PLoS ONE: den rumlige fordeling af LGR5 + celler korrelerer med Gastric Cancer Progression

Abstrakt

I denne undersøgelse testede vi forekomsten, histoanatomical distribution og tumor biologisk betydning af Wnt target protein og cancer stamceller markør LGR5 i tumorer i fordøjelsessystemet. Differentiel ekspression af LGR5 blev undersøgt på transkriptionel (real-time polymerasekædereaktion) og translationel niveau (immunhistokemi) i maligne og tilsvarende ikke-maligne væv af 127 patienter, der omfatter seks forskellige primære tumor sites, dvs. spiserør, mavesæk, lever, bugspytkirtel, kolon og rectum. Den klinisk-patologisk betydning LGR5 udtryk blev undersøgt i 100 patienter med gastrisk karcinom (GC). Ikke-neoplastisk væv normalt nærede kun meget få spredte LGR5 ^{+ celler. De tilsvarende carcinomer i esophagus, mave, lever, bugspytkirtel, tyktarm og endetarm viste signifikant flere LGR5 + celler såvel som signifikant højere niveauer af LGR5-mRNA sammenlignet med den tilsvarende ikke-neoplastisk væv. Dobbelt farvning eksperimenter afslørede en coekspression af LGR5 med de formodede stamcelle markører CD44, Musashi-1 og ADAM17. Næste testede vi den hypotese, at de sekventielle ændringer i gastrisk carcinogenese, dvs. kronisk atrofisk gastritis, intestinal metaplasi og invasive carcinom, er forbundet med en omfordeling af LGR5 + -celler. Interessant, den rumlige fordeling af LGR5 ændret: i ikke-neoplastisk maveslimhinden, LGR5 + celler blev fundet overvejende slimhinderne hals regionen; i intestinal metaplasi LGR5 + -celler blev lokaliseret ved krypten base, og i GC LGR5 + celler var til stede på den luminale overflade, tumor center og invasionen front. Ekspressionen af ​​LGR5 i tumoren center og invasion foran GC korrelerede signifikant med den lokale tumorvækst (T-kategori) og nodal spredning (N-kategori). Desuden patienter med LGR5 + GC'ers havde en kortere median overlevelse (28,0 ± 8,6 måneder) end patienter med LGR5 - GCS (54,5 ± 6,3 måneder). Vores resultater viser, at LGR5 differentielt udtrykkes i gastrointestinale kræftformer, og at den rumlige histoanatomical fordeling af LGR5 + celler har skal overvejes, når der søges deres tumor biologisk betydning}

Henvisning:. Simon E, Petke D, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert M et al. (2012) den rumlige fordeling af LGR5 ^{+ Celler korrelerer med Gastric Cancer Progression. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10,1371 /journal.pone.0035486}

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: Juli 5, 2011; Accepteret: 16 marts 2012; Udgivet: 18 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Simon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mave carcinomer er blandt de mest almindelige maligne lidelser og er en førende årsag til kræft død på verdensplan [1], [2]. Årsagerne til de fattige prognoser er komplekse: mange kræft i mave-tarmkanalen er diagnosticeret i fremskredne stadier eksklusive helbredende behandling, er der ingen pålidelige tumormarkører, som kan tillade tidlig diagnose eller screening af højrisikogrupper. Behandlingsmuligheder er begrænset i lokal avanceret og metastatisk sygdom, og et betydeligt antal af tumorer gentage sig trods indledende terapeutisk respons [3]. En formodet forklaringen til en ineffektiv behandling er tilstedeværelsen af ​​cancer stamceller (CSC). CSC hypotese postulerer, at en tumor er et konglomerat af heterogene cellepopulationer. Kun en subpopulation af denne konglomerat opretholder evnen til kolonidannelse, og dermed fornyet og metastatisk spredning. CSCS er mere resistente over for kemoterapi, hvilket fører til tumor tilbagefald, progression og i sidste ende patienten dør [4], [5]. Mens CSC-modellen i stigende grad accepteret, identifikation og bekræftelse af såkaldte stamcellemarkører i nativt humant væv er vanskeligt og stort set mangler. For nylig har leucin-rige, G-protein-koblet receptor (GPCR) og Wnt-målgen LGR5
blev identificeret som en ny stamcellemarkør af tyndtarmen, tyktarmen og i hårsækkene af mus [6] . Ekspression af LGR5 i multiple andre organer indikerer, at det kan repræsentere et globalt markør af voksne stamceller. Men lidt om sit udtryk i lever-mave-tarmkanalen hos mennesker.

I dette studie vi havde til formål at udfylde dette hul af information og testet den hypotese, at kræft stamceller markør LGR5 har prognostisk og tumor biologisk betydning.

Materialer og metoder

emner

formalin-fikseret og paraffin-indstøbt maligne og tilsvarende ikke-maligne væv fra 127 patienter, der omfatter seks anatomiske placeringer af lever-mave tarmkanalen (dvs. spiserør, mave, lever, bugspytkirtel, tyktarm og endetarm) blev hentet fra arkiverne af Institutes of Patologi af den kristelig-Albrechts-Universitet Kiel og Charité University Hospital Berlin (begge Tyskland). Alle patienter blev opereret på enten Universitetshospital Schleswig-Holstein (1997-2009) eller Charité University Hospital Berlin (1995-2008; tabel 1). Fastbundet Frisk frosset væv var tilgængelig fra 105 af disse patienter med otte forskellige tumortyper, dvs. Barretts adenocarcinoma (9 patienter) og pladecellecarcinom (7) af spiserøret, intestinal (19) og diffus (21) type gastrisk cancer, adenocarcinom af colon (19) og rectum (20), hepatocellulært carcinom (HCC, 4), og cholangiocarcinom (CC; 6). De patientkarakteristika er opsummeret i tabel 1.

En uafhængig serie af 487 mavecancerpatienter blev hentet fra arkivet af Patologisk Institut for den kristelig-Albrechts-Universitetet (tabel 2 og tabel 3). Disse patienter havde gennemgået enten hel eller delvis gastrektomi for adenokarcinomer i maven eller oesophago-gastrisk krydset. Hver resektion eksemplar havde gennemgået histologisk undersøgelse af uddannede kirurgiske patologer. Tidspunktet for patientens død blev opnået fra Epidemiologisk Cancerregister
af staten Schleswig-Holstein, Tyskland. Opfølgende data for patienter stadig er i live, blev hentet fra sygehusjournaler og ved at kontakte de praktiserende læger.

Etik Statement

Alle vævsprøver blev opnået som en del af en diagnostisk eller terapeutisk kirurgi udføres efter patienten gav skriftligt informeret samtykke. Patienter, der tilbyder prøver til undersøgelsen blev pseudonymiserede og analyseret anonymt, så ingen individuelle-relaterede data i databasen. Undersøgelsen blev godkendt af de lokale etiske komité af Universitetshospitalet i Kiel, Tyskland (ref. Nummer D 453/10).

Real-time reverse transkriptase polymerasekædereaktion

Total RNA var isoleret fra dyrkede celler og væv under anvendelse cryoconserved Ambion s Mirvana miRNA Isolation kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) efterfulgt af en DNase-behandling med Turbo DNA-free kit (Ambion). RNA kvalitet blev vurderet i en 1,5% agarosegel. Til cDNA-syntese, 2 ug totalt RNA revers transkriberet under anvendelse Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Genspecifikke primere blev syntetiseret af Biomers.net (Ulm, Tyskland) (tabel S1). Real-time reverse transcriptase polymerase kædereaktion (real-time RT-PCR) blev udført ved anvendelse af LightCyler® 480 Probes Master (Roche) og LightCycler® 480 System (Roche). Sammenligningstallene Ct-værdier blev normaliseret til den for tre husholdning gener: Homo sapiens succinatdehydrogenase kompleks, underenhed A, flavoprotein (Fp) (SDHA), Homo sapiens calpain 2 (CAPN2)
og cyclophilin C ( CYCC)
. Kontroller uden skabelon (ingen cDNA i PCR) blev kørt i hvert gen til påvisning uspecifikke eller genomisk amplifikation og primerdimerisering. Alle eksperimenter blev udført in duplo.

Generation og oprensning af et anti-LGR5-antistof-

Polyklonale antisera blev genereret mod den carboxyterminale hale af den humane LGR5 receptor. Kaniner blev immuniseret med tre forskellige peptider af identitet SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (kaldet Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (kaldet 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (kaldet 12) ved Pineda-abservice (Berlin, Tyskland). Monospecifikt IgG blev oprenset ved hurtig protein-væskekromatografi med ÄKTAprime ™ -systemet (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) under anvendelse af en protein A-søjle (GE Healthcare). For alle efterfølgende analyser, dvs. immunofluorescens, immuncytokemi, western blot og immunhistokemi, den monospecifikke IgG-fraktion var affinitetsoprenset mod de immuniserende peptider fra Pineda-abservice. I dot blot analyser og immunhistokemiske undersøgelser, den monospecifikke IgG anti-LGR5-11b antistof viste høj affinitet sammen med stærk og specifik immunfarvning. Derfor blev dette antistof anvendt i hele denne undersøgelse. Reaktiviteten og specificiteten af ​​det monospecifikke antistof blev karakteriseret ved western blot; immunofluorescens og immuncytokemiske analyser.

Plasmid konstruere

Expression konstruere for LGR5 blev genereret ved at forstærke hele kodende sekvens af human LGR5
(NM_003667.2) ved PCR (tabel S1 ). For at lette subkloning af det amplificerede fragment i ekspressionsvektoren pcDNA3.1 (-), den fremadrettede primer indeholdt et Nhel-restriktionssted adapter og den bagudrettede primer indeholdt et BamHI-sted og et c-myc-tag for at verificere vellykket transfektion. PCR-fragmenter og pcDNA3.1 (-) ekspressionsvektor blev fordøjet separat med Nhel og BamHI før ligering med T4-ligase (Roche). Plasmidet blev verificeret ved spaltning med NheI og BamHI og DNA-sekventering under anvendelse af ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits, Version 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Tyskland).

Cellekultur og transfektion

den menneskelige mavekræft cellelinje MKN74 blev opnået fra det japanske Health Science Research Resource Bank (Osaka, Japan), og MKN45 fra den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (Braunschweig, Tyskland). HEK293 EBNA-celler blev købt af Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 medium (MKN74, MKN45) eller Dulbeccos modificerede Eagle-medium (HEK293) suppleret med 10% (MKN74, HEK293) eller 20% (MKN45) føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østrig). DNA-transfektion af HEK293 EBNA, MKN74 og MKN45 celler blev udført ved anvendelse af Lipofectamin LTX reagens (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet blev celler dyrket i seks-brønds plader. Stabil transfektion af MKN74 og MKN45 med ekspressionsplasmider blev udført som tidligere beskrevet [7]. Til transient transfektion af HEK293-celler 1 ug plasmid-DNA og 5 pi Lipofectamine LTX reagens blev fortyndet i 500 pi Dulbeccos modificerede Eagle-medium uden serum, hhv. Efter inkubation i 30 minutter ved stuetemperatur blev blandingen tilsat til HEK293-celler. Otteogfyrre timer efter transfektion blev transficerede celler høstet og RNA eller proteiner blev isoleret. Celler transficeret med vektoren pcDNA3.1 (-) alene og utransficerede celler tjente som negative kontroller

Immunofluorescens

Fireogtyve timer efter podning på CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Belgien),. cellerne blev vasket med phosphatbufret saltvand, fikseret i 07:03 acetone:methanol (20 minutter, -20 ° C) og efterfølgende permeabiliseret med 0,1% Triton-X (5 minutter, stuetemperatur). Objektglas blev derefter inkuberet med c-myc-monoklonalt museantistof (Clontech, Mountain View, CA, USA) natten over ved 5 ° C i et fugtigt kammer, efterfulgt af et anti-muse Alexa Fluor 555-konjugeret sekundært antistof (Invitrogen). At detektere vellykket transfektion af LGR5 blev celler inkuberet med anti-LGR5-antistof efterfulgt af et anti-kanin sekundært antistof konjugeret med Alexa Fluor 488 (Invitrogen) hver i en time ved stuetemperatur. Udeladelse af primære antistoffer på LGR5 transficerede HEK293 EBNA-celler tjente som negativ kontrol. Montering og kontrastfarvning blev gjort med Vectashield Hard-Set herunder DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA).

Immuncytokemi

immuncytokemisk farvning blev udført på formalin-fikseret, paraffin- indlejret MKN45 gastriske cancerceller. Til dette formål blev MKN45 celler indlejret i små agaroseperler som beskrevet tidligere [8]. Yderligere behandling og immunfarvning med anti-LGR5-antistof (fortynding 1:1000) blev udført ifølge den immunhistokemiske analyser af humane vævssnit (se nedenfor). Udeladelse af det primære antistof på LGR5 transficerede MKN45 celler tjente som negativ kontrol, mens specificiteten af ​​anti-LGR5-antistof farvning blev bekræftet ved inkubation af antistoffet med det immuniserende blokerende peptid.

Western blotting

Proteinlysater blev opnået ved inkubering human gastrisk væv og dyrkede gastriske celler med ProteoJET ™ Mammalian Cell Lysis Reagent (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) og protease-inhibitor cocktail (Complete EDTA-free, Roche). Proteinprøver blev denatureret i Laemmli-buffer (60 mM Tris-HCI pH 6,8, 2% natriumdodecylsulfat, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol og 0,01% bromphenolblåt) ved opvarmning ved 95 ° C i ti minutter og blev efterfølgende loaded på 4% til 16,5% SDS-polyacrylamidgeler og visualiseret ved farvning med Coomassie blue. Efter separation blev proteiner på ufarvede polyacrylamidgeler overført til en nitrocellulosemembran (Amersham, Freiburg, Tyskland), immunoblottet med anti-LGR5-antistof (fortynding 1:20,000) og et anti-β-actin-antistof (1:10,000; klone AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for at sikre lige lastning beløb. Membranbundet HRP-mærket sekundære antistoffer (DakoCytomation, Glostrup, Danmark) blev detekteret ved forøget kemiluminescens under anvendelse af ECL-systemet (Amersham). Udeladelse af det primære antistof fungerede som negativ kontrol, mens specificiteten af ​​anti-LGR5-antistof farvning blev bekræftet ved inkubation af antistoffet med det immuniserende blokerende peptid.

Histologi

I histologiske analyser, væv prøverne blev fikseret i 10% neutraliseret formalin og indlejret i paraffin. Deparaffinerede snit blev farvet ved anvendelse hematoxylin og eosin (H &E). Gastrisk karcinom blev klassificeret ifølge WHO klassifikationen [9]. Den pTNM fase blev bestemt efter 7 ^{th udgave af International Union Against Cancer [10].}

Tissue micro-array konstruktion

formalin-fikseret og paraffin-embedded vævsprøver var anvendes til at generere væv microarrays som tidligere beskrevet [11]. Fire mikrometer sektioner af den resulterende tumorvæv micro-array blok blev skåret til yderligere analyse. Vellykket overførsel af tumorvæv blev bekræftet mikroskopisk bruge H &. E-farvede sektioner

Immunhistokemi

Til immunhistokemi blev formalin-fikseret og paraffinindstøbte snit brugt. Immunfarvning blev udført med den anti-LGR5-antistof (fortynding 1:1000), et monoklonalt antistof rettet mod CD44 (1:200; Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, GB) og kommercielle polyklonale antistoffer rettet mod LGR5 (LGR5 ^{com , 1:400; Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA), ADAM17 (fortynding 1:50; Sigma-Aldrich) og Musashi-1 (1:500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA). Efter 20 minutter blokering med hydrogenperoxid blok (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 5 minutter behandling med Ultra V Block (Thermo Scientific) og inkubation med det primære antistof blev udført i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i 30 minutter. Objektglas blev vasket mellem trinnene med Tris-bufret saltvand (TBS). Immunreaktioner blev visualiseret med n-Histofine Simple Stain MAX PO System (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan) og DAB-substrat (Linaris, Wertheim-Bettingen, Tyskland). For dobbelt farvning af LGR5 med CD44, ADAM17 og Musashi-1 blev gratis bindingssteder blokeret med musen IgG og kanin-IgG-kontrol (Abcam) fortyndet i antistoffortyndingsmiddel (ZYTOMED Systems, Berlin, Tyskland) efter DAB-behandling. Prøverne blev modfarvet med hæmatoxylin. Udeladelse af det primære antistof fungerede som negative kontroller. Ikke-neoplastiske menneskelige mave (CD44) og hjernevæv (LGR5 com, LGR5 og Musashi-1) tjente som positive kontroller.}

Evaluering af immunfarvning

Immunfarvning af ikke-neoplastisk epitel og tumorceller blev scoret ved at påføre en immunoreaktivitet pointsystem (IRS). Kort beskrevet kategori A dokumenteret intensiteten af ​​immunfarvning som 0 (ingen immunfarvning), 1 (svag), 2 (moderat) og 3 (kraftig). Kategori B dokumenteret procentdelen af ​​immunoreaktive celler som 0 (negative), 1 (spredte positive celler; ≤1%), 2 (2-10% positive celler), 3 (11-50%), 4 (51-80%) og 5 (> 80%). Tilføjelsen af ​​kategori A og B resulterede i en IRS spænder fra 0 til 8 for hvert enkelt tilfælde. De fordelingsmæssige ændringer i LGR5 ^{+ celler i 100 hele mount sektioner af tarmen form mavekræft blev scoret som følger: Antallet af immunoreaktive celler blev kategoriseret som 0 (negativ), 1 (< 10 positive celler), 2 (10 -50 positive celler) og 3 (> 50 positive celler) separat for den luminale overflade, tumor center og invasionen foran}

statistiske analyser

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af PASW Statistics 18. statistisk pakke (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Sammenligninger mellem grupper blev testet ved anvendelse af Fishers eksakte test. Korrelation af LGR5 udtryk inden for en gruppe blev oprettet af Kendall tau rang-orden korrelation. Overlevelseskurver blev udstyret med Kaplan-Meier-metoden og forskelle i overlevelse vurderet ved log rank test. Betydningen af ​​korrelationer af LGR5 ekspression i primære tumorer og tilsvarende ikke-malignt væv blev vurderet ved Wilcoxon test. Real-time RT-PCR-data, som blev evalueret med en parret tosidet t-test, fik logaritmerede at opnå ca. normalfordelte data. P-værdier. ≪ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

LGR5-mRNA udtrykkes forskelligt i lever- og mave-karcinomer

LGR5 sigende udtrykt i murine stamceller tarm krypter [12] og blev ofte overudtrykt i colon cancer cellelinjer [13]. For at undersøge sit udtryk i ikke-neoplastiske og neoplastiske humant væv, vurderet vi den transkriptionelle udtryk for LGR5 i humane kliniske prøver består af en bred vifte af lever- og mave-karcinomer. Real-time RT-PCR-analyse blev udført på en række 105 patienter omfatter maligne og tilsvarende ikke-maligne væv, fremstillet af de samme patienter, otte forskellige tumortyper: spiserør [Barretts adenokarcinomer (9 patienter) og planocellulært karcinom ( 7)], mave [intestinal (19) og diffus type (21) gastriske carcinomer], lever [HCCs (4) CCS (6)], colon (19) og rectum (20; tabel 1)
<. p> LGR5-mRNA var signifikant udtrykkes forskelligt i adenocarcinomer i spiserøret (p = 0,007), mave [intestinal type (p = 0,006) og diffus type (p = 0,013)], lever [CCs (p = 0,022)], colon (p < 0,001) samt rectum (p = 0,002) sammenlignet med den matchede ikke-neoplastisk væv. Der blev imidlertid ikke differentielle ekspression fundet i pladecellecarcinomer i spiserøret (p = 0,503) og HCCs sammenlignet med de tilsvarende ikke-neoplastiske væv (p = 0,545, figur 1).

Et polyklonalt anti-LGR5- antistof registrerer menneskelig LGR5 transficeret i HEK293 og MKN45 celler

for yderligere at undersøge histoanatomical fordeling af LGR5 i humane væv og undersøge sin klinisk-patologisk betydning blev en LGR5-specifikt antistof rejst, da de kommercielt tilgængelige antistoffer gjorde ikke opfylder vores krav (figur 2A). At udelukke krydsreaktivitet af den nyligt genererede antistof med de mest strukturelt ens LGRs, LGR4 og LGR6, vi udført en sekvens tilpasning til National Center for Biotechnology Information
tilpasning værktøj på forhånd (data ikke vist). Nr sekvenshomologi blev fundet med LGR4 eller LGR6 i området ved LGR5 peptid vi anvendt til immunisering. For udvælgelsen af ​​et yderst specifikt antistof mod LGR5 blev cDNA klonet fuldlængde transficeret ind HEK293 EBNA-celler og anvendes som et positivt mål udfører immunofluorescens. Den LGR5 cDNA blev direkte mærket med en myc-epitop, der muliggjorde bedømmelsen af ​​transfektion med et anti-myc tag antistof. Brug af immunfluorescens, binding af det anti-myc tag antistof blev fundet efter inkubation med LGR5 /HEK293-celler, men ikke i tom vektor-transficerede celler (vektor /HEK293), utransficerede HEK293-celler, eller i den negative kontrol af LGR5 /HEK293-celler inkuberet med antistoffortyndingsmiddel stedet for det primære antistof. Det samme resultat blev opnået, når vi brugte den anti-LGR5-antistof (figur 3), hvilket viser specifik mærkning af LGR5.

Specificiteten af ​​LGR5-immunomærkning blev yderligere valideret med formalin-fikseret og paraffin-indstøbt MKN45 gastrisk cancerceller. Cellerne blev fremstillet og farvet på en måde, der paralleller behandlingen af ​​kliniske vævsprøver humane. Immuncytokemiske analyser på paraffinsnit afslørede en positiv farvning af anti-LGR5-antistof på MKN45 celler stabilt transficeret med LGR5 cDNA (LGR5 /MKN45). I stedet tom vektor-transficerede MKN45 celler (vektor /MKN45), såvel som den negative kontrol (udeladelse af det primære antistof) og peptidet kontrol (præ-inkubering af antistoffet med dets immuniserende blokerende peptid) af LGR5 /MKN45 celler viste ingen binding af antistoffet (fig S1).

LGR5 protein specifikt detekteret med anti-LGR5-antistof i humant transficeret MKN74 celler Salg

humane gastriske cancercellelinier MKN74, kendt for at besidde en moderat LGR5-mRNA-ekspression (data ikke vist) og humant ikke-neoplastisk mave, der udviser meget lav LGR5 ekspression (figur 1) blev valgt til at karakterisere reaktiviteten og specificiteten af ​​anti-LGR5-antistof på proteinniveau.

i western blot-analyse blev LGR5 protein genkendes specifikt af den monospecifikke anti-LGR5-antistof i en fortynding på 1:20,000. Den identificerede et bånd med en tilsyneladende molekylvægt på 100 kDa i MKN74 cellelysater (figur 4), som svarer til den molekylære masse beregnet for LGR5 protein. I modsætning hertil blev intet bånd detekteret i lysater af humane ikke-neoplastisk mavevæv, som udelukker en krydsreaktivitet af anti-LGR5-antistof med cellulære proteiner. I overensstemmelse med mRNA udtryk data blev stærkere ekspression af LGR5 protein observeret i MKN74 celler stabilt transficeret med LGR5 cDNA sammenlignet med MKN74 kontrolceller transficeret med tom vektor. LGR5 proteinekspression i human non-neoplastisk maveslimhinden var ud over detektionsgrænsen for western blotting, viser ingen bånd. Udeladelse af anti-LGR5-antistof eller forrige inkubation af antistoffet med dets immuniserende blokerende peptid viser ingen proteinbånd henholdsvis. Påvisning af β-actin protein (ca. 43 kDa, figur 4) tjente som en belastning kontrol og bekræftede jævnt indlæst proteinmængder i alle baner

LGR5 udtrykkes i ikke-neoplastisk og neoplastisk væv i lever-mave.
tarmkanalen

ekspression og histoanatomical fordeling af LGR5 blev efterfølgende undersøgt ved immunohistokemi i en serie på 127 væv slides opnået fra tilsvarende ikke-neoplastisk og neoplastisk væv af hepato-mavetarmkanalen, omfattende spiserøret (14 patienter), mave (32), leveren (24), pancreas (17), colon (20), og rectum (20; tabel 1). Ud af denne kohorte neoplastisk og tilsvarende ikke neoplastiske vævsprøver af 105 patienter blev også studeret på det transkriptionelle niveau (se ovenfor).

LGR5 ekspression af den samlede kohorte var positiv i 65 tilfælde (51%) af alle ikke-maligne væv og 103 tilfælde (81%) af alle cancervæv. Lokalisering af LGR5 ekspression blev observeret som primært cytoplasmatisk, mens også en sporadisk membran eller kerne membran forstærket udtryk indtraf. En LGR5-immunreaktivitet blev fundet i alle væv komponenter, dvs. stromaceller, endotelceller, celler i den ikke-neoplastisk epitel og i cancerceller (figur 5). LGR5-immunreaktivitet i stromaceller iagttoges i 49 (39%) af alle ikke-maligne væv og i 80 tilfælde (63%) af alle cancervæv. En endothelial immunoreaktiviteten af ​​LGR5 blev observeret i 42 tilfælde (33%) af alle væv.

I den ikke-maligne epitel, LGR5 blev normalt findes i nogle få spredte celler tæt på basalmembranen af ​​maveslimhinden enhed, pancreas kanaler og de kolorektale krypter. LGR5 blev ikke fundet i pladeepitelet af spiserøret, intrahepatiske galdegange, og hepatocytter (figur 6). For alle vævstyper bortset fra øsofageal væv middelværdien af ​​IRS var signifikant højere for tumorvæv i forhold til den matchede ikke-malignt væv, der bekræfter vores resultater på det transkriptionelle niveau (tabel 1).

LGR5 er til stede i spredte celler i normale maveslimhinden

eksistensen af ​​multipotente stamceller inden for murine mave blev vist ved klonale mærkning undersøgelser. Den endelige identifikation af disse celler mislykkedes hidtil på grund af manglende adgang til specifikke endogene markører [14]. Brug serielle snit opnået fra en ærme resektion modellen, som normalt opnås for behandling af overvægt, og viste ingen histologiske tegn på gastrisk kræft eller kronisk gastritis, søgte vi efter LGR5 ^{+ epitelceller. Interessant, spredte LGR5 + -celler blev fundet i mukøse halsområde mellem foveolae og kirtler (figur 7).}

LGR5 er co-udtrykt med andre potentielle gastriske stamcellelinjer eller progenitorcelle markører

stamceller af ikke-neoplastisk væv og CSCS identificeres sædvanligvis og valideret af ekspressionen af ​​mere end en enkelt stamcelle markør [15]. Brug af immunhistokemi, vi næste analyserede coekspression af LGR5 med andre formodede CSC markører, dvs. ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 blev valgt, da tidligere undersøgelser identificeret ADAM17 som et formodet stamcelle markør af maven [8]. Immunfarvning (enten dobbelt farvning eller farvning af serielle snit) blev udført på en mavekræft prøve og på sund uninflammed maveslimhinden opnået ved ærme gastrektomi. Generelt viste kun få spredte celler positiv immunfarvning for den ene og /eller det andet formodede stamcellemarkør. Interessant, den ikke-neoplastiske maveslimhinden huser celler, som er hver ADAM17 ^{+ /LGR5 + (svarende til ca. en tredjedel af alle immunoreaktive celler) og ADAM17 + /LGR5 - (to tredjedele) og ADAM17 - /LGR5 + (få spredte celler; Figur 2C-E)}

Musashi-1 (MSH-1) blev beskrevet som en formodet stamcelle markør i musen tarmen. og menneskelige mave [18], [22] og som en CSC markør i tumorer [23]. I neoplastiske og ikke neoplastiske gastrisk væv positive farvede celler sammensat overvejende af Msh-1 ^{+ /LGR5 - (cirka to tredjedele af alle immunreaktive celler), i mindre grad MSH-1 + /LGR5 + (en tredjedel), og kun få Msh-1 - /LGR5 + celler (Figur 2-F-H). Endelig overflade markør for kolorektal og gastriske cancer stamceller CD44 [21], [24] afslørede en fordeling sammenlignelige med Msh-1 (figur 2I, J). Kollektivt, disse fund støtter hypotesen om, at vores anti-LGR5-antistof detekterer celler med stamcelle ekspressionsmønstre i den menneskelige maveslimhinden.}

Den geografiske fordeling af LGR5 + celler ændringer i tumorudvikling

de sekventielle ændringer i maveslimhinden, der går forud for udviklingen af ​​invasiv cancer er kendt som den "præcancer kaskade«, først beskrevet i 1975, hvor den normale maveslimhinden transformeres ved kronisk atrofisk gastritis og udvikler multifokal atrofi og tarm metaplasi, efterfulgt af udseendet af dysplasi og endelig invasive carcinom [25]. Næste testede vi den hypotese, at de førnævnte histopatologiske ændringer af maveslimhinden er forbundet med en omfordeling af LGR5 ^{+ formodede stamceller. Vi systematisk udforsket histoanatomical fordeling af LGR5 + celler i 100 patienter med tarm form mavekræft. Hele mount vævssnit blev anvendt som lukkede ikke-neoplastiske, metaplastisk og neoplastisk kræftvæv. Det var indlysende, at histoanatomical fordeling af LGR5 + -celler ændres (se figur 7): i ikke-neoplastiske og ikke-metaplastisk maveslimhinden, få spredte LGR5 + -celler blev fundet i mukøse halsområde (figur 7A, E). I den intestinale metaplasi, en let øget antal LGR5 + celler blev lokaliseret ved bunden af ​​de metaplastiske krypter (figur 7B, F). Men i tarm typen mavekræft lokalisering og antallet af LGR5 + celler påfaldende ændret. I mavekræft, LGR5 + -celler var til stede på den luminale overflade (figur 7C, G), i tumoren centrum (mellem luminale overflade og invasion foran) og ved invasionen foran (fig 7D). Mest interessant er fordelingen af ​​LGR5 + gastriske cancerceller viste karakteristiske mønstre: den LGR5 + -celler forekom i kohæsive pletter af et variabelt antal af tumorceller i området fra < 10, 10-50 og endog > 50 tumorceller, der ofte har form gradienter af faldende farvningsintensiteter. Den overordnede fordeling af disse LGR5 + tumor celle patches var ujævn og inhomogen. Kollektivt, vi observerede en stigning i antallet og intensiteten af ​​LGR5 + celler fra ikke-neoplastisk epitel til mavekræft støtte vores Real-time RT-PCR og immunhistokemi data for matchede (ikke-neoplastisk versus neoplastiske) patient tilfælde (se tabel 1). Vores resultater af den ændrede fordeling mønster af LGR5 + celler er i overensstemmelse med dem, der er beskrevet af Takeda et al. for tarmkræft [26].}

Udtrykket af LGR5 i tarm form mavekræft korrelerer med lokal tumorvækst og nodal spredning

Det påstås, at CSC indflydelse patient prognose ved deres evne til at danne tumor celle kolonier, en uundværlig forudsætning for metastatisk spredning og recidiv. For yderligere at undersøge betydningen af ​​LGR5 for mavekræft, korreleret vi udtryk for LGR5 i tarm typen mavekræft med forskellige klinisk-patologisk patientkarakteristika.

• PLoS ONE: nedsat niveau af Active SMAD2 korrelerer med dårlig prognose i Gastric Cancer
• PLoS ONE: glyoxalase-I er en roman Prognose Factor associeret med mavekræft Progression