PLoS ONE: Multiple-to-Multiple Relaties tussen MicroRNA's en Target genen in Gastric Cancer

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) fungeren als transcriptieregulators en cruciale rol spelen in het ontstaan ​​van kanker. Volgens miRNA doelwit databases, kan men miRNA vele genen reguleren als de doelstellingen, terwijl één gen kan worden gericht door vele miRNAs. Deze bevindingen geven aan dat relaties tussen miRNAs en hun doelen niet één-op-één zijn. Maar veel rapporten beschreven slechts een een-op-een één-op-multiple of meervoudige-op-een relatie tussen miRNA en zijn doelgen in humane kankers. Derhalve moet worden vastgesteld of een combinatie van sommige miRNAs meerdere doelen wordt gereguleerd en zijn betrokken bij kanker. Om enkele groepen van miRNAs die synergetisch hun doelstellingen kunnen reguleren in menselijke maagkanker (GC) vinden we opnieuw geanalyseerd onze vorige miRNA expressie-array data en vond dat 50 miRNAs waren up-gereguleerd op behandeling met 5-aza-2'-deoxycytidine in een GC-cellijn. De "TargetScan" miRNA doeldatabase voorspelde dat sommige van deze miRNAs hebben gemeenschappelijke doel genen. We ook verwezen naar de GEO database expressie van deze gemeenschappelijke doelgenen in menselijke GCs, wat kan worden gerelateerd aan maagkanker. In deze studie analyseerden we twee miRNA combinaties, miR-224 en -452 en miR-181 quater en -340. Over-expressie van zowel miRNA combinaties drastisch neerwaarts gereguleerd hun target genen, DPYSL2 Kopen en KRAS
en KRAS Kopen en MECP2
, respectievelijk. Deze miRNA combinaties synergistisch verlaagde celproliferatie na transfectie. Verder hebben we aangetoond dat deze miRNAs werden down-gereguleerd door de promotor hypermethylatie in GC cellen. Derhalve is het waarschijnlijk dat de relatie tussen miRNAs en hun doelen niet één-op-één of meerder tot meerdere in GCs en dat deze complexe relaties kan worden gerelateerd aan maagkanker

Citation:. Hashimoto Y, Y Akiyama, Yuasa Y (2013) Multiple-to-Multiple Relaties tussen MicroRNA's en Target Genen bij maagkanker. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10.1371 /journal.pone.0062589

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Ontvangen: 14 december 2012; Aanvaard: 24 maart 2013; Gepubliceerd: 8 mei 2013 |

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de A3 foresight-programma van de Japan Society voor de Bevordering van de Wetenschap (JSPS) (JJ) en Research Fellowships van de JSPS voor jonge onderzoekers (YH). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

MicroRNAs (miRNAs), een klasse van kleine niet-coderende RNA's zijn geïdentificeerd als een nieuw type gen regulator die binden aan het 3'-ongetranslateerde gebieden (UTR) van het doel-mRNA, hetgeen resulteert mRNA afbraak of de blokkade van mRNA translatie [1]. Het is algemeen bekend dat miRNA veranderingen zijn geassocieerd met tumorigenese [1]. Volgens miRNA doelwit databases, kan men miRNA vele genen reguleren als de doelstellingen, terwijl één gen kan worden gericht door vele miRNAs. Echter, een groot aantal studies bleek een één-op-één relatie tussen miRNA en zijn doelwit-gen. Ook is gemeld dat meervoudige of een cluster van miRNAs coöperatief regelen een gen, die verband houdt met carcinogenese [2] - [4]. Anderzijds worden meerdere genen voorwerp van een miRNA [3], [4]. Zelfs meerdere naar meerdere verbanden tussen miRNAs en doelstellingen zijn gemeld door middel van computationele analyse [5], [6]. Er zijn echter slechts een paar papieren experimenteel valideren meerdere naar meerdere relaties kankercellen zijn.

Maagkanker is de vierde meest voorkomende menselijke kwaadaardige ziekten en de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd, met naar schatting een miljoen nieuwe gevallen per jaar [7]. Gastrische kankers histologisch geclassificeerd in twee belangrijke types, de darm en diffuse type [8]. Diffuse-type GC is vaak hardnekkig en vertoont een slechte prognose voor de patiënt. Onlangs hebben we aangetoond dat het verlies van de Cdh1 en Trp53 functies induceert diffuse soort GC met behulp van muismodellen [9]. Hoewel deze bevinding mee helpt om nieuwe menselijke maagkanker therapieën, verder onderzoek naar de moleculaire mechanismen van maagkanker noodzakelijk andere methoden voor gerichte therapie ontwikkelen te ontwikkelen.

promotor CpG eiland hypermethylatie is een van de meest voorkomende mechanismen waarbij tumor suppressor genen zijn geïnactiveerd in humane kanker [10]. Recentelijk is gebleken dat sommige miRNAs zijn ook doelen van epigenetische inactivatie bij kanker [11]. Onze en andere groepen hebben eerder aangetoond dat farmacologische of genetische verstoring van DNA methylering in kanker cellijnen induceert opregulatie aanzienlijke aantallen miRNAs [12] - [15]. Deze gegevens hebben geleid tot de identificatie van kandidaat-tumor-onderdrukkende miRNAs waarvan silencing wordt geassocieerd met CpG eiland methylatie. Tot dusver is methylering van miR-124 familieleden geïdentificeerd in colorectale kanker en tumoren van andere organen [11]. Bovendien, de miR-34b /c cluster een typische CpG eiland en wordt neerwaarts gereguleerd door veelvuldig methylatie in colorectale en maagkanker [12]. Ook vonden we dat miR-181 quater methylatie wordt geassocieerd met de maag carcinogenese via regulering van de oncogene genen KRAS Kopen en NOTCH4
[13]. Neerwaartse regulatie van veel miRNAs tot methylatie gelijktijdig optreedt in kankercellen, en kunnen meerdere naar meerdere verbanden tussen miRNAs en targets verbeteren.

In dit onderzoek, te valideren meerdere naar meerdere verbanden tussen miRNAs en doelen in kankercellen, hebben we aangetoond dat twee paar verschillende miRNAs, miR-224 en -452 en miR-181 quater en -340, had meerdere doel genen en synergetisch verminderde celproliferatie door regulatie van hun targets in menselijke GC cellen.

Resultaten

50 miRNAs werden up-gereguleerd in een GC-cellijn, KATO-III, na 5-aza-2'-deoxycytidine Treatment

Om kandidaat miRNAs te identificeren die synergetisch van invloed op hun target genen, we opnieuw geanalyseerd onze vorige microarray data (GEO toetreding No. GSE16006) [13]. We hebben overwogen dat miRNA niveaus waren up-gereguleerd op 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-CDR) behandeling wanneer de netto-intensiteiten van bepaalde 3 plekken waren meer dan 1,5-voudig. Verder hebben we ook gekozen miRNAs waarvan de gemiddelden bleken te verhogen dan 3-voudig op microarray analyse. Op basis van deze nieuwe criteria, vonden we dat 50 miRNAs werden up-gereguleerd in een GC-cellijn, KATO-III (tabel S1). We bevestigden de opregulatie van 5 of 6 representatieve precursor miRNAs, dat wil zeggen, miR-145, -148a, -152, -224 en -340, na 5-aza-CdR behandeling door RT-PCR (Figuur 1A).

TargetScan Voorspelde Common Target genen van de kandidaat-miRNAs

Om te bepalen of epigenetisch gereguleerde miRNAs hebben gemeenschappelijke doel genen, zochten we de TargetScan database (versie 5.1) voor hun gemeenschappelijke doelen. Volgens TargetScan, kon 50 miRNAs worden ingedeeld in 46 groepen op basis van hun zaad sequenties. TargetScan toonde ook aan dat deze 46 groepen kunnen richten op 6.460 genen. Onder deze doelgenen, selecteerden we 13 waarvan expressie werd gerapporteerd GC te vermeerderen naar de GEO database (GEO toegangsnummer GSE2685) of gerelateerd aan maagkanker (tabel S2). Hier richten we ons op vier miRNAs, miR-152, -181c, -224 en -340, want we hebben al gemeld dat miR-181 quater is epigenetisch down-gereguleerd in GC [13] en CpG eilanden liggen in de upstream regio's van drie miRNAs (Figuur 2A en C, en figuur S1). Figuur 2a laat ook zien dat miR-452 is geclusterd met miR-224. TargetScan voorspelde dat de vijf miRNAs gemeenschappelijke doelen kunnen reguleren. Bijvoorbeeld, DPYSL2
(Dihydropyrimidinase-achtige 2, ook wel bekend als instortende response mediator protein 2, CRMP2
) is doelwit van miR-224, -452 en -181c, KRAS
door miR-224, -452, -181c, -340 en -152, en MECP2
(methyl CpG bindend eiwit 2) van miR-181 quater en -340, respectievelijk (figuur 3).

de expressie van miR-224, -452, -152 en -340 Verminderde op DNA Hypermethylering in GC cellijnen

We hebben gekeken naar de rol van epigenetische veranderingen in de down-regulatie van de miRNAs. De expressie van miR-224, -340 en -152 werd verhoogd met 5-aza-CdR behandeling GC verschillende cellijnen (Figuur 1B). We kwantitatief geanalyseerd volwassen miR-224 expressie in 9 GC cellijnen en een colorectale kanker (CRC) cellijn. Geen expressie van miR-224 werd waargenomen bij 7 van 10 kankercellijnen (Figuur 1C). We analyseerden ook de expressie verandering van de miR-224 /-452 cluster in KATO III cellen behandeld met een lage dosis van 5-aza-CdR (0,2 umol /l), een histondeacetylase remmer trichostatine A (TSA, 0,3 umol /l), of een combinatie van deze twee geneesmiddelen. KATO III cellen met een lage dosis 5-aza-CdR behandeling vertoonden up-regulatie van de miR-224 /-452 cluster, terwijl TSA alleen niet up-regulering veroorzaken. De miR-224 /-452 cluster werd synergetisch up-gereguleerd in KATO III cellen met gecombineerde 5-aza-CdR en TSA behandeling (figuur 1D). Deze resultaten geven aan dat miR-224 en miR-452 kan neerwaarts gereguleerd door de DNA methylatie in GC cellijnen dezelfde transcriptie-eenheid.

Vermeld is dat intron miRNAs worden geregeld via promoter methylatie van hun gastheer genen [14], [15]. Volgens de resultaten van computeranalyse, de miR-224 /-452 cluster en miR-340 bevinden zich in intron 6 in Gabre Kopen en intron 2 in RNF130
respectievelijk beide bevatten dichte CpG eilanden alleen in de promotergebieden van hun gastheer genen (Figuur 2A en C). Wij onderzochten de verhouding tussen de expressieniveaus van deze miRNAs en methylering status van hun gastheer genen in GC cellijnen door MSP analyse. GC cellijnen zonder miR-224 expressie vertoonde alleen methylatie signalen, terwijl de expressie-positieve cellijnen vertoonden sterke unmethylation patronen (Figuur 2B). Een soortgelijke relatie werd gedetecteerd voor miR-340 in GC cellijnen (figuur 2D). Deze gegevens tonen aan dat expressie van deze miRNAs in GC cellijnen kunnen worden onderdrukt door middel van promoter methylering van hun gastheer genen.

epigenetisch gereguleerde miRNAs kan worden gerelateerd aan GC Cell Proliferation

Om te bepalen of epigenetisch gereguleerd miRNAs zijn tumor-onderdrukkende of niet evalueerden we het effect van 5-aza-CdR in siDICER1 getransfecteerde KATO III en DICER1 KO HCT116 (D1KO) cellen (Figuur 4A). Het onbehandelde KATO III en ouderlijke HCT116 cellen vertoonden vertraagde proliferatie na behandeling met 5-aza-CdR. Anderzijds, in siDICER1 getransfecteerde KATO III cellen en D1KO het effect van 5-aza-CdR behandeling op celproliferatie werd zwak in beide gevallen. Deze resultaten suggereren dat het effect van 5-aza-CdR was verlaagd bij lage of nul DICER1 cellen en dat epigenetisch gereguleerde miRNAs spelen een belangrijke rol bij GC en CRC cellen.

Om de relatie tussen deze analyseren miRNAs en 13 doelgenen in tabel S2, we getransfecteerde KATO III cellen met siDICER1 en /of behandeld met 5-aza-CdR. Hoewel de expressie van 3 ( DPYSL2
, KRAS Kopen en MECP2
) van de 13 genen werden verlaagd na 5-aza-CdR behandeling, de expressie van deze genen hebben niet veranderen op 5-aza-CdR behandeling, gevolgd door transfectie van siDICER1 (Figuur 4B).

Combinatorische transfectie van miR-224 en -452 Onderdrukte GC Cell Proliferation

We getransfecteerde GC cellijnen met miR-224 en /of -452 bootst als vertegenwoordiger van miRNA clusters, of een negatieve controle, en vervolgens uitgevoerd in water opgelost tetrazolium-8 (WST-8) assays. Tweeënzeventig uur na transfectie, we vastgesteld dat ectopische expressie van miR-224 en -452 onderdrukte de groei van beide cellijnen, KATO III en AGS (figuur 5A). Met name combinatorische transfectie van de miR-224 en -452 bootst uitvoerig verminderde de groei van de twee GC cellijnen (Figuur 5A).

Het miR-224 /-452 Cluster coöperatief verminderde expressie van DPYSL2 Kopen en KRAS

om te onderzoeken of de miR-224 /-452 cluster eigenlijk is gerelateerd aan de regulering van de DPYSL2 Kopen en KRAS
, analyseerden we de expressie van de DPYSL2
na transfectie van KATO-III en AGS cellen met de miR-224 /-452 cluster alleen of samen. We uitgevoerd RT-PCR en Western blot analyses. De DPYSL2 Kopen en KRAS
mRNA niveaus werden verlaagd na transfectie met de miR-224 en miR-452 na te bootsen (Figuur 5B). Interessant is dat in het geval van combinatie-transfectie met miR-224 en -452, expressie van deze doelgenen werd verder neerwaarts gereguleerd (Figuur 5B). De neerwaartse regulatie van DPYSL2 werd ook waargenomen op het eiwitniveau in beide cellijnen (figuur 5C). We onderzochten ook de expressie van andere vijf genen, MECP2, MYC, JUNB, MUC1 Kopen en SETDB1
, die niet als doelwit werden getoond voor miR-224 of -452 door TargetScan. Zoals verwacht, waren er geen expressional veranderingen van deze vijf genen gevonden in KATO III cellen na transfectie met miR-224 en -452 (figuur S2). Deze gegevens suggereren dat miR-224 en -452 specifiek down-gereguleerd DPYSL2 Kopen en KRAS
.

DPYSL2
werd geassocieerd met GC Cell Proliferation

We hebben gekeken naar het effect van knock-down van de DPYSL2
, die getoond werd op een doelwit van de miR-224 /-452 cluster, op celproliferatie. De transfectie van DPYSL2
siRNA duidelijk verminderde de niveaus van de DPYSL2
transcripten (figuur 5D) en remde de groei van AGS en KATO-III cellen 72 uur na de knock-down van de DPYSL2
(Figuur 5E), wat aangeeft dat DPYSL2 heeft een oncogene activiteit.

Combinatorische Transfectie van miR-340 en -181c Onderdrukte GC Cell Proliferation, en geïnduceerde down-regulatie van KRAS
en MECP2
Expression

Als een tweede voorbeeld van multiple-to-multiple relaties tussen microRNAs en target genen, analyseerden we de relatie tussen miR-340 /-181c en KRAS /MECP2 .
Wanneer miR-340 en miR-181 quater werden getransfecteerd in KATO III cellen, proliferatie was synergetisch down-gereguleerd door twee miRNAs (figuur 6A). Om te bepalen of epigenetisch gereguleerd miR-340 en miR-181 quater co-operatief invloed hebben op hun doelstellingen, analyseerden we het mRNA niveaus van de KRAS Kopen en MECP2.
On RT-PCR-analyse, KRAS Kopen en MECP2
bleken te zijn down-gereguleerd door miR-340 en miR-181 quater alleen of combinatorische transfectie in KATO-III-cellen (figuur 6B). Die voor de vier genen MYC, JUNB, MUC1 Kopen en SETDB1
, toont geen voorspelde plaatsen voor deze twee miRNAs door TargetScan, de expressieniveaus waren niet veranderd in deze studie. Representatieve gegevens worden weergegeven in figuur 6B. Aldus kunnen de effecten van miR-340 en -181c specifiek voor hun gemeenschappelijke doelwitgenen en miR-224 en -452 zijn.

Expressie en methylatie status van miR-224 en -340 in primaire GC zaken

We hebben gekeken naar de methylatie status van miR-224 en -340 in het primair GC gevallen. Gemethyleerde vormen van miR-224 werden gedetecteerd in 15 van 26 (57,7%) primaire GC weefsels (Figuur 7A en Tabel 1). Gepaarde niet-kwaadaardige maag slijmvliezen nauwelijks vertoonde een methylatie patroon van miR-224. Vervolgens hebben we onderzocht kwantitatief de miR-224 niveau in het GC weefsels en overeenkomstige niet-carcinomateuze mucosae van TaqMan RT-PCR. Een significante vermindering van miR-224 GC expressie in weefsels werd waargenomen in methylering-positieve gevallen van kanker in vergelijking met methylatie-negatieve en niet-kanker maag slijmvliezen (figuur 7C).

We verder geanalyseerd DPYSL2
mRNA-niveaus in vergelijking met de methylatie status van miR-224 in GC weefsels: GC met miR-224 methylatie (Ca miR-224 Mt), GC met miR-224 unmethylation (Ca miR-224 Un), en niet -cancerous weefsels met unmethylation (N miR-224 Un). De DPYSL2
mRNA-niveau in de "Ca miR-224 Mt" groep was significant hoger dan die in de "N miR-224 Un" en "Ca miR-224 Un" groepen, p = 0,049 en p = 0,035, respectievelijk (Figuur 7D). Er is dus een correlatie tussen de methylatie status van miR-224 en DPYSL2
expressie in weefsels GC.

De miR-340 methylatie frequentie relatief laag in de primaire GC weefsels getest (4 van 26, 15,4%) (Figuur 7B en tabel 1), terwijl geen van de 26 gepaarde goedaardige gastrische mucosa vertoonden duidelijk methylatie patronen van miR-340. Als voor miR-152 methylatie analyse probeerden we drie primersets ontworpen in het stroomopwaartse gebied van miR-152 bevattende CpG eilanden (figuur S1), maar geen van deze volledig voldoen aan miR-152 expressie op MSP analyse (gegevens niet getoond).

Discussie

Hoewel is beschreven dat de expressie van sommige miRNAs is verminderd bij meerdere kankers met DNA methylatie meeste rapporten beschreven dat de relatie tussen afwijkende expressie van miRNAs en de doelwitgenen was één-op-één, één op meerdere of meervoudige-op-één. Om de kans op multiple-to-multiple relaties tussen miRNAs en doelwitten in kanker cellen te onderzoeken, hebben we ons gericht op twee combinaties van miRNAs in GC cellen, de miR-224 /-452 cluster, en miR-181 quater en -340, in deze studie . We vonden dat de twee reeksen van miRNAs, miR-224 en -452 en miR-181 quater en -340, had meerdere target genen, DPYSL2 Kopen en KRAS
en KRAS Kopen en MECP2
, respectievelijk, en synergetisch verminderde celproliferatie in menselijke GC cellijnen. Het is opmerkelijk dat een oncogen, KRAS
[16], bleek te worden gericht door vier miRNAs, hoewel kandidaat bindingsplaatsen van de vier miRNAs zijn verschillend in de 3'-UTR van KRAS
(TargetScan). We hebben eerder gemeld dat miR-181 quater down-gereguleerd NOTCH4
te [13]. Zo, multiple-to-multiple relaties tussen miRNAs en doelstellingen werden aangegeven, niet alleen door de database-analyses, maar ook door transfectie experimenten met menselijke cellen.

miR-224- en /of -340-expressie-negatieve GC cellijnen hypermethylering vertoonde signalen op MSP analyse en de expressie van miR-224 en -340 hersteld op demethyleringsmiddel behandeling. Bovendien hypermethylatie van miR-224 en -340 werd vaker waargenomen in het primair GC dan de overeenkomstige noncancerous slijmvliezen. In miR-224 methylatie-positieve gevallen, de expressie van miR-224 was aanzienlijk lager dan in methylatie-negatieve. Deze gegevens wijzen aan dat afwijkende DNA methylatie is een van de belangrijkste mechanismen verantwoordelijk voor neerwaartse regulatie van miR-224 en -340 GC cellen.

We hebben aangetoond dat remming van miRNA verwerking door siDICER1 transfectie of door DICER1 knockout cellen verminderde het effect van 5-aza-CdR, dat wil zeggen verminderde celproliferatie en down-regulatie van doelwitgenen in GC en CRC cellen. Er werd gemeld dat de overvloed van DICER1, het enzym dat de laatste stap van miRNA rijping katalyseert, wordt rechtstreeks bij tumorprogressie [17]. Deze resultaten suggereren dat afwijkende regulering van miRNA rijping draagt ​​GC en CRC vorming.

We vonden dat miR-224 /-452 cluster aberrant down-gereguleerd door middel van GC hypermethylering. Afwijkende expressie van miR-224 is ook gerapporteerd in andere tumoren. Expressie van miR-224, laat-7F en miR-516a is verminderd bij eierstokkanker, en ze synergetisch reguleren expressie van kallikreïne gerelateerde peptidase 10 (KLK10) [18]. miR-224 is down-gereguleerd in methotrexaat-resistente CRC cellijnen in vergelijking met in gevoelige cellen [19]. Hier hebben we ook gebleken dat de methylatie status van miR-224 werd gecorreleerd met de DPYSL2
niveau in de menselijke GC. Samen genomen, miR-224 speelt een belangrijke rol als een tumor-onderdrukkend miRNA in GC en verschillende andere kankers. Daarentegen wordt miR-224 opgereguleerd in hepatocellulaire carcinomen [20] en medulloblastomas [21] in vergelijking met de normale weefsels. Aldus zijn verdere studies nodig om de rol van miR-224 in carcinogenese verduidelijken.

We onderzochten de gemeenschappelijke doelstellingen van epigenetisch neergereguleerd miRNAs. DPYSL2
werd aangetoond dat down-gereguleerd door miR-224 en -452. DPYSL2 speelt een belangrijke rol bij de oprichting van neuronale polariteit [22]. DPYSL2 is ook betrokken bij wegen die de proliferatie van niet-neuronale cellen te reguleren door de fosforylering door regulerende eiwitten. DPYSL2 ondergaat dynamische fosforylering verandert als gevolg van contact-geïnduceerde remming rust en hyperfosforylering van DPYSL2 optreedt in een tumor [22]. Hoewel de rol van DPYSL2 in GCs is niet duidelijk, onze siRNA-gebaseerde knockdown van DPYSL2 expressie induceerde een verlaging van proliferatie in beide GC cellijnen, wat suggereert oncogene activiteit van DPYSL2.

Samenvattend onze bevindingen blijkt dat meerdere naar meerdere verbanden tussen miRNAs en doelgenen echt bestaan ​​in GC. Het is waarschijnlijk dat afwijkende methylering vermindert de expressie van meerdere tumor-onderdrukkende miRNAs, zoals miR-224, -452, -340 en -181c, die vervolgens induceren overexpressie van meerdere oncogene genen, zoals KRAS-
DPYSL2
en MECP2
. Deze abnormale meerdere naar meerdere verbanden tussen miRNAs en doelen zou een van de belangrijkste mechanismen van maagkanker is. Het is derhalve zeer waarschijnlijk dat epigenetische medicijnen de expressie van niet alleen tumor-onderdrukkende genen, maar ook meerdere tumor-onderdrukkende miRNAs kunnen normaliseren, waardoor afname van de abnormale meerdere naar meerdere verbanden tussen miRNAs en doelstellingen, en kan dus worden uitstekende therapeutische geneesmiddelen tegen kanker.

Materialen en methoden

Ethics Verklaring

Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle vakken, en de ethische commissie van de Tokyo Medical en Dental University School of Medicine goedgekeurde dit onderzoek.

cellijnen en weefselmonsters

We bestudeerden 9 GC cellijnen (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 en GCIY), 2 CRC cellijnen (HCT 116 en DICER1
knock-out HCT116 [23]), en 26 primaire GC gevallen. MKN45, MKN74, TGBC11TKB en GCIY werden gekocht bij RIKEN celbank, en KATO-III en AGS waren van ATCC (American Type Cell Collection). HSC59, HSC43 en HSC58 werden verkregen van Dr. Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 en HSC58 werden gekweekt in RPMI 1640, en AGS, TGBC11TKB, GCIY en de twee CRC cellijnen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, minimaal essentieel medium of McCoy's 5A, aangevuld met 10% foetaal runderserum serum. Chirurgisch resectiepreparaten vanaf 26 primaire GC patiënten werden willekeurig verkregen uit de Affiliated Hospital van de School of Medicine, Tokyo Medical en Dental University.

In silico analyse

We verwezen naar de GEO-database voor miRNA en genexpressie profielen (toetreding GEO No. GSE16006 en GSE2685). Wij gebruikten ook miRNA doeldatabase "TargetScan".

Drug Behandeling van cellen en RNA-extractie

Voor demethylering studies werden de cellen dagelijks behandeld met 5 umol /l 5-aza-CDR (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) gedurende 72 uur. Ook behandelde cellen met 0,3 umol /l TSA alleen en een combinatie van 0,2 umol /l 5-aza-CdR en TSA. Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) of een miRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Duitsland).

Kwantitatieve real-time reverse transcriptie-polymerase kettingreactie

real-time reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (RT-PCR) analyses gebruikten een StepOne real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) uitgevoerd, EagleTaq Master Mix met ROX (Roche, Mannheim, Duitsland), een Taqman Reverse Transcription kit (Applied Biosystems) en TaqMan miRNA assays (Applied Biosystems) volgens de instructies van de fabrikant. De expressieniveaus van miRNA werden berekend op basis van de hoeveelheid doel-miRNA opzichte van die van RNU6B als een controle om de eerste ingang van totaal RNA normaliseren.

methyleringsanalyse

bisulfiet behandeling van DNA werd uitgevoerd met Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). Methylatie-specifieke polymerase kettingreactie (MSP) analyses werden uitgevoerd zoals eerder [26] beschreven. De primer sequenties en PCR product zijn aangegeven in tabel S3.

Synthetic miRNA Transfectie

KATO III en AGS cellen werden getransfecteerd met een voorlopermolecuul nabootsen miR-224, -452, -340 of -181c of gecodeerde sequentie miRNA (Sigma) tot een eindconcentratie van 25-50 nmol /l te geven met behulp van een electroporator, Neon (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Bij 24-72 h na transfectie werden cellen geoogst voor RT-PCR of Western blot-analyse.

Cell Proliferation Assay

miR-mimic getransfecteerde KATO III en AGS cellen werden uitgeplaat bij 1 x 10 ^{3 of 1 x 10 4 cellen per putje op 96-putjesplaten. Celproliferatie werd geëvalueerd op dag 1-4 na transfectie door bepaling van het aantal cellen met celproliferatie reagens WST-8 (DOJINDO Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japan), volgens de instructies van de fabrikant.}

miRNA Target Voorspelling en Western Blotting

De voorspelde doelstellingen van miRNAs en hun doelgroep sites werden geanalyseerd met behulp van TargetScan. Het mRNA expressieniveaus van de voorspelde doelen in tijdelijk getransfecteerde cellen werden 24 uur na transfectie geanalyseerd door RT-PCR. Western blot analyses werden uitgevoerd zoals eerder [26] beschreven. Het primaire antilichaam gebruikt werd konijnen anti-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). We gebruikten muizen anti-α-tubuline (1:1000, sc-8085, Santa Cruz Biotechnology) als een interne controle voor Western blotting. De secundaire antilichamen werden gebruikt alkalische fosfatase geconjugeerd anti-konijn IgG en anti-muis IgG (1:2000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Blots werden ontwikkeld met ImmunoStar AP Substrate (Bio-Rad Laboratories).

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Schematische weergave van de COPZ2
gebied dat miR-152. Gevulde dozen vertegenwoordigen de exons van de COPZ2 Hotels A en een lege doos duidt de onvertaalde regio COPZ2
. Een gebogen pijl geeft de transcriptie startplaats van de COPZ2
. Een verticale pijl geeft de locatie van miR-152. Verticale lijnen geven CpG sites. Pijlpunten geven de onderzochte voor MSP's
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s001
(TIFF)
Figuur S2.
Effecten van transfectie van miR-224 en -452 in KATO III cellen. RT-PCR analyses na transfectie met miR-224 en /of -452. De expressie van de doelgenen werd later geanalyseerd 48 door RT-PCR. miR-224 en -452 specifiek down-gereguleerd DPYSL2 Kopen en KRAS
, maar geen andere vijf genen onderzocht, die in overeenstemming zijn met de resultaten van de database-analyse (figuur 3) zijn.
doi: 10.1371 /journal.pone.0062589.s002
(TIFF)
Tabel S1.
Expressie profilering van humane miRNAs in KATO III cellen na 5-aza-CdR behandeling
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s003
(XLSX)
tabel S2. Nederlands Lijst van doelgenen waarvan we expressie door RT-PCR onderzocht na behandeling met of zonder 5-aza-CdR en transfectie met 20 nmol /l siDICER1 of scrambled siRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone .0062589.s004
(XLSX)
tabel S3.
sequenties van primers die in deze studie
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s005
(XLSX)

Dankwoord

We willen bedanken Dr. Bert Vogelstein voor het verstrekken van de DICER1 knock-out HCT116 cellijn.

• PLoS ONE: hypoxie Stimuleert de EMT van maagkanker cellen door Autocrine TGF Signaling
• PLoS ONE: Flotillin2 Expression correleert met HER2 Levels en een slechte prognose in Gastric Cancer