Redakter: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan VerfÜgung

Arnaque: 14. Dezember 2012; Akzeptéiert: 24. Mäerz 2013; Publizéiert: May 8, 2013 VerfÜgung

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Aarbecht war am Kader vun Stipendien aus der A3 Foresight plangen vun der Japan Society fir d'Promotioun vun Science (JSPS) (yy), a Fuerschung Fellowships vun der JSPS fir Young Wëssenschaftler (YH) ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

MicroRNAs (miRNAs), eng Klass vu klenge net-FAQ-coding RNAs, goufen als eng nei Zort vun der Gentherapie regulator Kloeren, datt zu der 3'-untranslated Regiounen (UTRs) vun Zil- mRNA festleeën, doduerch ergi zu mRNA ofgeschnidden oder d'Blockade vun mRNA Iwwersetzung [1]. Et ass allgemeng bekannt, datt miRNA hire Restaurant mat tumorigenesis verbonne sinn [1]. Laut miRNA Zil- Datenbanken, kann een miRNA vill Genen als hir Ziler regléieren, iwwerdeems een Gentherapie duerch vill miRNAs cibléiert ginn. vill Studien Teamchef awer e eent-zu-eent Relatioun tëscht miRNA a seng Zil- Gentherapie. Et huet och gemellt ginn, datt verschidde oder engem Koup vun miRNAs Co-Basis e Gene regléieren, déi zu carcinogenesis Zesummenhang ass [2] - [4]. Op der aner Hand, sinn Multiple Genen vun enger miRNA [3] cibléiert, [4]. Och Multiple-ze-Multiple Relatiounen tëscht miRNAs an Ziler hunn andems computational Analysë gemellt ginn [5], [6]. Mä et goufen nëmmen e puer Aarbechten experimentally Multiple-ze-Multiple Bezéiungen zu Kriibs Zellen ausseet. VerfÜgung

Gastric Kriibs d'véiert stäerkste gemeinsam mënschlech malignant Krankheet ass an der zweeter heefegsten Ursaach vum Kriibs-Zesummenhang Doud weltwäit, mat enger geschater eng Millioun nei Fäll pro Joer [7]. Gastric Cancers sinn histologically séiert an zwou grouss Zorten, déi intestinal an diffusen Zorte [8]. Diffusen-Typ GC ass oft intractable a geet aarmséileg Patient hätt. Kuerzem, hien huet mir dat Verloscht vun der Cdh1 an Trp53 Funktiounen diffusen Modeller Typ GC mat Mais induces [9]. Obwuel dat brengt eis hëllefe wäert neie Mënsch gastric Kriibs Therapien, weider Ermëttlungen iwwert d'molekulare Mechanismen Basisdaten gastric carcinogenesis ze entwéckele sinn néideg aner Approche fir cibléiert Therapie ze entwéckelen. VerfÜgung

Promoter CpG Insel hypermethylation ass eent vun de meescht genannten Mechanismen duerch déi Genen entholl suppressor sinn am mënschleche Cancers inactivated [10]. Viru Kuerzem, huet et offensichtlech ginn, datt e puer miRNAs sinn och Ziler vun epigenetic silencing zu Cancers [11]. Eis an aner Gruppen hu virdrun déi pharmacologic oder genetesch Stéierungen DNA methylation zu Kriibs Zell Linnen dës induces up-Regulatioun vun substantiell Zuelen vun miRNAs [12] - [15]. Dës Donnéeë Nerve Identifikatioun vum Kandidat entholl-suppressive miRNAs hir silencing ass verbonne mat CpG Insel methylation. Sou wäit, methylation vum Mir-124 Familljememberen gouf zu colorectal Kriibs an am erhéijen vun aner Organer [11] identifizéiert. Ausserdeem, huet de Bord-34b /c Stärekoup eng typesch CpG Insel, an Minus-reegelen duerch heefeg methylation zu colorectal an gastric Cancers [12]. Zerfall fonnt mir dat Mir-181c methylation mat gastric carcinogenesis via Regulatioun vun oncogenic Genen KRAS VerfÜgung a NOTCH4 VerfÜgung [13] verbonnen ass. Down-Regulatioun vun villen miRNAs duerch methylation existeiert gläichzäiteg zu Kriibs Zellen, an kann Multiple-ze-Multiple Relatiounen tëscht miRNAs an Ziler verbesseren. VerfÜgung

An dëser Etude, an validéieren Multiple-ze-Multiple Relatiounen tëscht miRNAs an Ziler zu Kriibs Zellen, hien huet mir déi zwee Puer Multiple miRNAs, mir-224 an -452, a mir-181c an -340, Multiple Zil- Genen Équipe an synergistically ofgeholl Zell Prolifératioun duerch Regulatioun vun hiren Ziler a mënschlech GC Zellen. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

50 miRNAs zu engem GC Zell Linn an-regulariséiert goufen, Kato-III, no 5-AZA-2'-deoxycytidine Prefabrizéierten VerfÜgung

Kandidat miRNAs ze identifizéieren dass synergistically Afloss op hir viséieren Genen, mir eis virdrun microarray Donnéeën (Geo Bäitrëtt Nr GSE16006) [13] s-analyséiert. Mir als dat miRNA Niveauen sech weider-reegelen op 5-AZA-2'-deoxycytidine (5-AZA-CDR) Behandlung wann der net intensities vun allem 3 Flecken sech méi wéi 1,5-fantastesch. Doriwwer hu mir och vun deem ausgewielt miRNAs der ronn fonnt goufen zu méi wéi 3-fantastesch op microarray Analyse fräi ginn. Baséierend op dës nei Kritären, hunn mir déi 50 miRNAs sech zu engem GC Zell Linn an-reegelen, Kato-III (Table S1). Mir trieden der up-Regulatioun vun 5 vu 6 Vertrieder Virleefer miRNAs, dat ass, Mir-145, -148a, -152, -224 an -340, no 5-AZA-CDR Behandlung vun RT-Hinnen alleguer (Dorënner 1A).

TargetScan virausgesot gemeinsam Target Genen vun de Kandidatelänner miRNAs VerfÜgung

fir erauszefannen, ob oder net epigenetically reegelen miRNAs gemeinsam Zil Genen hunn, mir gesichte der TargetScan Datebank (Versioun 5.1) fir hir gemeinsam Ziler. Laut TargetScan, kéint 50 miRNAs an 46 Gruppen op hire Som Message baséiert séiert ginn. TargetScan zougedréckt och dass dës 46 Gruppen 6.460 Genen Zil- kënnen. Dorënner Zil- Genen, ausgewielt mir 13 vun deem Ausdrock Rapport war an der Geo Datebank (Geo Bäitrëtt Nr GSE2685) oder gin Zesummenhang mat gastric carcinogenesis (Table S2) zu GC fräi ze ginn. Hei, stelle mer op véier miRNAs, Mir-152, -181c, -224 an -340, well mir hunn de Rapport schonn dass Mir-181c ass epigenetically verwandelt-reglementéiert GC [13] an CpG Inselen an der Offloss Regiounen läit vun dräi aner miRNAs (Dorënner 2A an C, an Dorënner S1). Figur 2a verréid eis och, datt Mir-452 mat Mir-224 op der Strooss ass. TargetScan virausgesot datt déi fënnef miRNAs gemeinsam Ziler regléieren kann. Zum Beispill, DPYSL2 VerfÜgung (dihydropyrimidinase-wëll 2, och als Koup Äntwert Vermëttler FAQ bekannt 2, CRMP2 VerfÜgung) ass geziilte vum Mir-224, -452, a -181c, KRAS VerfÜgung vum Mir-224, -452, -181c, -340 an -152, a MECP2 VerfÜgung (duerch CpG bindend FAQ 2) vum Mir-181c an -340, bzw. (Dorënner 3). VerfÜgung

Expression vum Mir-224, -452, -152 an -340 ofgeholl op DNA Hypermethylation am GC Zell zesummeféieren VerfÜgung

Mir iwwerpréift der Bedeelegung vun epigenetic Ännerungen am Ugrëff-Regulatioun vun der miRNAs. Den Ausdrock vun Mir-224, -340 an -152 war zu puer GC Zell Linnen (Dorënner 1B) vun 5-AZA-CDR Behandlung fräi. Mir analyséieren quantitativ eeler Mir-224 Ausdrock vun 9 GC Zell Linnen an enger colorectal Kriibs (CRC) Zell Linn. Keen Ausdrock vu Mir-224 gouf zu 7 vun 10 Kriibs Zell Linnen (Dorënner 1c) fonnt. Mir analyséieren och den Ausdrock Ännerung vun der Raumstatioun-224 /-452 Stärekoup vun Kato-III mat engem niddregen Portioun 5-AZA-CDR (0,2 μmol /l), engem histone deacetylase inhibitor behandelt Zellen, trichostatin A (TSA, 0.3 μmol l /), oder enger Kombinatioun vun deenen zwee Drogen. Kato-III Zellen mat niddereg-Portioun 5-AZA-CDR Behandlung an-Regulatioun vun der Raumstatioun-224 Schatzkummer /-452 Stärekoup hierkommen TSA eleng net gemaach Ursaach weider-Regulatioun. De Mir-224 /-452 Stärekoup gouf synergistically up-reglementéiert Kato-III Zellen mat kombinéiert 5-AZA-CDR an TSA Behandlung (Dorënner 1D). Dës Resultater weisen, datt Mir-224 an Mir-452 verwandelt-reegelen duerch DNA methylation am GC Zell Linnen kann als d'selwecht Transkriptiouns Eenheet. VerfÜgung

Et ass confirméiert datt intronic miRNAs duerch Promoteur methylation vun hirem Provider regulariséiert ginn Genen [14], [15]. Laut de Resultater vun computational Analyse, d'Mir-224 /-452 Stärekoup an Mir-340 sinn an intron 6 vun wellkomm GABRE VerfÜgung an intron 2 zu RNF130 VerfÜgung, respektiv, souwuel vun deenen enthalen dichten CpG Inselen nëmmen an de Promoteur Regioune vun hirem Provider Genen (Dorënner 2A an C). Mir propagéieren der Relatioun tëscht der Ausdrock Niveau vun deene miRNAs an der methylation Status vun hirem Provider Genen am GC Zell Verse MSP Analyse. GC Zell Zeilen Mir-224 Ausdrock Schatzkummer nëmmen methylation Signaler hierkommen Ausdrock-positiv Zell Linnen Schatzkummer staark unmethylation Musteren (Dorënner 2B). Eng ähnlech Relatioun war fir Mir-340 am GC Zell Linnen (Dorënner 2D) fonnt. Dës Donnéeë weisen, datt Ausdrock vun dësen miRNAs am GC Zell Linnen kann duerch Promoteur methylation vun hirem Provider Genen entsat ginn. VerfÜgung

Epigenetically reegelen miRNAs Mee zu GC Zell prolifération Contenu ginn VerfÜgung

Fir erauszefannen, ob epigenetically reglementéiert miRNAs sinn entholl-suppressive oder net, mir bewäert den Effet vun 5-AZA-CDR zu siDICER1-transfected Kato-III an DICER1 KO HCT116 (D1KO) Zellen (Dorënner 4A). D'onbehandelt Kato-III an Elteren HCT116 Zellen zougedréckt decelerated Prolifératioun der Behandlung mat 5-AZA-CDR. Op der aner Hand, an siDICER1-transfected Kato-III an D1KO Zellen, gouf den Effet vun 5-AZA-CDR Behandlung op Zell Prolifératioun vun béiden Fäll schwaach. Dës Resultater hindeit, datt den Effet vu 5-AZA-CDR war an niddreg oder ongëlteg DICER1 Zellen ofgeholl, an datt epigenetically reegelen miRNAs spillen eng wichteg Roll am GC an CRC Zellen. VerfÜgung

Fir der Relatioun tëscht dësen analyséieren miRNAs an 13 Zil- Genen an Table S2 gewisen, transfected mir Kato-III Zellen mat siDICER1 an /oder mat 5-AZA-CDR behandelt. Obwuel, Ausdrock vun 3 ( DPYSL2 VerfÜgung, KRAS VerfÜgung a MECP2 VerfÜgung) vun den 13 Genen huet ofgeholl no 5-AZA-CDR Behandlung, déi Ausdrock vun dësen Genen huet net op 5-AZA-CDR Behandlung vun transfection vun siDICER1 (Dorënner 4B). VerfÜgung

Combinational transfection vum Mir-224 an -452 Repressed GC Zell prolifération VerfÜgung

Mir transfected Linnen GC Zell duerno ännere mat Mir-224 an /oder -452 mimics als Vertrieder vun miRNA Stärekéip, oder eng negativ Kontroll, a gedroen dann aus Waasser-geléist tetrazolium-8 (WST-8) assays. Siwwenzeg-zwou Stonnen no transfection, observéiert mir dass ectopic Ausdrock vu Mir-224 oder -452 de Wuesstem vun zwee Zell Linnen opgeléist, Kato-III an AGS (Dorënner 5A). Gëlt, combinational transfection vun der Raumstatioun-224 an -452 mimics ofgeholl extensiv de Wuesstem vun der zwou GC Zell Linnen (Dorënner 5A). VerfÜgung

der Mir-224 /-452 Koup Co-Basis Ofgeholl Expression vun DPYSL2 VerfÜgung a KRAS

fir ze kucken, ob oder net de Bord-224 /-452 Stärekoup eigentlech zu der Regelung vun DPYSL2 VerfÜgung a KRAS VerfÜgung, analyséiert mir den Ausdrock vun DPYSL2 VerfÜgung der transfection vun Kato-III an AGS Zellen mat der Raumstatioun-224 /-452 Stärekoup eleng oder zesummen. Mir duerchgefouert RT-Hinnen alleguer a Western blot analyséiert. D' DPYSL2 VerfÜgung a KRAS VerfÜgung mRNA Niveauen goufen ofgeholl der transfection mam Mir-224 oder Mir-452 rescht (Dorënner 5B). Spannen, war am Fall vun combinational transfection mat Mir-224 an -452, Ausdrock vun deenen Zil- Gene weider erof-reegelen (Dorënner 5B). D'verwandelt-Regulatioun vun DPYSL2 war och op d'FAQ Niveau vun den zwou Zell Linnen (Dorënner 5C) observéiert. Mir iwwerpréift och den Ausdrock Niveau vun anere fënnef Genen, MECP2, MYC, JUNB, MUC1 VerfÜgung a SETDB1 VerfÜgung, déi net als Ziler fir Mir-224 oder -452 vun TargetScan gewise goufen. Wéi erwaart, huet kee expressional Ännerunge vun deene fënnef Genen vun Kato-III Zellen der transfection mat Mir-224 oder -452 (Dorënner S2) fonnt. Dës Donnéeë hindeit, datt Mir-224 an -452 speziell verwandelt-reegelen DPYSL2 VerfÜgung a KRAS VerfÜgung. VerfÜgung

DPYSL2 VerfÜgung war mam GC Zell prolifération dësen

Mir iwwerpréift den Effet vun knockdown vun DPYSL2 VerfÜgung, déi eng Zilscheif vun der Raumstatioun-224 /-452 Stärekoup gin, op Zell Prolifératioun gewise gouf. D'transfection vun DPYSL2 VerfÜgung siRNA ofgeholl haut de Niveau vun der DPYSL2 VerfÜgung gët (Dorënner 5D), an inhibited de Wuesstem vun AGS a Kato-III Zellen 72 Stonnen no der knockdown vun DPYSL2 VerfÜgung (Dorënner 5E), wat beweist, datt DPYSL2 eng oncogenic Aktivitéit huet. VerfÜgung

Combinational Transfection vum Mir-340 an -181c Repressed GC Zell prolifération, an entschlof Down-Regulatioun vun KRAS VerfÜgung an MECP2 VerfÜgung Expression VerfÜgung

als zweet Beispill vun Multiple-ze-Multiple Relatiounen tëscht microRNAs an Zil- Genen, mer d'Relatioun tëschent mir-340 /-181c analyséiert a KRAS /MECP2 . VerfÜgung Wann Mir-340 an Mir-181c an Kato-III Zellen transfected waren, war Prolifératioun synergistically verwandelt-reegelen zwee miRNAs (Dorënner 6A). Fir erauszefannen, ob oder net epigenetically reegelen Mir-340 an Mir-181c Co-Basis hir Ziler betreffen, analyséiert mir de mRNA Niveau vun KRAS VerfÜgung a MECP2. VerfÜgung Op RT-Hinnen alleguer Analyse, KRAS VerfÜgung a MECP2 VerfÜgung fonnt goufen gin verwandelt-reegelen Mir-340 an Mir-181c eleng, oder combinational transfection vun Kato-III Zellen (Dorënner 6B). Wéi fir de véier Genen, MYC, JUNB, MUC1 VerfÜgung a SETDB1 VerfÜgung, weist keen virausgesot Siten fir dës zwee miRNAs vun TargetScan, huet den Ausdrock Niveau vun dëser Etude net geännert. Vertrieder Donnéeë sinn an Dorënner 6B gewisen. Soumat kënnen d'Auswierkunge vun Mir-340 an -181c fir hir gemeinsam Zil Genen souwéi Mir-224 an -452 spezifesch ginn. VerfÜgung

Expression an Methylation Status vum Mir-224 an -340 zu primär GC Cases VerfÜgung

Mir iwwerpréift der methylation Status vum Mir-224 an -340 am primäre GC Fäll. Methylated Musteren vum Mir-224 huet an 15 vun 26 (57.7%) Primärschoul GC Stoffer (Dorënner 7A an Table 1) fonnt. Vläit Net-kriibserreegend gastric mucosae Schatzkummer kaum engem methylation Muster vum Mir-224. Next, iwwerpréift mir quantitativ de Bord-224 Niveauen am primäre GC Stoffer an entspriechend Net-kriibserreegend mucosae vun TaqMan RT-Hinnen alleguer. Eng bedeitend Reduktioun vun Mir-224 Ausdrock am GC Stoffer zu methylation-positiv Kriibs Fäll Verglach mat an methylation-negativ mannste an Net-kriibserreegend gastric mucosae (Dorënner 7C) observéiert gouf. VerfÜgung

Mir analyséiert weider d' DPYSL2 VerfÜgung mRNA Niveauen am Verglach mat der methylation Status vum Mir-224 am GC Stoffer: GCs mat Mir-224 methylation (Ca Mir-224 Mt), GCs mat Mir-224 unmethylation (Ca Mir-224 un), an net -cancerous Stoffer mat unmethylation (N Mir-224 Un). D' DPYSL2 VerfÜgung mRNA Niveau vun der "Ca Mir-224 Mt" Grupp war méi héich wéi déi vun de "N Mir-224 Un" an "Ca Mir-224 Un" Gruppen, p = 0,049 an p = 0,035 bzw. (Dorënner 7D). Also, et ass eng Korrelatioun tëscht der methylation Status vum Mir-224 an DPYSL2 VerfÜgung Ausdrock am GC Stoffer. VerfÜgung

der Mir-340 methylation Frequenz an der Primärschoul GC Stoffer getest relativ héich war (4 visuell methylation Musteren vum Mir-340 vun 26, 15,4%) (Dorënner 7B an Table 1) hierkommen keent vun 26 Schatzkummer Net-kriibserreegend gastric mucosae vläit. Wéi fir Mir-152 methylation Analyse, probéiert mir dräi primer baut am Offloss Regioun vun entworf Mir-152 mat CpG Inselen (Dorënner S1), mee keent vun hinnen misst reagéiert Mir-152 Ausdrock op MSP Analysë (Donnéeën net gewisen).

Diskussioun VerfÜgung

Obwuel et, datt de Begrëff vun e puer miRNAs gemellt gouf an e puer Cancers duerch DNA methylation rofgaang ass, beschriwwen meescht vun de Rapporten, déi d'Relatiounen tëschent aberrant Ausdrock vun miRNAs a seng Zil- Genen war eent-zu-eent, eent-ze-Multiple oder Multiple-zu-eent. Fir d'Méiglechkeet vun Multiple-ze-Multiple Relatiounen tëscht miRNAs an Ziler an Kriibs Zellen iwwerpréifen, do hu mer op zwee Kombinatioune vun miRNAs am GC Zellen, d'Mir-224 /-452 Stärekoup, an Mir-181c an -340, zu dëser Etude . Mir hu fonnt, dass déi zwee Bee vun miRNAs, Mir-224 an -452, a Mir-181c an -340, Multiple Zil- Genen haten, DPYSL2 VerfÜgung a KRAS VerfÜgung, an KRAS VerfÜgung a MECP2 VerfÜgung, respektiv, a rofgaang synergistically Zell Verbreedung zu Mënsch GC Zell Linnen. Et ass ausserdeem, datt en oncogene, KRAS VerfÜgung [16], fonnt gouf duerch véier miRNAs cibléiert ginn, obwuel Kandidat bindend Siten vun de véier miRNAs anescht sinn an der 3'-UTR vun KRAS
(TargetScan). Mir ginn virdrun dass Mir-181c verwandelt-reegelen NOTCH4 VerfÜgung ze [13]. Sou, Multiple-ze-Multiple Relatiounen tëscht miRNAs an Ziler waren déi Datebank net nëmmen uginn Analysë mä och duerch transfection Experimenter mënschlech Zellen sensibiliséieren. VerfÜgung

Mir-224- an /oder -340-Ausdrock-negativ GC Zell Linnen Schatzkummer hypermethylation Signaler op MSP Analyse an d'Expressioun vun Mir-224 an -340 op demethylating Agent Behandlung restauréiert. Ausserdeem, hypermethylation vum Mir-224 an -340 war méi dacks am primäre GCs observéiert wéi noncancerous mucosae entspriechend. Am Mir-224 methylation-positiv Fäll, Ausdrock vum Mir-224 war wesentlech méi niddreg wéi an methylation-negativ gelackelt. Dës Donnéeë staark weg datt aberrant DNA methylation ass eent vun de wichtegsten Mechanismen Basisdaten verwandelt-Regulatioun vum Mir-224 an -340 zu GC Zellen. VerfÜgung

Mir weisen datt inhibition vun miRNA Ofwécklung vun siDICER1 transfection oder benotzt DICER1 Knockout Zellen rofgaang ass den Effet vun 5-AZA-CDR, dat ass, Zell Prolifératioun ofgeholl an Ugrëff-Regulatioun vun Zil- Genen, am GC an CRC Zellen. Et ass confirméiert datt d'Heefegkeet vun DICER1, déi Aktivitéit, déi d'Finale vun miRNA maturation catalyzes, direkt mat entholl Werdegang [17] verbonnen ass. Dës Resultater hindeit, datt aberrant Regulatioun vun miRNA maturation dréit zu GC an CRC Équipe. VerfÜgung

Mir hu fonnt, dass de Bord-224 /-452 Stärekoup gouf aberrantly verwandelt-reglementéiert GCs duerch hypermethylation. Aberrant Ausdrock vu Mir-224 huet och an anere erhéijen gemellt ginn. Ausdrock vun Mir-224, loosse-7f an Mir-516a ass zu spillt Kriibs ofgeholl, a si synergistically Ausdrock vun peptidase kallikrein-Zesummenhang regléieren 10 (KLK10) [18]. Mir-224 ass erof-reglementéiert methotrexate-resistent CRC Zell Linnen Verglach mat an empfindlech Zellen [19]. Hei mir verroden och, datt d'methylation Status vum Mir-224 soll war mat der DPYSL2 VerfÜgung Niveau vun de Mënscherechter GCs. Geholl zesummen, spillt Mir-224 eng wichteg Roll als entholl-suppressive miRNA am GC wéi och an e puer aner Cancers. Am Géigesaz, ass Mir-224 zu hepatocellular carcinomas up-reegelen [20] an medulloblastomas [21] Am Verglach mat der normal Stoffer. Sou, si weider Studien néideg der Roll vum Mir-224 zu carcinogenesis ze klären. VerfÜgung

Mir der gemeinsam Ziler vun epigenetically verwandelt-reegelen miRNAs propagéieren. war DPYSL2 VerfÜgung dës duerch Mir-224 an -452 verwandelt-reglementéiert gin. DPYSL2 spillt eng wichteg Roll an der Schafung vun neuronal Polaritéit [22]. DPYSL2 ass och zu Weeër Équipe datt d'Verbreedung vun Net-neuronal Zellen duerch seng phosphorylation vun reglementaresche Proteinen regléieren. DPYSL2 awer dynamesch phosphorylation Ännerungen an Äntwert inhibition-entschlof quiescence an hyperphosphorylation zu Kontakt vun DPYSL2 zu engem entholl existeiert [22]. Obwuel d'Roll vun DPYSL2 zu GCs net kloer ass, eis siRNA-baséiert knockdown vun DPYSL2 Ausdrock enger Reduktioun vun Zouhuelen vun der zwou GC Zell Linnen entschlof, oncogenic Aktivitéit vun DPYSL2 suggeréiert. VerfÜgung

Am Resumé, eis Conclusiounen weg datt Multiple-ze-Multiple Relatiounen tëscht miRNAs an Zil- Genen existéiert wierklech zu GC. Et ass wahrscheinlech, datt aberrant methylation den Ausdrock vu multiple entholl-suppressive miRNAs Verloschter, wéi Mir-224, -452, -340 an -181c, déi dann iwwer-Ausdrock vu multiple oncogenic Genen induce, wéi KRAS VerfÜgung , DPYSL2 VerfÜgung, an MECP2 VerfÜgung. Dës Manque Multiple-ze-Multiple Relatiounen tëscht miRNAs an Ziler géif ee vun de wichtege Mechanismen Basisdaten gastric carcinogenesis ginn. Et ass, also, duerchaus méiglech, datt epigenetic Drogen den Ausdrock vun net nëmmen entholl-suppressive Genen normaliséieren kann awer och verschidde entholl-suppressive miRNAs geplatzt Verloschter vun de Manque Multiple-ze-Multiple Relatiounen tëscht miRNAs an Ziler, an dofir kënne ginn excellent therapeutesch Drogen géint Kriibs. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

IFLA- breakpoint VerfÜgung

Schrëftlech Awëllegung vun all Theme kritt hat, an der Ethik Comité vun Tokyo Medical an Dental University School of Medezin virausgesat dës Fuerschung. VerfÜgung

Zell zesummeféieren a Ray Echantillon VerfÜgung

Mir studéiert 9 GC Zell Linnen (Kato-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 an GCIY), 2 CRC Zell Linnen (HCT116 a DICER1 VerfÜgung HCT116 hummeren eraus [23]), an 26 Primärschoul GC Fäll. MKN45, MKN74, TGBC11TKB an GCIY sech aus RIKEN Zell Bank kaaft, a Kato-III an AGS sech aus ATCC (American Type Zell Collection). HSC59, HSC43 an HSC58 sech aus Dr. Kazuyoshi Yanagihara kritt [24], [25]. Kato-III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 an HSC58 sech zu RPMI 1640, an AGS, TGBC11TKB, GCIY an den zwee CRC Zell Linnen an Dulbecco d'geännert Eagle ass mëttelgrouss, minimal essentiel mëttel- oder Diggers d'5A, ergänzt mat 10% An et Bovine ugebaut serum. Surgically resected uplanzen aus 26 Primärschoul GC Patienten zoufälleg aus der laizistesch Hospital vun School vun Medezin, Tokyo Medical an Dental Uni kritt huet. VerfÜgung

An silico Analys VerfÜgung

Mir un der Geo Datebank bezeechent fir miRNA an Gene Ausdrock Profiler (Geo Bäitrëtt Nr GSE16006 an GSE2685). Mir och miRNA Zil- Datebank "TargetScan". VerfÜgung

Cargolux Prefabrizéierten Zelle an RNS Extraktioun VerfÜgung

Fir demethylation Studien gebraucht, goufen Zellen Dag behandelt mat 5 μmol /l 5-AZA-CDR (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) fir 72 h. Mir och Zellen mat 0.3 μmol /l TSA gehalen, a mat enger Kombinatioun vu 0,2 μmol /l 5-AZA-CDR an TSA behandelt. Total RNS war andems Trizol reagent (Invitrogen, Karlsbad CA) oder engem miRNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Däitschland). VerfÜgung

Chemeschen Real-Zäit Réckproduktioun Transkriptioun-polymerase Kettereaktioun VerfÜgung

isoléiert Real-Zäit ëmgedréint Transkriptiouns-polymerase Kette Reaktioun (RT-Hinnen alleguer) analyséiert goufen mat enger StepOne Real-Zäit Hinnen alleguer System (Obwuel Biosystems, Foster City, CA) duerchgefouert, EagleTaq Master Mix mat Rox (Roche, Mannheim, Däitschland), engem TaqMan Transkriptioun Kit (Obwuel Biosystems), an TaqMan miRNA assays (Obwuel Biosystems), laut dem Hiersteller 'Instruktiounen Réckproduktioun. Den Ausdrock Niveau vun miRNA sech aus der Zomm vun der Zil- miRNA Verglach zu deem vun RNU6B als Kontroll berechent baséiert der initialen Input vun insgesamt RNS ze normaliséieren. VerfÜgung

Methylation Analys VerfÜgung

Bisulfite Behandlung vun DNA war standing mat Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). Methylation-spezifesch polymerase Kette Reaktioun (MSP) analyséiert goufen virdrun ëmschriwwen standing [26]. D'primer Message an Produit Gréisste Hinnen alleguer sinn an Table S3 gewisen. VerfÜgung

synthetesch miRNA Transfection VerfÜgung

Kato-III an AGS Zellen sech mat engem Virleefer Protein Wäerr Mir-224 transfected, -452, -340 oder -181c, oder Jacquerie Haaptrei miRNA (Fläch) eng final Konzentratioun vun 25-50 nmol /l ze ginn duerch eng electroporator benotzt, Neon (Invitrogen), no den Hiersteller d'Uweisungen. Bei 24-72 h der transfection, goufen Zellen fir RT-Hinnen alleguer oder Western blot Analyse recoltéiert. VerfÜgung

Zell prolifération Assay VerfÜgung

Mir-rescht-transfected Kato-III an AGS Zellen op 1 plated sech × 10 3 oder 1 × 10 4 Zellen pro och op 96-Meter Placken. Zell Prolifératioun war déi Bestëmmung vun der Zuel vun Zellen op Deeg 1-4 no transfection bewäert mat Zell Prolifératioun reagent WST-8 (Dojindo cuisine Technologies, Inc., Mashikimachi, Japan), no den Hiersteller d'Instruktioune. VerfÜgung

miRNA Target Cepheid a Western Blotting VerfÜgung

D'virausgesot Ziler vun miRNAs an hir Zil- Siten benotzt TargetScan analyséiert. D'mRNA Ausdrock Niveau vun der virausgesot Ziler an transiently transfected Zellen sech 24 h der transfection vun RT-Hinnen alleguer analyséiert. Western blot analyséiert goufen ëmschriwwen standing virdrun [26]. Der Primärschoul antibody benotzt gouf Kanéngchen anti-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Zell sécher Technology, Danvers, MA). Mir benotzt Maus anti-α-tubulin (1:1000; sc-8085, Santa Cruz Déi) wéi eng intern Kontroll fir Western blotting. D'Première antibodies benotzt goufen alkaline phosphatase-conjugated anti-Kanéngchen IgG an Anti-Maus IgG (1:2000; Bio-Rad Laboratoiren, Hercules, CA). Blots sech mat ImmunoStar AP Realitéiten (Bio-Rad Laboratoiren) entwéckelt. VerfÜgung

Ennerstëtzung Informatiounen VerfÜgung Dorënner S1. VerfÜgung Sënn Representatioun vun der COPZ2 VerfÜgung Regioun Mir-152 mat. Gefëllt Këschte vertrieden exons vun COPZ2 VerfÜgung A an eng eidel Këscht ADR der untranslated Regioun vun COPZ2 VerfÜgung. A kromme Feil weist d'Transkriptiouns Start Site vun COPZ2 VerfÜgung. Eng vertikal Feil weist d'Plaz vum Mir-152. Vertikalen Linnen weg CpG Siten. Arrowheads weg de Regioune fir MSP iwwerpréift VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s001 VerfÜgung (Name) VerfÜgung Dorënner S2. VerfÜgung Effects vun transfection vum Mir-224 an -452 vun Kato-III Zellen. RT-Hinnen alleguer analyséiert der transfection mat Mir-224 an /oder -452. Den Ausdrock vun Zil- Genen huet 48h spéider vun RT-Hinnen alleguer analyséiert. Mir-224 an -452 speziell verwandelt-reegelen DPYSL2 VerfÜgung a KRAS VerfÜgung, awer net anere fënnef Genen iwwerpréift, déi mat de Resultater vun Datebank Analyse konsequent sinn (Dorënner 3). VerfÜgung Doi: 10,1371 /journal.pone.0062589.s002 VerfÜgung (Name) VerfÜgung Table S1. VerfÜgung Expression profiling vum Mënsch miRNAs vun Kato-III Zellen no 5-AZA-CDR Behandlung VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s003 VerfÜgung (XLSX) VerfÜgung Table S2. VerfÜgung Lëscht vun Zil- Genen vun deem Ausdrock iwwerpréift mir vun RT-Hinnen alleguer der Behandlung mat oder ouni 5-AZA-CDR, an transfection mat 20 nmol /L vun siDICER1 oder Jacquerie siRNA VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone .0062589.s004 VerfÜgung (XLSX) VerfÜgung Table S3. VerfÜgung Message vun primers an dëser Etude benotzt VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s005 VerfÜgung (XLSX) VerfÜgung

Arbeschterlidder VerfÜgung

Mir wënschen Dr. Merci Bert Vogelstein fir déi d'DICER1 hummeren-out HCT116 Zell Linn. VerfÜgung

• PLOS NËMMEN: Hypoxia koum de EMT vun Gastric Cancer BTS duerch Autocrine TGFβ Signaling
• PLOS NËMMEN: Flotillin2 Expression deemolegt Weltbild mat HER2 Niveauen a Poor hätt an Gastric Cancer