An dëser Etude getest mir de prevalence, histoanatomical Verdeelung a entholl biologescher Bedeitung vun der Wnt Zil- FAQ a Kriibs Stammzellenfuerschung Bewaacher LGR5 zu erhéijen vun der mënschlecher gastrointestinal TRACT. Ënnerscheed Ausdrock vun LGR5 war op transcriptional (real-Zäit polymerase Kette Reaktioun) an respektiv Niveau studéiert (immunohistochemistry) zu malignant an entspriechend Net-malignant Stoffer vun 127 Patienten mat sechs verschiddene Primärschoul entholl Siten, dh esophagus, Mo, Liewer, Bauchspaicheldrüs, Colon an rectum. D'clinico-agebousst Bedeitung vun LGR5 Ausdrock war zu 100 Patienten mat gastric carcinoma (GC) studéiert. Non-neoplastic Otemschwieregkeeten normalerweis just ganz wéineg Streeung LGR5 harbored Fro:. Simon E, Petke D, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) d'raimlech Verdeelung vun LGR5 Redakter: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung Arnaque: Juli 5, 2011; Akzeptéiert: 16. Mäerz 2012; Publizéiert: 18. Abrëll 2012 zu Copyright: © 2012 Simon et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung Funding:. Dës Auteuren hu keng Ënnerstëtzung oder Fonge fir Rapport VerfÜgung Wettsträit Interessen:.. d'Auteuren, datt keng Competitioun Interessen existéieren deklaréiert hunn VerfÜgung Gastrointestinal carcinomas ënnert déi gemeinsam malignancies ginn a si eng Virreiderroll Ursaach vum Kriibs Doud weltwäit [1], [2]. D'Grënn fir déi Aarm prognoses sinn komplex: vill Cancers vun der gastrointestinal TRACT sinn zu fortgeschratt Etappen festgestallte ausser curative Behandlung, do sinn keng verléisslech entholl lues déi fréi Diagnos oder Kontroll vun héich-Risiko Populatiounsschichte erlaben kann. Behandlung Optioune sinn an lokalen fortgeschratt a metastatic Krankheet limitéiert, an enger grousser Zuel vun erhéijen recur trotz initial therapeutesch Äntwert [3]. A putative Erklärung vun engem effikass Therapie ass d'Präsenz vun Kriibs Stammzellen (CSC). De CSC Hypothes z'intégréieren, entholl engem conglomerate vun heterogen Zell Populatiounen ass. Nëmmen e subpopulation vun dëser conglomerate ënnerhält de Méiglechen stoussen vun Amphipolis Opstellung, an dohier Terrain an metastatic verbreet. CSCs gi méi resistent Chimiotherapie goen, ze entholl Terrain Virwaat, Werdegang an schlussendlech Patient Doud [4], [5]. Während der CSC-Modell ëmmer akzeptéiert ass, Identifikatiouns- an Confirmatioun vum sougenannten Stammzellenfuerschung lues an déem Mënsch Otemschwieregkeeten ass schwéier a gréisstendeels vermësst. Kuerzem, déi leucine-räich, G-FAQ kräftegen receptor (GPCR) an Wnt Zil- Gentherapie LGR5 VerfÜgung als Roman Stammzellenfuerschung Bewaacher vun de klenge Daarm, Colon an an den Hoer follicles vun Mais identifizéiert war [6] . Ausdrock vun LGR5 zu Multiple aner Organer beweist, datt et eng global Bewaacher Erwuessen- Stammzellen vertriede kënnen. Allerdéngs ass, wéineg iwwert hiren Ausdrock an der hepato-gastrointestinal TRACT vu Mënschen bekannt. VerfÜgung An dëser Etude mir dës Schéier vun Informatiounen ze fëllen anzeschätzen a getest der Hypothes, datt de Kriibs Stammzellenfuerschung Bewaacher LGR5 huet prognostic an entholl biologesche Bedeitung. VerfÜgung Themen VerfÜgung Formalin-fix a paraffin-Ënnerbewosstsinn malignant an entspriechend Net-malignant Otemschwieregkeeten vu 127 Patienten sechs Präparaten Plaze vun der mat hepato-gastrointestinal TRACT (dh esophagus, Mo, Liewer, Bauchspaicheldrüs, Colon an rectum) sech aus den Archiver vun den Instituter vun wirklech vun den Christian-Albrechts-Universitéit Kiel an de Charité University Hospital Berlin (souwuel Däitschland) Sensor. (; Table 1 1995-2008) All Patienten goufen um entweder University Hospital Loutrengen-Holstein (1997-2009) oder Charité University Hospital Berlin verdanken. Unfixed, frësch gefruer Otemschwieregkeeten war vun 105 vun deene Patienten mat aacht anere entholl Zorte, dh Barrett d'adenocarcinoma (9 Patienten) an squamous Zell carcinoma (7) vun der esophagus, intestinal (19) an diffusen (21) sinn gastric Kriibs Typ, adenocarcinoma vun de Colon (19) an rectum (20), hepatocellular carcinoma (HCC; 4), an cholangiocarcinoma (CC, 6). De Patient Charakteristiken sinn an Table 1. VerfÜgung Eng onofhängeg Serie vun 487 gastric Kriibs Patienten zesummegefaasst vum Archiv vum Institut wirklech vum Christian-Albrechts-Universitéit (Table 2 an Table 3) Sensor war. Dës Patienten déi entweder total oder partiell gastrectomy fir adenocarcinomas vun de Mo. oder oesophago-gastric menaarbecht weiderentwéckelt. All resection specimen Équipe vun trainéiert chirurgesch pathologists histological Ënnersichung weiderentwéckelt. D'Zäit vum Patient Doud war vum Epidemiological Cancer wäerten VerfÜgung vum Staat Loutrengen-Holstein, Däitschland kritt. Follow-up Donnéeë vu Patienten Liefzäite goufen aus Klinik records Sensor an duerch de Généraliste kontaktéiert. VerfÜgung IFLA- breakpoint VerfÜgung All Otemschwieregkeeten Echantillon waren als Deel vun enger diagnostic oder therapeutesch Agrëff kritt duerchgefouert der de Patient huet Awëllegung geschriwwen. Patienten Echantillon fir d'Etude stellt sech pseudonymized an analyséiert anonym, also keen eenzelne-wëssenschaftlech Donnéeë sinn an der Datebank Texter. D'Etude vun der lokal Ethik Comité vun der University Hospital zu Kiel an Däitschland abruecht huet (Refus. Zuel D 453/10). VerfÜgung Real-Zäit transcriptase polymerase Kette Reaktioun VerfÜgung ëmgedréint Total RNS war vom cultured Zellen an cryoconserved Stoffer mat mirVana miRNA Isolatioun Kit d'Ambion (Obwuel Biosystems, Darmstadt, Däitschland) vun engem DNase Behandlung duerno mat Turbo DNA-fräihänneg (Ambion). RNS Qualitéit huet an engem 1,5% agarose gelies évaluéieren. Fir cDNA Synthes, 2 μg vun insgesamt RNS war ëmgedréint ausserdeem benotzt Transcriptor Éischt Strand cDNA Synthes Kit (Roche kinnt, Mannheim, Däitschland). Gene-spezifesch primers sech Wierderbuch duerch Biomers.net (Ulm, Däitschland) (Table S1). Real-Zäit ëmgedréint transcriptase polymerase Kette Reaktioun (Real-Zäit RT-Hinnen alleguer) war de LightCyler® Hëllef duerchgefouert 480 Ämter Master (Roche) an der LightCycler® 480 System (Roche). De Komparativ CT Wäerter waren normalized fir datt vun dräi housekeeping Genen: Homo succinate dehydrogenase komplex, subunit A, flavoprotein (voll) (SDHA), Homo calpain 2 (CAPN2) VerfÜgung a Cyclophilin C ( CYCC) VerfÜgung. Nee Skelett Kontrollen (kee cDNA vun Hinnen alleguer) huet fir all Gentherapie Laf unspecific oder Frankräich amplification an primer dimerization z'entdecken. All Experimenter zu Retard gesuergt huet. VerfÜgung Generation an Offäll vun enger anti-LGR5-antibody VerfÜgung Polyclonal antisera sech géint d'carboxy-Uschloss Schwäif vun der mënschlecher LGR5 receptor entsteet. Kanéngercher sech mat dräi verschidden peptides vun der Identitéit vun SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (genannt Cterm) immunized, RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (genannt 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (genannt 12) vun Pineda-abservice (Berlin, Däitschland). Monospecific IgG war vun schnell FAQ flësseg chromatography mat ÄKTAprime ™ System (GE Gesondheetswiesen, Uppsala, Schweden) mat engem FAQ A-Kolonne (GE Gesondheetswiesen) sidd. Fir all Kierzunge gebueden, i.e. immunofluorescence, immunocytochemistry, westlech blot an immunohistochemistry, déi monospecific IgG-Ëmwandlung war Affinitéit sidd géint d'immunizing peptides vun der Pineda-abservice. Am Punkt blot an immunohistochemical Ënnersich analyséiert, d'monospecific IgG anti-LGR5-11b antibody ugewisen héich Affinitéit zesumme mat staarken a speziell immunostaining. Dofir, war dëst antibody uechter dëser Etude benotzt. D'ofbaubar an Spezifizitéit vun der monospecific antibody war déi westlech blot charakteriséiert; immunofluorescence an immunocytochemical assays. VerfÜgung Plasmid bauen VerfÜgung fir LGR5 Expression bauen war entsteet duerch d'ganzt coding Haaptrei vu mënschlechen LGR5 VerfÜgung (NM_003667.2) vun Hinnen alleguer (Table S1 hire ). (-) Zu subcloning vun den Kick ofgesprengt an den Ausdrock Vecteure pcDNA3.1 erliichtert, déi no primer enthale engem NheI Restriktioun Site adapter an de Géigendeel primer enthale engem BamHI Site an engem c-Myc Markéierung zu erfollegräich transfection z'iwwerpréiwen. Hinnen alleguer Fragmenter an der pcDNA3.1 (-) Ausdrock Vecteure sech getrennt mat NheI an BamHI virun ligation mat T4-Ligase (Roche) verdaut. D'plasmid war vun unzereegen mat NheI an BamHI an DNA sequencing Reaktioun: Super benotzt Abi PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready, Version 2.0 (PE Obwuel Biosystems, Langen, Däitschland). VerfÜgung Zell Kultur an transfection ubelaangt VerfÜgung de Mënsch gastric Kriibs Zell Linn MKN74 war vun der japanescher Gesondheet Science Research Ressourcen Bank (Rekorder, Japan), an MKN45 aus der däitscher Collection vun Microorganisms an Zell Kulturen (Braunschweig, Däitschland) kritt. HEK293 EBNA Zellen sech duerch Invitrogen (Karlsbad CA, USA) kaaft. D'Zellen sech am RPMI 1640 mëttlerer (MKN74, MKN45) oder Dulbecco d'geännert Eagle mëttlerer (HEK293) ergänzt mat 10% (MKN74, HEK293) oder 20% (MKN45) An et Bovine serum, 100 U /ML penicillin an 100 μg /ML ugebaut streptomycin (PAA Laboratoiren GmbH, Spectateure, Éisträich). DNA transfection vun HEK293 EBNA, MKN74 an MKN45 Zellen war mat Lipofectamine LTX reagent (Invitrogen) gemäss den Uweisunge vum Produzent. Kuerz, goufen Zellen zu sechs-gutt Placke cultured. Stabil transfection vun MKN74 an MKN45 mat Ausdrock plasmids Leeschtung war wéi virdru beschriwwen [7]. Fir flüchteg transfection vun HEK293 Zellen 1 μg plasmid DNA an 5 μl Lipofectamine LTX reagent sech zu 500 μl Dulbecco d'geännert Eagle mëttlerer ouni serum verdënntem, bzw.. No incubation fir 30 Minutte bei Raumtemperatur, war d'Mëschung zu HEK293 Zellen notéiert. Véierzeg-aacht Stonnen no transfection, goufen transfected Zellen gesammelt an RNS oder Proteinen huet isoléiert. Zellen mat der Vecteure pcDNA3.1 transfected (-) gehalen an untransfected Zellen als negativ Kontrollen VerfÜgung Immunofluorescence VerfÜgung Twenty-véier Stonnen no op CultureSlides (BD Biosciences, erembodegem, Belsch) Morden,. Zellen sech mat phosphate-gefiermt Salins gewäsch, an 7:3 acetone:methanol fix (20 Minutten, -20 ° C) an dono mat 0,1% Triton-X (5 Minutten, Raumtemperatur) permeabilized. Drënner waren dann mat c-Myc Maus monoclonal antibody (Clontech, Mountain View, CA, USA) iwwer Nuecht op 5 ° C an engem moist Chambre incubated, gefollegt vun engem Anti-Maus Alexa Fluor 555 conjugated Secondaire antibody (Invitrogen). Ze erkennen waren der erfollegräich transfection vun LGR5, Zellen incubated mat anti-LGR5-antibody gefollegt vun enger anti-Kanéngchen Secondaire antibody conjugated mat Alexa Fluor 488 (Invitrogen) all fir eng Stonn bei Raumtemperatur. Ënnerlooss vun der Primärschoul antibodies op LGR5 transfected HEK293 EBNA Zellen als negativ Kontroll zerwéiert. Opbau an counterstaining fäerdeg war mat VECTASHIELD Hard-Set och DAPI (Vecteure Laboratoiren, Inc., Burlingame, CA, USA). VerfÜgung Immunocytochemistry VerfÜgung Immunocytochemical staining op formalin-fix gesuergt huet, paraffin- MKN45 gastric Kriibs Zellen Ënnerbewosstsinn. Fir dësen Zweck, goufen MKN45 Zellen zu klenge agarose Glaspärelen Ënnerbewosstsinn wéi virdru beschriwwen [8]. Weider Veraarbechtung an immunostaining mat anti-LGR5-antibody (dilution 1:1000) war duerchgefouert no der immunohistochemical Analysë vun mënschlech Otemschwieregkeeten Rubriken (kuckt hei ënnendrënner). Ënnerlooss vun der Primärschoul antibody op LGR5 transfected MKN45 Zellen als negativ Kontroll zerwéiert, iwwerdeems d'Spezifizitéit vun Anti-LGR5-antibody staining vun incubating der antibody mat der immunizing erauszesichen peptide bestätegt gouf. VerfÜgung Western blotting VerfÜgung Protein lysates sech duerch incubating Mënsch gastric Otemschwieregkeeten an cultured gastric Zellen mat ProteoJET ™ Mammalian Zell Lysis Reagent (Fermentas, St. Leon-Schimmel, Däitschland) an protease inhibitor Cocktail (Komplett héich-gratis, Roche) kritt. Protein Echantillon waren am Laemmli Prellbock (60 mm Tris-HCl pH 6,8, 2% Natrium dodecyl sulphate, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol an 0,01% bromphenol blo) duerch Heizung bei 95 ° C fir zéng Minutten denaturated a sech dono iwwerlaascht op 4% zu 16,5% SDS polyacrylamide gels an visualized déi mat Coomassie blo staining. Der Trennung, Proteinen op unstained polyacrylamide gels sech zu engem nitrocellulose Membran (Amersham, Freiburg, Däitschland) transferéiert, immunoblotted mat der anti-LGR5-antibody (dilution 1:20,000) an eng Anti-β-actin-antibody (1:10,000; Klon AC-15, Fläch-Aldrich, St. Louis, MO, USA) Gläichbehandlung Luede Quantitéiten ze garantéieren. Membran gebonnen HRP Fortgeschratten Secondaire antibodies (DakoCytomation, Glostrup, Dänemark) sech duerch verstäerkte chemiluminescence mat der ECL System (Amersham) fonnt. Ënnerlooss vun der Primärschoul antibody als negativ Kontroll zerwéiert, iwwerdeems d'Spezifizitéit vun Anti-LGR5-antibody staining vun incubating der antibody mat der immunizing erauszesichen peptide bestätegt gouf. VerfÜgung Histologie VerfÜgung Fir histological gebueden, Otemschwieregkeeten Echantillon waren zu 10% neutraliséiert formalin an Ënnerbewosstsinn paraffin fest. Deparaffinized Rubriken benotzt hematoxylin an eosin (H & E) geschriwwen. Gastric carcinoma war no der DÉI Klassifikatioun séiert [9]. D'pTNM Etapp war no der 7 alles Ray Mikro vill Konstruktioun VerfÜgung Formalin-fix a paraffin-Ënnerbewosstsinn Otemschwieregkeeten Echantillon waren benotzt ze Otemschwieregkeeten Mikro flamenden Ofgrond produzéiert wéi virdru beschriwwen [11]. Véier gebraucht Rubriken vun der doraus entholl Otemschwieregkeeten Mikro vill Spär sech fir weider Analyse geschnidde. Erfollegräicht Transfert vun entholl Otemschwieregkeeten war microscopically mat H &confirméiert. E-Kierchefënster Rubriken VerfÜgung Immunohistochemistry VerfÜgung Fir immunohistochemistry, formalin-fix a paraffin-Ënnerbewosstsinn Rubriken sech benotzt. (1:200; Novocastra Laboratoiren Ltd, Newcastle, GB) Immunostaining war mat der anti-LGR5-antibody (dilution 1:1000), engem monoclonal antibody ausernee géint CD44 gemaacht a kommerziell polyclonal antibodies ausernee géint LGR5 (LGR5 Evaluatioun vun immunostaining VerfÜgung Immunostaining vun Net-neoplastic epithelium an entholl Zellen war vun der Kandidatur eng immunoreactivity ukomm System (es) Faarwen. Kuerz, dokumentéiert Kategorie Eng der Intensitéit vun immunostaining den 0 (keng immunostaining), 1 (schwaach), 2 (moderéiert), an 3 (staark). Kategorie B dokumentéiert de Prozentsaz vun immunoreactive Zellen als 0 (negativ), 1 (Fragmenter positive Zellen; ≤1%), 2 (2-10% positive Zellen), 3 (11-50%), 4 (51-80%) a 5 (> 80%). D'Aféierung vun der Kategorie A a B schéinen en es rangéiert vun 0 bis 8 fir all eenzelne Fall. D'distributional Ännerunge vun LGR5 statistique Analysë VerfÜgung statistique Analysë der PASW Statistics mat 18 gemaach goufen. statistesch Pak (SPSS Galaxy Chicago, IL, USA). Vergläicher tëschent Gruppe waren duerch benotzen vun Fisher d'exakt Test getest. Korrelatioun vun LGR5 Ausdrock bannent ee Grupp war vun Kendall d'tau_ Geleeënheet-Bestellung Korrelatioun etabléiert. Survival Kéiren sech mat der Kaplan-Meier Method an Oneenegkeet Iwwerliewe vun der Läschlëscht Geleeënheet Test évaluéieren Lahure. D'Bedeitung vun kennenzeléieren vun LGR5 Ausdrock am primäre erhéijen an entspriechend Net-malignant Otemschwieregkeeten war vun der Wilcoxon Test évaluéieren. Real-Zäit RT-Hinnen alleguer Donnéeën, déi mat enger vläit zwee-eesäitegen T-Test évaluéiert huet, krut logarithmized ongeféier normalerweis verdeelt Daten ze kréien. P-Wäerter &Si besteet;. 0,05 als statistesch relevant considéréiert goufen VerfÜgung LGR5-mRNA ass differentially zu hepato-gastrointestinal carcinomas ausgedréckt VerfÜgung LGR5 Berichter vun murine Stammzellen ausgedréckt huet vun der intestinal crypts [12] a war vun Colon Kriibs Zell Linnen [13] dacks overexpressed. Fir hiren Ausdrock an Net-neoplastic an neoplastic Mënsch Otemschwieregkeeten ermëttelen, évaluéiert mir de transcriptional Ausdrock vun LGR5 zu Mënsch Medeziner uplanzen komponéiert vun enger breeder Palett vun hepato-gastrointestinal carcinomas. Real-Zäit RT-Hinnen alleguer Analyse war op enger Serie vun 105 Patienten gemaach mat malignant an entspriechend Net-malignant Otemschwieregkeeten, aus de selwechte Patiente kritt, vun aacht verschiddene entholl Zorte: esophagus [Barrett d'adenocarcinomas (9 Patienten) an squamous Zell carcinomas ( 7)], Mo [intestinal (19) an diffusen Typ (21) gastric carcinomas], Liewer [HCCs (4), CCS (6)], Colon (19) an rectum (20; Table 1) VerfÜgung <. p> LGR5-mRNA war vill differentially zu adenocarcinomas vun der esophagus ausgedréckt (p = 0.007), Mo [intestinal Typ (p = 0.006) an diffusen Typ (p = 0.013)], Liewer [CCS (p = 0.022)], Colon (p &Si besteet; 0.001) souwéi rectum (p = 0.002) am Verglach mat de reagéiert Net-neoplastic Otemschwieregkeeten. . VerfÜgung A polyclonal anti-LGR5-; Allerdéngs war keen Ënnerscheed Ausdrock vun squamous Zell carcinomas vun der esophagus (p = 0.503) an HCCs Verglach mat den entspriechende Net-neoplastic Stoffer (Dorënner 1 p = 0.545) fonnt antibody bieden all Mënsch LGR5 transfected an HEK293 an MKN45 Zellen VerfÜgung weider fir d'histoanatomical Verdeelung vun LGR5 zu Mënsch Stoffer beschen an hir clinico-agebousst Bedeitung ze ermëttelen, eng LGR5-spezifesch antibody erwächt war, well déi kommerziell sinn antibodies gemaach net eis Fuerderungen (Dorënner 2A) treffen. Vir Kräiz ofbaubar vun der nei generéiert antibody mat de meeschte strukturell ähnlechen LGRs, LGR4 an LGR6, mir eng Rei Formatioun mat der National Center fir Déi Informatiounen VerfÜgung Formatioun Instrument am Viraus gesuergt (Donnéeën net gewisen). Nee Haaptrei homology war mat LGR4 oder LGR6 an der Regioun vun der LGR5 peptide fonnt mir fir immunization benotzt. Fir d'Auswiel vun enger ganz bestëmmter antibody géint LGR5, gekloonten voll Längt cDNA war an HEK293 EBNA Zellen transfected a wéi eng positiv Zil- leeschtungsfäeg immunofluorescence benotzt. D'LGR5 cDNA war direkt mat engem myc-epitope afp, déi d'Evaluatioun vun der transfection mat enger Anti-myc Markéierung antibody aktivéiert. Benotzt immunofluorescence, gouf vun der anti-myc Markéierung antibody obligatoresch no incubation fonnt mat LGR5 /HEK293 Zellen, mä net op eidel Vecteure-transfected Zellen (Vecteure /HEK293), untransfected HEK293 Zellen, oder zu den negativen Kontroll vun LGR5 /HEK293 Zellen incubated mat antibody der Mindeststeier amplaz vun der Primärschoul antibody. D'selwecht Resultat kritt huet, wou mir der anti-LGR5-antibody (Dorënner 3) benotzt, spezifesch Etikette vun LGR5 Musiktherapie-. VerfÜgung D'Spezifizitéit vun LGR5-immunolabelling war weider benotzt validéiert formalin-fix a paraffin-Ënnerbewosstsinn MKN45 gastric Kriibs Zellen. D'Zellen sech zu enger Art virbereet an Kierchefënster datt d'Ofwécklung vun de Medeziner Mënsch Otemschwieregkeeten uplanzen matt. Immunocytochemical Analysë op paraffin Rubriken e positive staining vun Anti-LGR5-antibody op MKN45 Zellen réischt stably transfected mat LGR5 cDNA (LGR5 /MKN45). Amplaz, eidel Vecteure-transfected MKN45 Zellen (Vecteure /MKN45), wéi och déi negativ Kontroll (ënnerlooss vun der Primärschoul antibody) an der peptide Kontroll (Précoce-incubation vun der antibody mat sengem immunizing erauszesichen peptide) vun LGR5 /MKN45 Zellen zougedréckt net bindend vun der antibody (Dorënner S1). VerfÜgung LGR5 FAQ ass déi anti-LGR5-antibody mënschlechen speziell fonnt transfected MKN74 Zellen VerfÜgung de Mënsch gastric Kriibs Zell Linnen MKN74, bekannt engem ze posses moderéiert LGR5-mRNA Ausdrock (Donnéeën net gewisen) a mënschlech net-neoplastic Mo héich LGR5 Ausdrock suer- (Dorënner 1) sech dëse Match gaangen der ofbaubar an Spezifizitéit vun der anti-LGR5-antibody op FAQ Niveau ze Markenzeeche. VerfÜgung am Südweste blot Analyse, war LGR5 FAQ speziell vun der monospecific anti-LGR5-antibody op engem dilution vun 1:20,000 unerkannt. Et identifizéiert ee Band mat enger visueller molekulare Gewiicht vun 100 kDa zu MKN74 Zell lysates (Dorënner 4), déi de molekulare Mass fir LGR5 FAQ berechent Mätscher. Am Géigesaz, war keng Band zu lysates vum Mënsch Net-neoplastic Mo. Otemschwieregkeeten fonnt, deen e Kräiz ofbaubar vun Anti-LGR5-antibody mat bewosst Proteinen domadder. An Linn mat mRNA Ausdrock Donnéeën, staark Ausdrock vun LGR5 FAQ war zu MKN74 Zellen stably transfected mat LGR5 cDNA, am Verglach zu MKN74 Kontroll Zellen transfected mat den eidelen Vecteure observéiert. LGR5 FAQ Ausdrock vun mënschlecher Net-neoplastic Mo. mucosa huet doriwwer eraus d'Detectioun Limite vun westlech blotting, keng Band ginn. Ënnerlooss vun der anti-LGR5-antibody oder virdrun incubation vun der antibody mat sengem immunizing peptide weist kee FAQ Bands erauszesichen, bzw.. Detektioun vum β-actin FAQ (ronn 43 kDa; Dorënner 4) fiert als Luede Kontroll a confirméiert Verdeelungsgerechtegkeet FAQ Quantitéiten an all Richtung VerfÜgung LGR5 ass ausgedréckt an Net-neoplastic an neoplastic Otemschwieregkeeten vun der hepato-gastrointestinal iwwerlaascht. TRACT VerfÜgung den Ausdrock an histoanatomical Verdeelung vun LGR5 Folleg vun immunohistochemistry an enger Serie vun 127 Otemschwieregkeeten drënner kritt aus entspriechend Net-neoplastic an neoplastic Otemschwieregkeeten vun der hepato-gastrointestinal TRACT, mat der esophagus (14 Patienten) studéiert huet, Mo. (32), Liewer (24), Bauchspaicheldrüs (17), Colon (20), an rectum (20; Table 1). Aus dëser Kohort neoplastic an entspriechend Net-neoplastic Otemschwieregkeeten Echantillon vun 105 Patienten goufen och op der transcriptional Niveau studéiert (cf. uewen). VerfÜgung LGR5 Ausdrock vun de globale Kohort an 65 Fäll positiv war (51%) vun all net-malignant Stoffer an 103 Fäll (81%) vun all Kriibs Stoffer. Lokalisatioun vun LGR5 Ausdrock war den haaptsächlech cytoplasmatic observéiert hierkommen, och e sporadesch Membran oder Kär Membran ënnermoolt Ausdrock opgetrueden. An LGR5-immunoreactivity war an all Otemschwieregkeeten Voleten, i.e. stroma Zellen, endothelial Zellen, Zellen an d'Net-neoplastic epithelium an zu Kriibs Zellen (Dorënner 5) fonnt. LGR5-immunoreactivity zu stroma Zellen war zu 49 (39%) vun all Net-malignant Stoffer an an 80 Fäll (63%) vun all Kriibs Stoffer observéiert. An endothelial immunoreactivity vun LGR5 war an 42 Fäll (33%) vun all Stoffer. VerfÜgung An d'Net-malignant epithelium observéiert, LGR5 normalerweis zu puer Fragmenter Zellen no de Keller Membran vun der gastric mucosal Eenheet fonnt huet, pancreatic Leitunge, an der colorectal crypts. LGR5 war net an der squamous epithelium vun der esophagus, intrahepatic Bile Leitunge, an hepatocytes (Dorënner 6) fonnt. Fir all Otemschwieregkeeten Zorte außer oesophageal Otemschwieregkeeten war d'mengen Wäert vun es vill méi héich fir entholl Otemschwieregkeeten relativ zu der stemmt Net-malignant Otemschwieregkeeten, eis Conclusiounen op der transcriptional Niveau confirméiert (Table 1). VerfÜgung LGR5 ass präsent an Fragmenter Zellen vun der normal gastric mucosa VerfÜgung d'Existenz vun multipotent Stammzellen am murine Mo. war vun clonal Marquage Studien bewisen. Der Frist Identifikatioun vun deenen Zellen dunn esou wäit der Bestellung fannen vu spezifesche endogenous lues Wéint [14]. Benotzt Serien Sektiounen aus enger Kopp resection specimen kritt, déi normalerweis fir d'Behandlung vun Iwwergewiicht kritt ass, an awer kee histological Beweiser vun gastric Kriibs oder chronesch gastritis, gesichte mir fir LGR5 LGR5 fonnt gëtt coexpressed mat anere Potential gastric Stammzellenfuerschung oder Grënner Zell lues VerfÜgung Stammzellefuerschung Zellen vun Net-neoplastic Otemschwieregkeeten an CSCs ginn normalerweis duerch d'Expressioun vun méi ewéi enger eenzeger Stammzellenfuerschung Tandel [15] identifizéiert a validéiert. Benotzt immunohistochemistry, mir analyséieren nächst der coexpression vun LGR5 mat anere putative CSC lues, i.e. ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 gouf ausgewielt, well virdrun Studien ADAM17 als putative Stammzellenfuerschung Bewaacher vun de Mo. identifizéiert [8]. Immunostaining (entweder duebel staining oder staining vun Serien Rubriken), war op engem gastric Kriibs specimen an op gesond uninflammed gastric mucosa vun Kopp gastrectomy kritt duerchgefouert. Am allgemengen awer nëmme wéineg Streeung Zellen positive immunostaining fir een an /oder déi aner putative Stammzellenfuerschung Bissau. Spannen, Luucht an d'Net-neoplastic gastric mucosa Zellen déi sinn all ADAM17 Musashi-1 (Msh-1) gouf als putative Stammzellenfuerschung Bewaacher geflitzt an der Maus Daarm beschriwwen. a mënschlech Mo [18], [22] an esou enger CSC Bewaacher geflitzt an erhéijen [23]. An neoplastic an Net-neoplastic gastric Otemschwieregkeeten positive Kierchefënster Zellen besteet, mèi vun Msh-1 D'raimlech Verdeelung vun LGR5 d'mi Ännerungen am gastric mucosa datt d'Entwécklung vun invasiv Kriibs marschéiert sinn wéi de "precancerous CASCADE" bekannt, déi éischt an 1975 beschriwwen, wou normal gastric mucosa vun chronescher atrophic gastritis transforméiert ginn ass a sech entwéckelt multifocal atrophy an intestinal metaplasia, gefollegt vun den Optrëtt vun dysplasia an endlech invasiv carcinoma [25]. Next getest mir d'Hypothes, datt d'CSSF histopathological Ännerunge vun de Mo. mucosa mat engem reallocation vun der LGR5 Den Ausdrock vun LGR5 zu intestinal Typ gastric Kriibs deemolegt Weltbild mat Wuesstem lokal entholl an nodal verbreet VerfÜgung Et ass postulated datt CSC Afloss Patient hätt duerch hir Fäegkeet entholl zu Form Kolonien Zell, eng onverzichtbar Pre-requisite fir metastatic verbreet a Krankheet Terrain. Fir weider d'Bedeitung vun LGR5 fir gastric Kriibs beschen, soll mir den Ausdrock vun LGR5 zu intestinal Typ gastric Kriibs mat verschiddenen clinico-agebousst Patient Charakteristiken.
Aféierung VerfÜgung
spontan a Methode VerfÜgung
Resultater VerfÜgung