Ploche ONE: Podocalyxin ako prognostický marker u rakoviny žalúdka

abstraktné

Pozadie

Podocalyxin-like 1 (PODXL) je bunkovou adhézny glykoproteín spojený s agresívnym nádoru fenotypu a zlou prognózou v niekoľkých formách rakoviny. Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať PODXL expresie v karcinómu žalúdka za použitia dvoch rôznych protilátok.

Methods

tumor-mikroskopických sústav tkanív a imunohistochemicky sme hodnotili PODXL expresie v nádorových vzorkách z 337 pacientov ktorí podstúpili chirurgický zákrok na adenokarcinómom žalúdka v Helsinkách fakultnej nemocnice. Použili sme dve rôzne protilátky :. HPA2110, čo je polyklonálne protilátky a in-house monoklonálnu protilátku zvanú HES9, aby zistil pridružení PODXL výrazu s patologickým premenných a prežitie pacienta

Výsledky

PODXL farbenie bol pozitívny polyklonálnou protilátkou 153 (57,5%) prípadov, a monoklonálne protilátky v 212 (76%). Polyklonálne protilátky expresia bola spojená s typom rakoviny čriev (p 0,001). farbenie monoklonálna protilátka bola spojená s vekom nad 66 (p = 0,001), rakovina čriev (p 0,001), a s malou veľkosť nádoru (≤ 5 cm; p = 0,024). Obe protilátky boli spojené s vysokým S-fázy frakcie (p = 0,022; p = 0,010), a proliferácia vysoký index tumor (Ki-67; p = 0,003; p = 0,001). PODXL pozitivita podľa polyklonálnou protilátkou udávaná znížená 5-ročné prežitie žalúdočné karcinóm špecifického o 24,0% (95% CI 16,9-31,1), v porovnaní s 43,3% (95% CI 33,7-52,9) pre pacientov s PODXL negativity (p = 0,001 ). Výsledok zostal významný v multivariable analýze. (HR = 3,17, 95% CI 1,37-7,34, p = 0,007)

Záver

V prípade rakoviny žalúdka, PODXL expresie polyklonálne protilátky HPA2110 je nezávislý marker zlú prognózu

Citácia :. Laitinen A, Böckelman C, Hagström J, Kokkola A, C Fermer, Nilsson o, et al. (2015) Podocalyxin ako prognostický marker v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 10 (12): e0145079. doi: 10,1371 /journal.pone.0145079

Strih: Yves St-Pierre, INRS, Kanada

prijatá: 15. septembra 2015; Prijaté: 29.listopadu 2015; Uverejnené: 16 decembra 2015

Copyright: © 2015 Laitinen et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje sú v novinách

Financovanie :. Táto štúdia bola podporená dotácií z Fínska Läkaresällskapet, Kurt och Doris Palander nadácie, Sigrid Jusélius Foundation a medicínska understödsföreningen Liv och Hälsa. Fujirebio Diagnostics AB a Onson Consulting poskytol podporu vo forme platov pre autorov CF a ďalej, ale nemal žiadnu ďalšiu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie zverejniť alebo prípravu rukopisu.

konkurenčné záujmy :. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

v posledných desaťročiach sa výskyt rakoviny žalúdka klesla, a to najmä v západných krajinách, zrejme vzhľadom k klesajúci výskyt Helicobacter pylori
k lepšiu hygienu a menej zaplnené bývania. Vzhľadom k tomu, rakovina žalúdka má zlú prognózu, že je stále ešte celosvetovo druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenia [1]. Miera prežitia 5 rokov, a to napriek liečebnom chirurgickom zákroku, je len asi 10 až 30% [2]. Vysoká úmrtnosť je väčšinou kvôli neskorej diagnóze.

UICC Tumor Node metastázy (TNM) klasifikácia je zďaleka najviac konzistentné prognostického klasifikačného systému dnes. Avšak, dokonca v rovnakých nádorov skupinovej fáze, priebeh choroby môže líšiť. Vytvorenie metód pre presnejšie vyhodnotenie neoplázia agresivity by bol užitočný pri vyhodnocovaní prognózu jednotlivých pacientov s rakovinou žalúdka.

Podocalyxin-like 1 (PODXL) je anti-adhezívne transmembránový glykoproteín patriaci do rodiny CD34 , To je vyjadrené normálne obličkovými podocytů [3], krvotvorných progenitorových buniek [4], vaskulárne endotelu [5], a prsné epiteliálne bunky [6].

Klinický význam PODXL v progresii rakoviny bol skúmaný v rôzne typy karcinóm, najprv ako markeru kmeňových buniek u rakoviny semenníkov [7]. Neskoršie zistením je, že tumor-bunky a špecifické PODXL expresie je spojená s agresívnejším fenotypom a výskytom nežiaducich účinkov v niekoľkých typov rakoviny, napríklad v prsníku [6], prostaty [8], vaječníkov [9], kolorektálny [10- 12], uroteliální močového mechúra [13], pankreasu [14], a rakovina periampullary [15].

Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať PODXL expresiu v karcinómu žalúdka odhaliť jeho možná úloha pri agresivity a prognózou. Rozhodli sme sa použiť dve PODXL protilátky sa uznáva, rôzne epitopy: monoklonálne in-house HES9 protilátky a komerčne dostupná polyklonálne HPA2110 protilátok. Nedávno sme zistili, že tieto dve protilátky sú nezávislé markery zlou prognózou u rakoviny hrubého čreva [12]. Tieto dve protilátky môžu rozoznať dve skupiny pacientov s kolorektálnym karcinómom, obaja koho majú zlú prognózu; Kombinované použitie týchto protilátok odhalilo skupine pacientov s ešte horšie prognózou [16].

materiáloch a metódach

Pacienti

Do štúdie bolo zaradených 337 po sebe idúcich pacientov, ktorí podstúpili chirurgický zákrok pre histologicky overené žalúdočné adenokarcinóm na oddelení chirurgie, Helsinki University Hospital, od roku 1983 do roku 1999. vyšetrovacie metódy podľa klasifikácie UICC za predpokladu, 100 (29,7%) fáza IA-IB, 41 (12,2%) fázy II, 96 (28,5%) štádium IIIA-IIIB, a 100 (29,7%) štádium IV pacientov. Lymfatických uzlín sa vyskytli u 184 (55%) a vzdialené metastázy v 93 (28%) prípadoch. Stredný vek bol 66 rokov (rozmedzie 30-87) a 163 (48%) boli ženy a 174 (52%) mužov. Úplné alebo čiastočné gastrektómii s rozšíreným (D2-D2 +) lymfadenektómia bola vykonaná u 34 (10%) pacientov, totálnej gastrektómii s D1-lymfadenektómia v 161 (48%), a medzisúčtu gastrektómii s D1-lymfadenektómia v 142 (42%). Celkom 143 (43%) pacientov bolo operovaných s liečivým zámerom, zatiaľ čo 176 (52%) podstúpilo paliatívnej chirurgický zákrok. Žiadne získal neoadjuvantná liečbu, ale 32 (9%) pacientov dostávalo pooperačné adjuvantnú liečbu (28 chemoterapia, rádioterapia 2; 2 dostala oboje). Prežitie dáta a príčinou úmrtia až do novembra 2013 prišiel zo záznamov o pacientoch, o evidencii obyvateľov centrum Fínska a Fínsky štatistický úrad.

Štúdia bola schválená etickou komisiou chirurgickej Helsinki University Hospital (HUS Dnro 226 /E6 /06, rozšírenie TMK02 § 66 17.4.2013) a Národný úrad pre dohľad nad sociálnych vecí a zdravia vydal súhlas s použitím vzoriek tkaniva bez individuálneho súhlasu v tejto retrospektívnej štúdii (Valvira Dnro 10041 /06.01.03.01 /2012).

tkanivové vzorky

formalínu fixované a vzorky parafínu zaliate chirurgické tkaniva pochádzala z archívu Ústavu patológie. Tkanivá pacientov boli de-identifikovať a analyzovať anonymne. Histopatologicky boli definované a označené na haematoxylin- a eosínu-nafarbená reprezentatívne oblasti nádorových vzoriek. Tri vzorky z každého nádoru bloku boli odobraté vzorky s 0,6 mm punchers a vložené v novom parafínového bloku poloautomatickým microarrayer tkaniva (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, USA). Zo šiestich tkanív poľa blokov pripravených, z ktorých každý obsahoval 24-192 nádorových vzoriek. Úseky 4 um každého boli rozrezané a spracované pre imunohistochémia.

Protilátky

Porovnávali sme dva PODXL protilátky proti rôznym epitopom. Polyklonálne protilátka (HPA2110, Atlas Antibodies, Štokholm, Švédsko) bola zvýšená proti peptidu so zvyškami aminokyselín 278-415 z PODXL, a monoklonálne protilátky in-house HES9 [12] uznáva, aminokyselinové zvyšky 189 až 192 zo PODXL , Oba epitopy sa vyskytujú v extracelulárnej časti molekuly PODXL. Epitop sekvencie HPA2110 zodpovedá tri proteínové varianty zostrihu kódovanie PODXL so 100% (PODXL 001, 005, a 201, ľudským proteínom Atlas). Štvrtá varianta zostrihu zodpovedá 87% (PODXL 202). Epitop sekvencie HES9 zodpovedá 100% u všetkých variantov zostrihu. Protilátky sú podrobne popísané v [12,17,18].

Imunohistochémia

Rezy boli fixované na sklíčka a sušia sa počas 12 až 24 hodín pri teplote 37 ° C, potom boli zbavené parafínu v xylénu a rehydratovaný cez postupné znižovanie koncentrácie etanolu do destilovanej vody. Pre získanie antigénu, rezy boli spracované v predbežnej úpravy modul (Lab Vision Corp., Fremont, CA, USA) v pufri Tris-HCl (pH 8,5) počas 20 minút pri 98 ° C. Rezy boli zafarbené v Autostainer 480 (Lab Vision) v systéme Dako REAL envision Detection peroxidáze /DAB +, králik /myš (Dako, Glostrup, Dánsko). Sklíčka boli liečení po dobu 5 minút s 0,3% Dako REAL peroxidázu blokujúcim roztoku na blokovanie endogénnej peroxidázy. Následne boli rezy inkubované po dobu 1 hodiny s polyklonálnou (riedenie 1: 250 = 2,5 ug /ml), alebo monoklonálnou protilátkou (riedenie 1: 500 = 5 ug /ml) pri teplote miestnosti. Ako pozitívna kontrola pre každú sériu farbenie bol použitý vzoriek z tkaniva obličiek.

Scoring imunoreaktivity

HPA2110 a HES9 immunopositivity bola upravovaná vo všetkých dostupných nádorových jadra. Cytoplazmatický PODXL a HES9 immunopositivity bola hodnotená ako 0 až 3 na základe intenzity rakovinových buniek imunoreaktivity, a najvyššie skóre z troch jadier slúžil pre ďalšiu analýzu. Negatívne imunoreaktivita bola hodnotená ako 0, difúzna slabú cytoplazmatickú pozitivitu ako 1, mierne pozitívny alebo fokálne silne pozitívne intenzita ako 2 a homogénne silnej intenzity as 3. Všetky vzorky boli hodnotené nezávisle na sebe dva výskumníkov (AL a JH) nepoznali klinického stavu a výsledkoch údaje. Vzorky s nesúhlasných skóre boli prehodnotené a konsenzus skóre slúžil pre ďalšiu analýzu. Boli sme schopní spracovať a skóre HPA2110 farbenie na 266 a HES9 farbenie vo 279 vzorkách.

Štatistická analýza

asociáciou medzi HPA2110 a HES9 pozitivity a patologickým premennými boli hodnotené pomocou testu chí-kvadrát alebo Fisherov presný test. Korelácia medzi týmito dvoma podocalyxin protilátky boli hodnotené pomocou porovnávacej skúškou Spearman. prežitie špecifické pre ochorenie bola vypočítaná od dátumu operácie do úmrtia na rakovinu žalúdka.

Krivky prežitia boli konštruované podľa metódy Kaplan-Meier a v porovnaní s Logrankova testu. Pre univariable a viac premenných analýzy prežitia, Cox proporcionálne model riziká vstúpil do nasledujúcej premennej: vek, pohlavie, štádium, grade, Laurens klasifikácia, veľkosť nádoru, lokalizácia nádoru, PODXL výraz stanovený HPA2110 farbenie a farbenie HES9, DNA ploidii, S- fázy frakcie, Ki-67 expresie a p53. Stupeň, stupeň, Laurens klasifikácia, veľkosť nádoru, DNA ploidii, S-fáza frakcie, a expresie PODXL, HES9, Ki-67, a p53 boli zadané ako kategoriálních premenných. DNA ploidii a S-fázy frakcie bola hodnotená skôr prietokovou cytometriou, a p53, a Ki-67 expresie tkaniva imunohistochemicky [19,20]. P-hodnota menšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú. Všetky štatistické analýzy boli vykonané s IBM SPSS Statistics verzia 20.0 pre Mac (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Výsledky

Imunohistochémia

Cytoplasmic HPA2110 reaktivita, vyhodnotené 266 prípadov, bol negatívny v 113 (42,5%), slabo pozitívna v 120 (45,1%), mierne pozitívny v 29 (10,9%), a silne pozitívne na 4 (1,5%) prípadov. Zo 279 prípadov úspešne zafarbených pre cytoplazmatickú expresiu HES9, 67 (24,0%) boli negatívne, 137 (49,1%) slabo pozitívna, 54 (19,4%) mierne pozitívny, a 21 (7,5%) silne pozitívne. V konečnom dôsledku slabej silne pozitívne HPA2110 a HES9 imunoreaktivity (skóre 1-3) bol považovaný za pozitívny výraz. Reprezentatívne obrazy immunostainings sú na obrázku 1. Oba HPA2110 a HES9 morený rovnomerne cytoplazmy, jadrovú ani bunkové membranózna immunopositivity znateľné. Cytoplazmatická expresia podocalyxin od dvoch rôznych protilátok HPA2110 a HES9 korelované (r _{s = 0,455, p < 0001, Spearmanův pozičné korelačný test).}

Združenie HPA2110 a HES-9 s klinicko-premenných a biomarkery

združenia HPA2110 a HES9 s klinicko-premenných a molekulárnych biomarkerov boli nasledovné: pozitívny (skóre 1-3) HPA2110 farbenie bolo v súvislosti s typom rakoviny čriev (p 0,001), pozitívny HES9 farbenie bolo spojené s vek nad 66 (p = 0,001), rakovina čriev (p 0,001), a s malým (≤ 5 cm) veľkosti nádoru (p = 0,024). Ako HPA2110 a HES9 boli spojené s vysokým S-fázy frakcie (SPF, p = 0,022; p = 0,010) a vysokej proliferácie index nádoru (Ki-67, p = 0,003; p = 0,001) (tabuľka 1 a 2).

Survival analýzy

Pozitívna HPA2110 výraz naznačoval karcinóm špecifického žalúdočné 5-ročné prežitie 24% (95% CI 16,9-31,1) v porovnaní s pacientmi s negatívnym HPA2110 farbenie s 5-ročné prežitia 43% (95% CI 33,7-52,9) (p = 0,001 log-rank test) (obr 2 a tabuľka 3). Rakovina žalúdka špecifické 5-ročné prežitie u pacientov s HES9-pozitívne farbenie nádoru bola 30% (95% CI 23,1-36,1), a pre tých, ktorí s negatívnym farbením, 40% (95% CI 27,7-52,1; p = 0,130 log -Rank test) (obr.2).

v analýze podskupín, HPA2110 bol významný marker zlou prognózou u skupiny mladších pacientov (vo veku pod 66 rokov) (p = 0,006) a pre mužské pohlavie (p = 0,002), rakovina difúzna-type (p = 0,001), a štádium aj pacienti (p = 0,048) (obr 3 a tabuľka 3). V ostatných podskupín študovali, HPA2110 nemal slúžiť ako prognostický marker

Výraz HPA2110 zostal významný v multivariable analýze. (HR = 3,17, 95% CI 1,37 až 7,34; p = 0,007; Tabuľka 4). Iné nezávislé prognostické faktory multivariable analýzy boli štádium, grade a DNA ploidii.

Diskusia

Máme tu ukazujú, že rakovina špecifické 5-ročné prežitie bolo signifikantne lepšie u pacientov s karcinómom žalúdka, ktoré majú PODXL -negativní nádor. V skutočnosti, medzi stupňami 1 u pacientov s PODXL-negatívnymi nádormi, len jeden pacient zomrel na rakovinu. Vo viac premenných analýze, pozitívne expresie PODXL slúžil ako nezávislý marker zlou prognózou. Pozitívne PODXL expresie ako polyklonálne HPA2110 protilátok a monoklonálne protilátky HES9 bola spojená s vysokým SPF prietokovou cytometriou a Ki-67 farbenie, pričom oba rozmery sú markery vysokej proliferácie rakovinových buniek, a teda horšie prognózou.

pozitívne expresia PODXL oboch protilátok bolo spojené s typom rakoviny čriev, ale PODXL-negatívne nádor ukázalo nebyť prognostický marker rakoviny čriev. Naopak, karcinóm špecifické 5-ročné prežitie v podskupine difúzneho typu rakoviny bol výrazne horší u pacientov s nádorom je PODXL-pozitívny. Všeobecne platí, že difúzna rakovina typ bol spájaný s horšou prognózou než má črevnú typu [21].

Podľa nášho najlepšieho vedomia, sme prvý nahlásiť prognostickú hodnotu pre PODXL u karcinómu žalúdka. Toto bolo evidentné pre niekoľko ďalších typov rakoviny, ako prsníka [6], prostaty [8], vaječníkov [9], kolorektálneho [10-12], uroteliální močového mechúra [13], pankreasu [14], a rakovina periampullary [15] , Štúdia o kolorektálneho karcinómu ukazujú súlad medzi primárnymi nádormi a zodpovedajúcich lymfatických uzlín u jednotlivých pacientov a PODXL prejave takisto zostáva nedotknutá neoadjuvantnej rádioterapiu. Tieto nálezy podporujú klinickú užitočnosť PODXL ako marker zlou prognózou [22]. Tu sme nemali študovať PODXL expresie v lymfatických uzlín u karcinómu žalúdka au žiadneho z pacientov v tejto kohorte dostala predoperačnej chemoterapie, aj keď je v súčasnosti skôr rutinou. Tieto účinky predoperačnej chemoterapie na PODXL expresie v karcinómu žalúdka potrebuje ďalšie hodnotenie.

sme použili dve protilátky rozpoznávajúci PODXL, komerčne dostupný polyklonálne protilátku HPA2110 a in-house monoklonálne protilátky HES9 [16]. Immunoexpression podľa HES9 monoklonálna protilátka bola silnejšia ako polyklonálnou protilátkou. Obe protilátky morený rovnomerne v cytoplazme, a ani zafarbia jadra ani bunkovú membránu. Rozmanitosť na farbenie intenzity a distribúcie bola slabšia pri použití polyklonálnej protilátky, takže bodovania ťažšie. V podstate PODXL je transmembránový molekula, a preto bolo prekvapujúce, aby ju na bunkovej membrány v žalúdku rakovinových bunkách buď protilátky. Význam cytoplazmatickej, non-membranózna, vyjadrenie PODXL, jej úloha a funkcie, je potrebné ďalšie hodnotenie.

Tieto rôzne protilátky, ktoré sme použili uznajú nerovnaké časti PODXL molekuly, pravdepodobne vysvetľuje, prečo ich expresie v niektorých vzorky sa líšili a výsledky nie sú totožné. Kaprije et al. [16], ktorý sa používa rovnaké protilátok u kolorektálneho karcinómu, a našiel zaujímavý rozdiel medzi týmito vzormi farbenie. Polyklonálne protilátka pozitivity bol na membráne [9,10], ale je monoklonálna protilátka pozitivity bol zjavný prevažne v cytoplazme. V kolorektálny karcinóm, silné pozitivity ako s monoklonálne a polyklonálne protilátky odhalili podskupinu pacientov s ešte horšie prežitie. Nenašli sme tento druh korelácia vo vzorkách s rakovinou žalúdka. Celkovo možno povedať, pozitivity medzi pacientmi s rakovinou žalúdka, bola nižšia ako u pacientov s rakovinou hrubého čreva. V kolorektálneho karcinómu boli asi 94% prípadov pozitívne na PODXL s týmito dvoma protilátkami, kým v žalúdku rakoviny pozitivity sa objavili v 76% prípadov s monoklonálnou protilátkou a v 58% s polyklonálnou protilátkou. Frekvencia PODXL pozitivity v karcinómu žalúdka bol blízky ako u rakoviny prsníka a vaječníkov (40% a 67%), [6,9].

PODXL je transmembránový glykoproteín. Bolo preukázané, že Mucíny, ktoré sú tiež glykoproteíny, hrajú úlohu v epiteliálnych na mezenchýme prechodu (EMT) [23,24]. Úloha PODXL rakoviny nie je známa, ale je možné špekulovať, že aj PODXL môže hrať úlohu v EMT. EMT môže vysvetľovať, prečo pacienti s vysokým PODXL expresiou majú horšie prežitie.

Silnou stránkou tejto štúdie je veľká kohorta pacient s rakovinou žalúdka a dlhú nadväzné kroky spoľahlivé klinické follow-up času a dáta o prežitie. Technikou TMA, len malé oblasti nádoru sa hodnotí v porovnaní s celok-tkanivových rezoch. V kolorektálny karcinóm, Larsson et al. [22] zistili, že použitie celých sekcií umožnila určiť väčší počet nádorov ako PODXL-pozitívne, než tomu bolo TMA analýzu. Vzhľadom k tomu, PODXL výraz je heterogénna, použitie techniky TMA môže viesť k podceneniu pozitívnych prípadov. Bodovanie ako monoklonálne protilátky-a prejavu polyklonálna protilátka bola u niektorých vzoriek ťažké; prípady sa len niekoľko rakovinových buniek a tie, v ktorých hodnota rakovinových buniek bolo neidentifikovateľné tak boli vylúčené z analýzy. To čiastočne vysvetľuje vysoký počet vylúčených prípadov. Na druhej strane, TMA technika umožňuje analýzu veľkých kohort pacientov s homogénnym spôsobu farbenia.

Na záver, PODXL imunologické slúži ako nezávislý marker zlou prognózou u rakoviny žalúdka. To znamená, že ak je nám známe, prvej správe o prognostickú hodnotu PODXL expresie v karcinómu žalúdka. Budúce štúdie by mali potvrdiť túto asociáciu a vyriešiť mechanizmus, ktorým PODXL ovplyvňuje rozvoj a správania rakoviny žalúdka.

Poďakovanie

Ďakujeme Päivi Peltokangas a Elina Aspiala za ich vynikajúce technickej pomoci.

• Druhy rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: DBGC: databázy žalúdka človeka Cancer