PLoS ONE: Множественный к многообразных взаимосвязей между микроРНК и генов-мишеней в желудочном Cancer

Абстрактные
<р> MicroRNAs (микроРНК) действуют как транскрипционные регуляторы и играют центральную роль в канцерогенезе. В соответствии с микроРНК целевых баз данных, один микроРНК может регулировать множество генов, как его цели, в то время как один ген может быть мишенью многих микроРНК. Эти данные свидетельствуют о том, что отношения между микроРНК и их цели могут быть не один-к-одному. Тем не менее, во многих докладах была описана лишь один-к-одному, один-к-кратное или нескольких к-одному между микроРНК и ее геном-мишенью в злокачественных опухолях человека. Таким образом, необходимо, чтобы определить, является ли сочетание некоторых микроРНК будет регулировать множественные цели и участвовать в процессе канцерогенеза. Для того, чтобы найти некоторые группы микроРНК, которые могут синергично регулировать свои цели в рак желудка человека (GC), мы повторно проанализировали наши данные выражение массива предыдущий микроРНК и обнаружили, что 50 микроРНК были повышающей регуляции на лечение с 5-аза-2'-деоксицитидина в ГХ-клеточной линии. Целевой микроРНК базы данных "TargetScan" предсказал, что некоторые из этих микроРНК имеют общие гены-мишени. Мы также ссылались на базу данных GEO для экспрессии этих общих генов-мишеней в человеческом ШС, которые могут быть связаны с канцерогенеза желудка. В данном исследовании мы проанализировали две комбинации микроРНК, MIR-224 и -452, и MIR-181C и -340. Избыточная экспрессия обеих комбинаций микроРНК резко вниз регулируется их гены-мишени, DPYSL2
и KRAS
и KRAS
и MECP2
соответственно. Эти комбинации микроРНК синергически уменьшилось пролиферацию клеток при трансфекции. Кроме того, мы показали, что эти микроРНК были вниз регулируется с помощью гиперметилированием промотора в GC клетки. Таким образом, вполне вероятно, что отношения между микроРНК и их цели не один к одному, но кратно к кратному в ШС, и что эти сложные отношения могут быть связаны с канцерогенеза желудка
<р> Образец цитирования:. Hashimoto Y, Акияма Y, Yuasa Y (2013) Множественный к многообразных взаимосвязей между микроРНК и генов-мишеней в рака желудка. PLoS ONE 8 (5): e62589. DOI: 10.1371 /journal.pone.0062589
<р> Редактор: Хирому Suzuki, Саппоро медицинский университет, Япония
<р> Поступило: 14 декабря 2012 года; Принято: 24 марта 2013; Опубликовано: 8 май 2013
<р> Copyright: © 2013 Hashimoto и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа была частично поддержана грантами от Форсайта программы А3 Японского общества содействия развитию науки (JSPS) (YY), и научно-исследовательских стипендий в JSPS для молодых ученых (YH). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение

MicroRNAs (микроРНК), класс мелких небелковых-кодирующих РНК, были идентифицированы как новый тип регулятора генов, которые связываются с 3'-нетранслируемые области (НТО) мРНК-мишени, что приводит в деградации мРНК или блокадой трансляции мРНК [1]. В общем известно, что микроРНК изменения связаны с онкогенеза [1]. В соответствии с микроРНК целевых баз данных, один микроРНК может регулировать множество генов, как его цели, в то время как один ген может быть мишенью многих микроРНК. Тем не менее, многочисленные исследования показали связь один-к-одному между микроРНК и ее геном-мишенью. Кроме того, было сообщено, что множественный или кластер микроРНК кооперации регулирует ген, который связан с канцерогенеза [2] - [4]. С другой стороны, множественные гены ориентированы на один микроРНК [3], [4]. Даже многократный к многообразных взаимосвязей между микроРНК и целями были зарегистрированы с помощью вычислительных анализа [5], [6]. Тем не менее, было лишь несколько работ, экспериментально проверяющие несколько к множественным отношений в раковых клетках.
<Р> Рак желудка является четвертым наиболее распространенным человеческим злокачественное заболевание, а второй наиболее частой причиной связанной с раком смерти во всем мире, по оценкам одного миллиона новых случаев в год [7]. Рака желудка гистологически подразделяются на два основных типа, кишечная и диффузные типы [8]. Диффузный типа GC часто неразрешимыми и обладает плохой прогноз для пациента. Недавно мы показали, что потеря функций CDH1 и Trp53 индуцирует диффузного типа GC с использованием моделей мышей [9]. Хотя эта находка поможет нам разработать новые методы лечения желудка человека рака, дальнейшие исследования по выяснению молекулярных механизмов, лежащих в желудочном канцерогенезе необходимо разработать другие подходы к целенаправленной терапии
. <Р> Promoter CpG остров гиперметилирование является одним из наиболее распространенных механизмов с помощью которых гены-супрессоры опухолей, инактивируют в злокачественных опухолях человека [10]. В последнее время стало очевидным, что некоторые микроРНК также цели эпигенетической глушителей в раковых заболеваний [11]. Наши и другие группы ранее показали, что фармакологические или генетическое нарушение метилирования ДНК в раковых клеточных линий индуцирует до регуляции значительного числа микроРНК [12] - [15]. Эти данные привели к идентификации кандидатов опухолевых подавляющих микроРНК, чьи глушителей связано с CpG острова метилирования. До сих пор, метилирование членов семьи микроРНК-124 была обнаружена в колоректального рака и опухолей в других органах [11]. Кроме того, микроРНК-34b /C кластер имеет типичный остров CpG, и подавляется через частое метилирования при колоректальном раке и рака желудка [12]. Кроме того, мы обнаружили, что микроРНК-181C метилирование ассоциируется с желудочным канцерогенезе путем регуляции генов онкогенных KRAS
и NOTCH4
[13]. Понижающей регуляции многих микроРНК через метилирование одновременно происходит в раковых клетках, и может усилить несколько к многообразных взаимосвязей между микроРНК и целями.
<Р> В этом исследовании для проверки нескольких к многообразных взаимосвязей между микроРНК и целями в раковых клетках, мы показали, что две пары нескольких микроРНК, микроРНК-224 и -452, и MIR-181C и -340, имели несколько генов-мишеней и синергически уменьшилось пролиферацию клеток путем регулирования их мишеней в клетках человека GC.

Результаты

50 микроРНК были повышающей регуляции в клеточной линии GC, КАТО-III, после того, как 5-аза-2'-дезоксицитидин Лечение
<р> Для того, чтобы определить кандидатов микроРНК, которые синергически влияют на их гены-мишени, мы повторно проанализировали наши предыдущие данные микрочипов (GEO инвентарный N GSE16006) [13]. Мы считали, что уровни микроРНК были повышающей регуляции на 5-аза-2'-дезоксицитидин лечения (5-аза-корд), когда чистые интенсивности отдельных пятен 3 были более чем в 1,5 раза. Кроме того, мы также выбрали микроРНК из которых были найдены средние быть увеличена более чем в 3 раза по анализу микрочипов. На основе этих новых критериев, мы обнаружили, что 50 микроРНК были повышающей регуляции в клеточной линии GC, Kato-III (таблица S1). Мы подтвердили повышающую регуляцию 5 из 6 представительных микроРНК-предшественников, то есть, микроРНК-145, -148a, -152, -224 и -340, после того, как 5-аза-корд лечения с помощью ОТ-ПЦР (рис 1А).

TargetScan Прогнозируемая Общие гены-мишени кандидата микроРНК
<р> для того, чтобы определить, является ли эпигенетически регулируемые микроРНК имеют общие гены-мишени, мы искали базу данных TargetScan (версия 5.1) для их общих целей. Согласно TargetScan, 50 микроРНК могут быть разделены на 46 групп, основанных на их семенных последовательностей. TargetScan также показали, что эти 46 групп могут предназначаться 6460 генов. Среди этих генов-мишеней, мы выбрали 13 из которых выражение было сообщено быть увеличено в GC в базе GEO (GEO инвентарный N GSE2685) или быть связаны с канцерогенеза желудка (таблица S2). Здесь мы сосредоточимся на четырех микроРНК, микроРНК-152, -181c, -224 и -340, потому что мы уже сообщали о том, что микроРНК-181C эпигенетически вниз регулируется в GC [13] и CpG острова расположены в верховьях регионах три других микроРНК (рис 2А и С, а на рис S1). На рисунке 2а также показывает, что микроРНК-452 кластер с микроРНК-224. TargetScan предсказал, что пять микроРНК могут регулировать общие цели. Например, DPYSL2
(dihydropyrimidinase типа 2, также известный как рушится ответ посредническую белок 2, CRMP2
) является мишенью MIR-224, -452 и -181c, KRAS
от MIR-224, -452, -340, -181c и -152, и MECP2
(метил-CpG-связывающий белок 2) MIR-181C и -340, соответственно (рис 3).

Выражение MIR-224, -452, -152 и -340 Снижение на гиперметилирование ДНК в клеточных линиях GC
<р> Мы рассмотрели участие эпигенетических изменений в понижающей регуляции микроРНК. Выражение MIR-224, -340 и -152 был увеличен на 5-аза-корд лечения в нескольких клеточных линиях GC (Рисунок 1В). Мы анализировали количественно экспрессию зрелых микроРНК-224 в 9 GC клеточных линий и линии клеток колоректального рака (CRC). Нет экспрессии микроРНК-224 не был обнаружен у 7 из 10 линий раковых клеток (рис 1C). Мы также проанализировали изменение экспрессии кластера микроРНК-224 /-452 в клетках КАТО-III, обработанных с низкой дозой 5-аза-0,2 (корд мкмоль /л), ингибитор гистондезацетилазы, трихостатин A (TSA, 0,3 мкмоль /л), или сочетание этих двух препаратов. Клетки КАТО-III с лечением низкими дозами 5-аза-корд выставлены до регуляции кластера микроРНК-224 /-452, в то время как TSA само по себе не вызывает повышающую регуляцию. МикроРНК-224 /-452 кластер синергически повышающей регуляции в клетках КАТО-III с комбинированным 5-аза-корд и лечения TSA (рис 1D). Эти результаты указывают на то, что микроРНК-224 и микроРНК-452 может быть понижающей регуляции через метилирование ДНК в ГХ клеточных линиях, как же единицы транскрипции.
<Р> Сообщалось, что интронные микроРНК регулируются посредством метилирования промотора их хозяина генов [14], [15]. По результатам вычислительного анализа, микроРНК-224 /-452 кластер и микроРНК-340 расположены в интроне 6 в Gabre
и интрона 2 в RNF130
, соответственно, оба из которых содержат плотные островки CpG только в промоторных участков генов хозяина (рис 2А и с). Мы исследовали связь между уровнями экспрессии этих микроРНК и статуса метилирования генов-хозяев в линиях клеток GC с помощью анализа MSP. GC клеточные линии без микроРНК-224 выражения выставлены только метилирования сигналов, тогда как экспрессия-положительных клеточных линий выставлены сильные unmethylation модели (рис 2B). Аналогичная зависимость была обнаружена для MIR-340 в клеточных линиях GC (Рисунок 2D). Эти данные указывают на то, что экспрессия этих микроРНК в линиях клеток GC может быть подавлен с помощью метилирования промотора их генов хозяина.

эпигенетически регламентированные микроРНК может быть связано с пролиферации клеток GC

Для того, чтобы определить, является ли эпигенетически регулируется микроРНК являются опухоль-подавляющих или нет, мы оценивали эффект 5-аза-ВСЗ siDICER1-трансфицированных КАТО-III и DICER1 KO НСТ116 (D1KO) клеток (рис 4а). Необработанные КАТО-III и родительские НСТ116 клетки показали замедлилась пролиферацию после обработки 5-аза-корд. С другой стороны, в siDICER1-трансфецированных клеток КАТО-III и D1KO, действие 5-аза-корд обработки на пролиферацию клеток стали слабыми в обоих случаях. Эти результаты свидетельствуют о том, что эффект 5-аза-корд был уменьшен в низких или нулевых клеток DICER1, и что эпигенетически регулируемые микроРНК играют важную роль в GC и клеток CRC.
<Р> Для того, чтобы проанализировать взаимосвязь между этими микроРНК и 13 генов-мишеней, показанные в таблице S2, мы трансфецировали клетки КАТО-III с siDICER1 и /или обрабатывают с помощью 5-аза-корд. Несмотря на то, выражение 3 ( DPYSL2
, KRAS
и MECP2
) из 13 генов были снижены после того, как 5-аза-корд лечения, экспрессия этих генов сделал не меняется на 5-аза-корд обработки с последующим трансфекцией siDICER1 (Рисунок 4В).

комбинационных Трансфекция микроРНК-224 и -452 Репрессированные пролиферации GC Cell
<р> Мы трансфицировали линии GC клеток с микроРНК-224 и /или -452 подражает в качестве представителя кластеров микроРНК, или отрицательного контроля, а затем осуществляется водой решена тетразолиевую-8 (WST-8) анализов. Семьдесят два часа после трансфекции, мы наблюдали, что эктопическая экспрессия микроРНК-224 или -452 подавляет рост двух клеточных линий, Kato-III и AGS (рис 5А). Следует отметить, что комбинационная трансфекция микроРНК-224 и -452 подражает активно снижала рост линий двух ГХ клеток (рис 5А).

The микроРНК-224 /-452 кластера Co-оперативно снижение экспрессии DPYSL2
и KRAS

<р> для того, чтобы исследовать вопрос о том или нет кластер микроРНК-224 /-452 на самом деле связано с регулированием DPYSL2
и KRAS
, мы проанализировали выражение DPYSL2
после трансфекции клеток КАТО-III и AGS с отдельно или вместе с микроРНК-224 /-452 кластера. Мы проводили ОТ-ПЦР и Вестерн-блот-анализа. DPYSL2
и Крас
уровни мРНК были снижены после трансфекции с микроРНК-224 или микроРНК-452 мимической (фиг.5В). Интересно отметить, что в случае комбинационной трансфекция MIR-224 и -452, экспрессия этих генов-мишеней была далее понижающей регуляции (Фиг.5В). Понижающего регулирования DPYSL2 также наблюдалось на уровне белка в обеих клеточных линиях (5С). Мы также исследовали уровни экспрессии других генов пяти, MECP2, MYC, JUNB, MUC1
и SETDB1
, которые не были показаны в качестве мишеней для микроРНК-224 или -452 по TargetScan. Как и следовало ожидать, никаких экспрессивные изменения этих пяти генов были обнаружены в клетках КАТО-III после трансфекции с MIR-224 или -452 (рис S2). Эти данные свидетельствуют о том, что микроРНК-224 и -452 специфически вниз регулируется DPYSL2
и KRAS
.

DPYSL2
был связан с GC пролиферации клеток

Мы исследовали влияние нокдаун DPYSL2
, который был показан, чтобы быть мишенью кластера микроРНК-224 /-452, на пролиферацию клеток. Трансфекция DPYSL2
миРНК явно снизились уровни DPYSL2
транскриптов (рисунок 5D), и ингибирует рост AGS и КАТО-III клеток через 72 часа после нокдауна DPYSL2
(Рисунок 5E), указывая, что DPYSL2 имеет онкогенного активностью.

комбинационных Трансфекция микроРНК-340 и -181c Репрессированные GC пролиферации клеток, и индуцированные понижающую регуляцию KRAS
и MeCP2
Выражение

в качестве второго примера множественных к многообразных взаимосвязей между микроРНК и генов-мишеней, мы проанализировали связь между микроРНК-340 /-181c и KRAS /MECP2 .
Когда микроРНК-340 и микроРНК-181C трансфицировали в клетки КАТО-III, пролиферацию был синергически вниз регулируется двумя микроРНК (рис 6А). Для того, чтобы определить, является ли эпигенетически регулируется микроРНК-340 и микроРНК-181C кооперации влияют на их цели, мы проанализировали уровни мРНК KRAS
и MECP2.
На основании анализа RT-PCR, KRAS
и MECP2
были признаны вниз регулируется микроРНК-340 и только MIR-181C или комбинационной трансфекции в клетках КАТО-III (рис 6б). Что касается четырех генов, MYC, JUNB, MUC1
и SETDB1
, не показывая предсказанные сайты для этих двух микроРНК по TargetScan, уровни экспрессии не были изменены в данном исследовании. Типичные данные представлены на рисунке 6B. Таким образом, эффекты микроРНК-340 и -181c могут быть специфическими для их общих генов-мишеней, а также MIR-224 и -452.

Экспрессия и метилирования статус микроРНК-224 и -340 в первичных GC Случаи
<р> Мы исследовали статус метилирования MIR-224 и -340 в первичных случаях GC. Метилированные модели MIR-224 были обнаружены в 15 из 26 (57,7%) первичных тканей GC (Рисунок 7A и таблица 1). Соединенный незлокачественный слизистая желудка практически не проявляли метилирование микроРНК-224. Далее, мы количественно исследовали уровни микроРНК-224 в первичных тканей ГХ и соответствующим нераковая слизистыми оболочками путем TaqMan RT-PCR. Значительное снижение экспрессии микроРНК-224 в GC тканях наблюдалось в случаях рака метилированию по сравнению с положительным в метилирования-отрицательными и нераковая желудочной слизистой оболочки (рис 7в).
<Р> Далее мы проанализировали DPYSL2
уровни мРНК по сравнению со статусом метилирования микроРНК-224 в тканях GC: ШС с микроРНК-224 метилирования (Са микроРНК-224 Мт), ГКС с микроРНК-224 unmethylation (Са микроРНК-224 Un), и не -cancerous ткани с unmethylation (N микроРНК-224 Un). DPYSL2
Уровень мРНК в группе "Са микроРНК-224 Мт" была значительно выше, чем в "N MIR-224 Un" и "Са микроРНК-224 Un" группы, р = 0,049 и р = 0,035, соответственно (рис 7D). Таким образом, существует корреляция между статусом метилирования микроРНК-224 и DPYSL2
экспрессии в тканях GC.
<Р> метилирования частота микроРНК-340 была относительно низкой в ​​первичной GC тестируемых тканях (4 26, 15,4%) (рис 7В и таблица 1), в то время как ни один из 26 не спарены незлокачественный слизистая желудка выставлены очевидные закономерности метилирования микроРНК-340. Что касается микроРНК-152 анализа метилирования, мы попробовали три наборов праймеров, предназначенных в восходящем области микроРНК-152, содержащих острова CpG (рис S1), но ни один из них полностью не соответствует микроРНК-152 выражение МПВ анализа (данные не показаны).

Обсуждение
<р> Несмотря на то, что было сообщено, что экспрессия некоторых микроРНК уменьшается в течение нескольких видов рака через метилирование ДНК, большинство отчетов описано, что связь между аномальным выражение микроРНК и его генов-мишеней была один-к-одному, один-к-кратное или несколькими взаимно однозначным. Для того, чтобы изучить возможность многократного к многообразных взаимосвязей между микроРНК и целевых задач в раковых клетках, мы сосредоточились на двух комбинациях микроРНК в клетках GC, то микроРНК-224 /-452 кластер, и микроРНК-181C и -340, в данном исследовании , Мы обнаружили, что два набора микроРНК, MIR-224 и -452, и MIR-181C и -340, имели несколько генов-мишеней, DPYSL2
и KRAS
, и KRAS
и MECP2
, соответственно, и синергетически снизились на пролиферацию клеток в линии ГХ клеток человека. Следует отметить, что онкоген, KRAS
[16], было установлено, что мишенью четырех микроРНК, хотя кандидаты сайты связывания четырех микроРНК отличаются в 3'-UTR из KRAS <бр> (TargetScan). Ранее мы сообщали, что микроРНК-181C вниз регулируется NOTCH4
тоже [13]. Таким образом, множественный к многообразных взаимосвязей между микроРНК и целями были указаны не только базы данных анализов, но и экспериментами с участием трансфекции клеток человека.

MIR-224- и /или -340-выражение-негативных линий GC клеток Выставленные гиперметилирование сигналы на анализе и MSP экспрессии микроРНК-224 и -340 восстановлен на лечение деметилирующий агента. Кроме того, чаще наблюдалось гиперметилирование микроРНК-224 и -340 в первичных ШС, чем соответствующие доброкачественное слизистые оболочки. В микроРНК-224 метилирования-положительных случаев, экспрессия микроРНК-224 был значительно ниже, чем в метилирования-отрицательных. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что аберрантных метилирования ДНК является одним из ключевых механизмов, лежащих в основе понижающего регулирования микроРНК-224 и -340 в GC клетки.
<Р> Мы показали, что ингибирование микроРНК обработки путем siDICER1 трансфекции или с использованием DICER1 Нокаут клеток снижало эффект 5-аза-корд, то есть, снижение пролиферации клеток и понижающую регуляцию генов-мишеней, в GC и клетках CRC. Было сообщено, что обилие DICER1, фермента, который катализирует конечную стадию созревания микроРНК, непосредственно связано с опухолевой прогрессии [17]. Эти результаты свидетельствуют о том, что аберрантное регуляция микроРНК созревания способствует образованию GC и CRC.
<Р> Мы обнаружили, что кластер микроРНК-224 /-452 был аберрантно вниз регулируется в ШС через гиперметилированием. Аномальная экспрессия микроРНК-224 также сообщалось в других опухолей. Выражение MIR-224, пусть-7F и микроРНК-516a снижается при раке яичников, и они синергически регулируют экспрессию калликреин, связанных с пептидазы 10 (KLK10) [18]. микроРНК-224 вниз регулируется в метотрексата устойчивых клеточных линиях CRC по сравнению с чувствительными клетками в [19]. Здесь мы также показали, что статус метилирования MIR-224 коррелировала с DPYSL2
уровне в человеческом ШС. Взятые вместе, микроРНК-224 играет важную роль как опухоль-подавляющих микроРНК в GC, а также в ряде других видов рака. В противоположность этому, микроРНК-224 вверх регулируется в гепатоцеллюлярной карциномой [20] и медуллобластома [21] по сравнению с в нормальных тканях. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, чтобы уточнить роль микроРНК-224 в канцерогенезе.
<Р> Мы исследовали общие целей эпигенетически вниз регулируемых микроРНК. DPYSL2
было показано, что вниз регулируется микроРНК-224 и -452. DPYSL2 играет важную роль в установлении полярности нейронов [22]. DPYSL2 также участвует в пути, которые регулируют пролиферацию не-нейрональных клеток через его фосфорилирования регуляторных белков. DPYSL2 претерпевает динамические изменения фосфорилирования в ответ на контакт ингибирование индуцированного состояния покоя и гиперфосфорилированию DPYSL2 происходит в опухоли [22]. Хотя роль DPYSL2 в ШС не ясно, наша миРНК на основе нокдаун экспрессии DPYSL2 вызывало снижение пролиферации в двух GC клеточных линий, предполагая онкогенного активности DPYSL2.
<Р> Таким образом, наши результаты показывают, что кратно к многообразных взаимосвязей между микроРНК и генов-мишеней действительно существуют в GC. Вполне вероятно, что аберрантных метилирования уменьшает экспрессию нескольких опухолевых подавляющих микроРНК, такие как MIR-224, -452, -340 и -181c, которые затем индуцируют избыточная экспрессия нескольких онкогенных генов, как и KRAS
, DPYSL2
, и MECP2
. Эти ненормальные множественные к многообразных взаимосвязей между микроРНК и целями будет одним из важных механизмов, лежащих канцерогенеза желудка. Поэтому, вполне возможно, что эпигенетические препараты могут нормализовать экспрессию не только опухолевые супрессии генов, но и множественными опухолевыми Супрессивную микроРНК, в результате чего уменьшается ненормального множественных к многообразных взаимосвязей между микроРНК и целями, и, таким образом, может стать превосходные терапевтические препараты против рака.

Материалы и методы

этика Заявление
<р> Письменное информированное согласие было получено от всех субъектов, а также комитет по этике Токио медицинского и стоматологического университета школа Медицина одобрила это исследование.

Клеточные линии образцов тканей и
<р> Мы изучили 9 клеточных линий GC (КАТО-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 и GCIY), 2 клеточные линии CRC (НСТ116 и DICER1
выбивают HCT116 [23]), и 26 случаев первичные GC. MKN45, MKN74, TGBC11TKB и GCIY были приобретены у банка RIKEN клеток, и КАТО-III и АГС были из АТСС (American Type Cell Collection). HSC59, HSC43 и HSC58 были получены от доктора Кадзуёси Янагихара [24], [25]. КАТО-III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 и HSC58 выращивали в среде RPMI 1640 и AGS, TGBC11TKB, GCIY и две клеточные линии CRC в Дульбекко модифицированной среде Игла, минимальная поддерживающая среда или 5A Маккоя, дополненной 10% эмбриональной бычьей в сыворотке крови. Хирургически удаленных образцов из 26 пациентов первичного GC были случайным образом получены из филиал больницы медицинской школы Токийского медицинского и стоматологического университета.

В силикомарганца Анализ
<р> Мы ссылались на базу данных GEO для микроРНК и профили экспрессии генов (GEO, инвентарный N GSE16006 и GSE2685). Мы также использовали микроРНК целевой базы данных "TargetScan".

Drug Обработка клеток и РНК экстракция
<р> Для исследования деметилирования клетки ежедневно обрабатывали 5 мкмоль /л 5-аза-корд (Сигма Олдрич, Сент-Луис, Миссури) в течение 72 часов. Мы также обработанных клеток с 0,3 мкмоль /л TSA в одиночку, так и с комбинацией 0,2 мкмоль /л 5-аза-корд и TSA. Общую РНК выделяли с использованием реагента тризола (Invitrogen, Carlsbad, CA) или miRNeasy мини-комплект (Qiagen, Hilden, Германия).

Количественные в режиме реального времени с обратной транскрипцией-полимеразная цепная реакция
<р> в режиме реального времени обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (оТ-ПЦР) анализы проводились с использованием StepOne ПЦР в реальном времени системы (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq Master Mix с ROX (Roche, Mannheim, Германия), TaqMan обратной транскрипции комплект (Applied Biosystems) и анализы TaqMan микроРНК (Applied Biosystems), в соответствии с инструкциями производителя. Уровни экспрессии микроРНК были рассчитаны на основе от количества мишени микроРНК по отношению к количеству RNU6B в качестве контроля для нормализации начального приема тотальной РНК.

метилирования Анализ
<р> бисульфит обработка ДНК была выступал с Methylamp (Epigentek, Бруклин, Нью-Йорк). Специфической в ​​отношении метилирования полимеразной цепной реакции (ПНС) анализы проводили, как описано ранее [26]. Последовательности праймеров и размеров ПЦР-продукта приведены в таблице S3.

Синтетический микроРНК Трансфекция
<р> клеток КАТО-III и AGS трансфицировали прекурсора Молекула имитируя микроРНК-224, -452, -340 или -181c, или омлет последовательность микроРНК (Sigma), чтобы получить конечную концентрацию 25-50 нмоль /л с помощью электропоратора, неон (Invitrogen), в соответствии с инструкциями изготовителя. В 24-72 ч после трансфекции клетки собирали для RT-PCR или Вестерн-блот-анализа.

Анализ пролиферации клеток

микроРНК-мимических-трансфецировали КАТО-III и AGS клеток высевали на 1 × 10 ^{3 или 1 × 10 4 клеток на лунку на 96-луночные планшеты. пролиферации клеток оценивали на 1-4 дней после трансфекции путем определения количества клеток с реагентом пролиферации клеток WST-8 (DOJINDO Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Япония), в соответствии с инструкциями изготовителя.}

миРНК Целевой показатель предсказания и Вестерн-блоттинг
<р> прогнозируемые цели микроРНК и их целевых сайтов были проанализированы с использованием TargetScan. Уровни экспрессии мРНК предсказанных мишеней в транзиторно трансфицированных клеток анализировали через 24 ч после трансфекции с помощью RT-PCR. Западные анализы блот выполняли, как описано ранее [26]. Первичные антитела использовали кроличье анти-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Мы использовали мышиное анти-альфа-тубулина (1:1000; SC-8085, Santa Cruz Biotechnology) в качестве внутреннего контроля для вестерн-блоттинга. Вторичные антитела, используемые были щелочная фосфатаза-конъюгированным антителом против кроличьего IgG и анти-IgG мыши (1:2000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Пятна были разработаны с ImmunoStar AP субстрата (Bio-Rad Laboratories).

Поддержка Информация рис S1
.
Схематическое представление COPZ2
область, содержащую микроРНК-152. Заполненые представляют экзонов COPZ2
А и пустое поле обозначает нетранслируемую область COPZ2
. Изогнутый стрелка указывает на начало транскрипции сайт COPZ2
. Вертикальная стрелка указывает на расположение микроРНК-152. Вертикальные линии указывают на сайты CpG. Наконечники указывают регионы исследуют на МПВ
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s001
(TIFF) Рисунок S2
.
Эффекты трансфекции микроРНК-224 и -452 в клетках КАТО-III. ОТ-ПЦР анализы после трансфекции с микроРНК-224 и /или -452. Экспрессия генов-мишеней была проанализирована 48H позже с помощью ОТ-ПЦР. микроРНК-224 и -452 специфически вниз регулируется DPYSL2
и KRAS
, но не другие пять генов исследовали, которые согласуются с результатами анализа базы данных (Рисунок 3).
DOI: 10.1371 /journal.pone.0062589.s002
(TIFF)
таблице S1.
Expression профилирование человеческих микроРНК в клетках КАТО-III после обработки 5-аза-корд
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s003
(XLSX)
Таблица S2.
Список генов-мишеней, из которых мы исследовали экспрессию с помощью ОТ-ПЦР после лечения с использованием или без 5-аза-корд, и трансфекция с 20 нмоль /л siDICER1 или омлет Серна
DOI:. 10,1371 /journal.pone .0062589.s004
(XLSX)
Таблица S3.
Последовательности праймеров, использованных в данном исследовании
DOI: 10.1371. /journal.pone.0062589.s005
(XLSX)

Выражение признательности
<р> Мы хотели бы поблагодарить д-ра Bert Фогельштейна для обеспечения DICER1 нокаут-клеточную линию HCT116.

• PLoS ONE: Гипоксия Стимулирует ТЭИ клеток рака желудка через АУТОКРИННОЙ TGF-beta Signaling
• PLoS ONE: Flotillin2 Expression коррелируется с HER2 уровней и плохим прогнозом рака желудка