PLoS ONE: CCR7 uttrykk og intratumorale foxp3 + regulatoriske T-celler er korrelert med total overlevelse og lymfeknutemetastase i Gastric Cancer

Abstract

Formålet med denne studien var å undersøke den prognostiske verdien av chemokin reseptor CCR7 uttrykk og intratumoral foxp3 ^{+ regulatoriske T-celler (tregs) i magekreft. CCR7 + tumorceller og foxp3 + tregs ble vurdert ved immunhistokjemi i microarray som inneholder magekreft fra 133 pasienter. Prognostiske virkningene av lav eller høy CCR7 og foxp3 ekspresjon ble evaluert ved Cox regresjon og Kaplan-Meier-analysen, samt korrelasjonen mellom CCR7 positivt resultat og intratumoral foxp3 + celle nummer i en langsgående vurdering. Analysen viste at den høye ekspresjonsnivåer av CCR7 og foxp3 ble påvist på 69,9% og 65,4% av tilfellene, respektivt. Høy CCR7 uttrykk i magekreftceller var signifikant assosiert med dårlig total overlevelse (OS) ( P
= 0,010) og lymfeknutemetastase ( P
= 0,009), og var en faktor for verre OS ( P
= 0,023) av multivariat analyse. Høyt antall intratumoral foxp3 + Tregs signifikant korrelert med kortere OS ( P
= 0,021) og lymfeknutemetastase ( P
= 0,024), og var også en faktor for negativ OS ( P
= 0,035). Videre var det en signifikant positiv korrelasjon mellom CCR7 positiv score og intratumoral foxp3 + celletall (r = 0,949, P
< 0,001). Resultatene viste at CCR7 uttrykk i mage kreftceller og intratumoral foxp3 + Tregs kan anses som en co-indikator for klinisk prognose av magekreft}

Citation. Zhou S, Xu S, Tao H, Zhen Z, Chen G, Zhang Z, et al. (2013) CCR7 Expression og intratumorale foxp3 ^{+ regulatoriske T-celler er korrelert med total overlevelse og lymfeknutemetastase i magekreft. PLoS ONE 8 (9): e74430. doi: 10,1371 /journal.pone.0074430}

Redaktør: Udai P. Singh, University of South Carolina School of Medicine, USA

mottatt: 26 april 2013; Godkjent: 01.08.2013; Publisert: 05.09.2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No. 31000527), Shanghai Helse Bureau forskningsfond for ung etterforsker (Dr. Shuang Zhou) og Hong Kong Scholar program (No. XJ2011025). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

CCR7 er en syv-transmembran G-protein-koblet kjemokinreseptor, hovedsakelig uttrykt på celleoverflaten av naive T-celler og dendrittiske celler (DCS), SLC (sekundære lymfoide kjemokinet, CCL21) og ECL (EB11-ligand kjemokin , CCL19) er de to høy affinitet ligander. CCR7 er avgjørende for migrering av T-celler og DC til det omkringliggende lymfoid vev eller området av immunresponsen ved å binde seg til sine ligander [1]. CCR7
er uttrykkes ikke bare
i naive T-celler og DC, men også i enkelte kreftceller. Tumorer med høy CCR7 uttrykk er mer sannsynlig vise extrathyroidal forlengelse, angiolymphatic invasjon, lymfeknutemetastase, anti-apotosis og celleproliferasjon [2] - [4]. CCR7 fremmer tumorvekst og metastasering som svar på endogene SLC eller ELC. Mange studier har vist at maligne celler med CCR7 ekspresjon kan rettes til de tilsvarende organer med høy tilstedeværelse av deres ligander [5] - [8]. Derfor er CCR7-mediert celle kjemotakse ikke bare relatert til etablering av antitumorimmunmikromiljøet, men også kan bidra til tidlig evaluering av den biologiske oppførsel av tumorer. CCR7 uttrykk i tumorceller er nært korrelert med deres metastaser og malignitet [2].

Regulatoriske T-celler (tregs) antas å dempe T-celle immunitet og for å være den viktigste hindringen tempeimmunterapi. En voksende mengde bevis tyder på at tregs i svulsten mikromiljøet kan spille en betydelig rolle i undertrykkelse av lokale antitumor immunresponser [9], [10]. Foxp3, en gaffelhode /bevinget helix transkripsjonsfaktor, er den mest spesifikke markør for Tregs og det er mulig å definere Tregs mer strengt som CD4 ^{+ CD25 + regulatoriske T-celler [11]. Foxp3 synes å være avgjørende for utvikling og funksjon av tregs, og tap av foxp3 uttrykk fører til mangel på tregs og hyperaktiveringen av CD4 + T-celler, noe som resulterer i dødelig autoaggressive lymfoproliferasjon, mens overekspresjon av foxp3 resulterer i alvorlig immunsvikt [11] - [13]. Det er rapportert at økt foxp3 + tregs er forbundet med en høyere risiko for tilbakefall og dårlig total overlevelse av pasienter med noen solide svulster [14] - [20]}

Magekreft er den fjerde mest vanlige. kreft i verden, og total overlevelse av pasienter som forblir dårlig til tross for forbedrede diagnostiske og behandlingsstrategier, blant hvilke reseksjon er en av de første prioritet [21]. Videre undersøkelser anbefales å undersøke den prognostiske betydningen av CCR7 uttrykk og Tregs i magekreft.

I denne studien undersøkte vi den prognostiske verdien av CCR7 uttrykk i magekreftceller og intratumoral foxp3 ^{+ Tregs, og forholdet mellom dem i magekreft. Resultatene antydet at de ikke ble bare forbundet med dårlig overlevelse og lymfeknutemetastaser, men også positivt korrelert med hverandre.}

Materialer og metoder

Etikk erklæringen

Dette studien ble godkjent av etisk komité ved Tongji University School of Medicine og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før innmelding. Prosedyren for å samle menneskemagekreft reseksjon prøver fra pasienter ble forvandlet til prinsippene i Helsinkideklarasjonen.

Pasienter og Oppfølgings

133 pasienter med magekreft som gjennomgikk utvidet lymfeknute disseksjon (D2 reseksjon) mellom 2001 og 2007 på Tongji Hospital (Shanghai, Kina) ble inkludert i vår studie. Evalueringen av reseksjon prøvene ble utført i samsvar med retningslinjene i den japanske Gastric Cancer Association (JGCA) i 1998. Ingen av pasientene fikk strålebehandling, cellegift eller andre medisinske intervensjoner før operasjonen. Prøvene ble valgt bare på grunnlag av tilgjengeligheten av egnet formalinfiksert, parafininnebygd vev og fullstendig clinicopathologic og oppfølgingsdata for pasientene.

Oppfølging ble gjennomført 15. november 2010. En minimum 3-års oppfølging var nødvendig. Median oppfølgingstid på 43 måneder (spredning 36 til 104 måneder). Oppfølgingsrutiner besto av interims historie, fysisk undersøkelse, tumormarkører (CEA, CA199), abdominal ultralyd og røntgen hver 4-6 måneder i henhold til postoperativ tid. For pasienter med testresultater som tyder på tilbakefall, ble computertomografi (CT) og magnetisk resonans imaging (MRI) brukes til bekreftende bevis for tilbakefall. De tilbakefall av magekreft måtte bekreftes av cytologi biopsi eller kirurgi. Total overlevelse (OS) ble definert som intervallet mellom kirurgi og død eller mellom kirurgi og siste observasjon for overlevende pasienter. Dataene ble sensurert i siste oppfølging for å leve pasienter.

microarray og Immunohistochemistry

Tissue microarrays ble bygget som tidligere beskrevet [22], [23]. Alle saker ble histologisk vurdering av haematoxylin og eosin farging, og representative tumorområder med små runde lymfocytter infiltrere ble premarked i parafinblokker, vekk fra nekrotiske og blødnings materialer. Duplicate 1 mm diameter sylindere fra tumor sentrum (betegnet som intratumor) ble valgt ut fra hvert enkelt tilfelle ved hjelp av en automatisert vev arrayer (Shanghai biochip Co., Ltd, Shanghai, Kina), sammen med paracancerous ikke-ondartede mage vev som kontroller for å sikre reproduserbarhet og homogen farging av slides. Deler av 4-mikrometer tykkelse ble tatt på 3-aminopropyltrietoksysilan-belagt lysbilder.

Musen monoklonale antistoffer som ble brukt var anti-human CCR7 (eBioscience, San Diego, California) og foxp3 (Biolegend, San Diego, CA) . Immunhistokjemi av parafinsnitt ble utført ved hjelp av en to-trinns-protokollen (Novolink Polymer Detection System, Novocastra, Newcastle, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet snitt ble deparaffinized i xylen og rehydratisert i etanol. Etter endogen peroksidase-aktivitet ble blokkert med inkubasjon av lysbildene i 0,3% H _{2o 2, antigen gjenfinning ble gjort ved å anbringe delene i en elektrisk kjøkken gryte fylt med kokende citratbuffer i 20 min, og ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert med Protein Block (RE7102). Etter serie inkubasjon med primære antistoffer, Post Primary Block (RE7111), og sekundære antistoffer (RE7112), delene ble utviklet i 3,3'-diamiobenzidine løsning under et mikroskop og kontra med hematoxyline. Negative slides utelate primære antistoffer ble inkludert i alle analyser.}

Evaluering av Immunohistokjemiske variabler

CCR7 positive resultatet av tumorceller ble analysert ved bruk av bildeanalyse programvare (Leica Qwin bildebehandling og Analysis Application Software, Wetzlar, Tyskland). For hvert bilde, alt intakt høyeffekts feltet (HPF) (× 400) digitale bilder ble tatt av de nevnte utstyr og deretter analysert av bildeanalyse programvare for å skaffe seg den positive score på CCR7 for hvert felt. Til slutt, gjennomsnittlig antall for en HPF (× 400) ble beregnet for å sikre representativitet og homogenitet.

Antall foxp3 ^{+ Tregs i mikromatriser ble regnet som tidligere beskrevet [14], ved hjelp av datastyrt bildeanalyse systemet består av en Hitachi HV-C20A CCD-kamera (Hitachi, Tokyo, Japan), installert på en Leica DMLA lysmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) og koblet til en datamaskin. Under × 400 forstørrelse, var det minst 12 uavhengige og intakte data mikroskopiske felt for duplikater av hver pasientprøve. 8 uavhengige mikroskopiske felt (× 400), som representerer de tetteste lymfatisk infiltrater, ble valgt for hver pasientprøve for å sikre representativitet og homogenitet. Antallet 12 felt ble kumulert og deretter i gjennomsnitt til å beregne det endelige tallet for en datastyrt × 400 mikroskopisk felt (0.0768 mm 2 /felt). Evalueringen av foxp3 + tregs ble utført av to uavhengige observatører i blindt. Avvik i oppregning, innenfor et område på 5%, ble undersøkt på nytt og en konsensus vedtaket ble gjort.}

Statistical Analysis

Estimat OS priser ble beregnet av Kaplan-Meier metoden og analysert av log-rank test. Univariate og multivariate analysene var basert på Cox regresjonsmodell. En sekundær analyse ble utført for å vurdere forholdet mellom variabler og clinicopathologic egenskaper. For sammenligning av individuelle variabler, ble chi-kvadrat tester og Fishers eksakte tester utført etter behov. To-tailed P
< 0,05 ble vurdert å være betydelig. Alle analyser ble utført ved hjelp av SPSS 16.0 programvare (SPSS, Chicago, IL).

Resultater

Pasient Kjennetegn

Det som kjennetegner 133 pasienter ble vist i tabell 1. Prøvene inkluderte 89 (66,9%) menn og 44 (33,1%) kvinnelige pasienter med magekreft. 68 (51,1%) pasienter som var mindre enn 60 år gamle, og andre var mer enn eller lik 60 år gamle. Den tumorstørrelse av 79 (59,4%) pasienter var mindre enn 40 mm, og det andre var mer enn eller lik 40 mm. 75 (56,4%) av pasientene hadde lymfatisk invasjon og 84 (63,2%) av pasientene hadde lymfeknutemetastase. 61 (45,9%) svulster ble udifferensiert og andre ble differensiert. 50 (37,6%) svulster ble kategorisert som T1T2, og 83 (62,4%) som T3T4 ifølge JGCA.

Uttrykk for CCR7 og foxp3 i Gastric Cancer Vev

uttrykk nivåer av CCR7 og foxp3 i microarray av magekreft ble undersøkt ved immunhistokjemisk analyse. Fig. 1 og fig. 2 viste representative immunostainings av CCR7 og foxp3. Positiv farging av CCR7 ble identifisert i cytoplasma og cellemembran av magecancerceller (Fig. 1 A-D). Høy CCR7 uttrykk ble påvist i 69,9% av magekreft prøver (93 tilfeller av 133 pasienter). Celler ble betraktet som foxp3 ^{+ Tregs basert på distinkte intranuclear ekspresjon (Fig. 2 A-D). Høy foxp3 uttrykk ble påvist i 65,4% av magekreft prøver (87 tilfeller av 133 pasienter). Når det gjelder score på CCR7 positive tumorceller og foxp3 + Tregs nummer, de statistiske resultatene for de immunhistokjemiske variablene ble vist i tabell 2. Som kontrollene, var det ingen CCR7 uttrykk og svært få foxp3 + Tregs i normale mage vev (fig. S1).}

CCR7 og foxp3 Expression var assosiert med Total overlevelse i Gastric Cancer

til slutt oppfølging, 39 pasienter (29,3%) studerte hadde dødd, alle døde fra gjentakelse av magekreft. OS priser var 93,5% for ett år, 81,2% i 2 år og 76,9% i 3 år, henholdsvis for hele studiet.

Prognostiske effekter av lav eller høy CCR7 og foxp3 uttrykk ble evaluert av Cox regresjon og Kaplan-Meier analyse. På univariat analyse, alder, kjønn, tumorstørrelse og tumor differensiering viste ingen prognostisk betydning for OS priser, men lymfatisk invasjon, noder lymfe metastase og tumor (T) klassifisering ble assosiert med OS priser ( P
= 0,019, P
= 0,013, P
< 0,001 henholdsvis tabell 3). CCR7 uttrykk i magekreftceller var assosiert med OS priser (log-rank test, P
= 0,010 < 0,05), ett år, to år og tre år OS priser var 91,4%, 78,5 % og 72% for de høye CCR7 uttrykk gruppene, sammenlignet med 100%, 97,5% og 92,4% for de lav CCR7 ekspresjons-grupper (fig. 3A). Multivariat analyse viste at høy CCR7 uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor for verre OS priser (hazard ratio [HR] 2,896, 95% konfidensiell intervall [CI] 1,385 til 7,276, P
= 0,023 < 0,05, tabell 4 ). Høy infiltrasjon av intratumoral foxp3 ^{+ Tregs var også assosiert med uønskede OS (log-rank test, P
= 0,021 < 0,05), ett år, to år og tre år OS priser var 88,9%, 79,1% og 69,5% for de høye foxp3 uttrykk grupper, sammenlignet med 97,8%, 89,6% og 87,2% for lav foxp3 uttrykk grupper (fig. 3B). På multivariat analyse, tilstedeværelse av høy intratumoral foxp3 + tregs ble også viste seg å være en uavhengig prediktor for dårligere OS priser (HR 1,906, 95% KI 1,205 til 4,238, P
= 0,035 < 0,05 tabell 5).}

foreninger mellom uttrykket nivåer av CCR7 og foxp3 og kliniske karakteristika

Tabell 6 oppsummert forholdet mellom uttrykket nivåer av CCR7 og foxp3 og kliniske kjennetegn ved de 133 pasienter med magekreft. Både CCR7 og foxp3 uttrykk var signifikant korrelert med lymfeknutemetastase ( P
= 0,009 og 0,024, henholdsvis). Det var også en signifikant sammenheng mellom CCR7 uttrykk og lymfatisk invasjon ( P
= 0,012). Men statistisk analyse viste at det ikke var noen signifikant sammenheng mellom CCR7 og foxp3 uttrykk og andre kliniske kjennetegn, som kjønn, alder, tumorstørrelse, differensiering og T klassifisering.

Sammenheng mellom CCR7 Positive Score og intratumorale foxp3 + celle nummer

sammenhengen mellom CCR7 positiv score og intratumoral foxp3 ^{+ treg celle nummer ble evaluert i en langsgående vurdering. CCR7 positive resultatet av mage-kreftceller og intratumoral foxp3 + Treg celle nummer kan være representert i den samme spredningsplott, fra spredningsplott, to variabler så ut til å ha en lineær trend som kan foretas lineær regresjonsanalyse. Og så sittende to variabler i anvendt statistikk lineær korrelasjonsanalyse ble utført for å analysere sin sammenheng. Resultatet viste at det var en signifikant positiv korrelasjon mellom CCR7 positiv score på mage kreftceller og intratumoral foxp3 + Treg celle nummer (r = 0,949, P
< 0,001, figur 4).}

diskusjon

i prosessen med tumor forekomst og utvikling, CCR7 på tumorcelleoverflaten binding til dets ligand SLC kan fremme tumorcelle-proliferasjon, angiogenese i tumorvev, og retningsbestemt migrasjon [24]. SLC /CCR7 komplekset kan forårsake celler for å indusere aktin polymerisasjon, som er nært korrelert med pseudopod dannelsen av kreftceller og nødvendig for sin invasjon og metastasering [25]. Tidligere studier har funnet at høyt ekspresjonsnivå av CCR7 i lungekreft, spiserørskreft, leverkreft, brystkreft og melanom nært relatert til tumorinvasjon og lymfeknutemetastase [5] - [7], [26] - [28]. Således, uansett om CCR7 ekspresjon eller ikke, og graden av dets ekspresjon kan ha direkte innvirkning kreft metastase og prognose. CCR7 uttrykk i enkelte kreftceller selv kan brukes som molekylære markører for å finne ut om svulstene er metastatisk product: [29]. Men disse funnene og andre spørsmål som prognostiske faktorer må videre forskning in vivo og klinisk bekreftelse.

Atomtranskripsjonsfaktor foxp3 har blitt allment akseptert som den beste markør for Tregs identifikasjon hos mennesker så langt. Ekspresjonen av foxp3 i T-celler korresponderer med immun regulerende funksjon i tumoren mikromiljøet [30]. Tumor-infiltrerende foxp3 ^{+ Tregs ble rapportert å være økt i en rekke forskjellige tumorer [31] - [36]. Noen studier har også undersøkt clinicopathologic betydningen av tregs infiltrasjon [32] - [34]. Merket infiltrasjon av Tregs i kreft stroma ble funnet å være en ugunstig prognostisk faktor i leveren [14], [20], ovarian [17], bryst [19], tonsillare [32], bukspyttkjertel [33] og tykktarm [34] cancere . Så vidt vi vet, om foxp3 + tregs er en ugunstig prediktor for magekreft er fortsatt kontroversiell [37] - [39]}

I denne studien har vi undersøkt om CCR7 uttrykk i magekreftceller. og intratumoral foxp3 ^{+ Tregs var forbundet med clinicopathological faktorer, og kan brukes som en prognostisk indikator. I microarray av mage kreft samlet inn fra 133 pasienter, som har vist seg å være et kraftig verktøy for å evaluere vevsprøver [40], brukte vi en immunhistokjemisk metode for å undersøke uttrykket nivåer av CCR7 og foxp3 i mage kreft vev. Høy CCR7 ekspresjon ble påvist i 69,9% av 133 magekreft prøver. Resultatet var i overensstemmelse med den tidligere studie av Mashino et al., Som har benyttet RT-PCR for å påvise 64 tilfeller av magekreft vevsprøver, hvorav 68,8% av magekreft vev er CCR7 mRNA positive uttrykk [25]. Viktigere, resultatene indikerte at CCR7 uttrykk i magekreftceller var assosiert med OS av Kaplan-Meier analyse, pasienter med høyt CCR7 uttrykk svulster hadde signifikant kortere overlevelse enn de med lav CCR7 uttrykk svulster. Videre multivariat analyse viste at CCR7 uttrykk var en selvstendig prognostisk indikator i magekreft. I vår serie, på samme måte, ved hjelp av Kaplan-Meier analyse, resultatene viste at utbredelsen av høy intratumoral foxp3 + Tregs var signifikant relatert til dårlig overlevelse av pasienter med magekreft. Multivariat analyse viste at intratumoral foxp3 + Tregs kan også være en uavhengig prognostisk faktor for pasienter med magekreft. Derfor vår studie viste at både høy CCR7 uttrykk og økt intratumoral foxp3 + Tregs kan anses som en indikator på dårlig prognose i magekreft.}

Økende bevis viser at CCR7 kan spille en viktig rolle for å styre tumorceller til de drenerende lymfeknuter og bidrar til den hyppige forekomst av lymfeknutemetastase hos kreftpasienter [7] - [9]. Den kjemotaktiske SLC /CCR7 Interaksjonen kan være en mulig mekanisme for induksjon av kreftceller av lymfeknutemetastase og invasjon vev. Denne hypotesen er understøttet av våre funn at høy ekspresjon av CCR7 ble signifikant korrelert med tilstedeværelse av lymfeknutemetastase og invasjon lymfatiske. Sammenhengen mellom ekspresjonen nivået av foxp3 og kliniske karakteristika for de 133 pasienter med magekreft ble også inkludert i den foreliggende undersøkelse. Det var verdt å merke seg at både CCR7 og foxp3 uttrykk var signifikant korrelert med lymfeknutemetastase. Nextly utførte vi lineær korrelasjonsanalyse for å finne en signifikant positiv korrelasjon mellom CCR7 positiv score og intratumoral foxp3 ^{+ Treg celle nummer. Disse resultatene viste at den høye ekspresjon av CCR7 i magekreftceller og store mengder av intratumoral foxp3 + Tregs infiltrering kan spille en avgjørende rolle i lymfeknutemetastase, og derfor påvirke behandlingsresultatene av magekreft.}

Vår studie bekrefter viktigheten av CCR7 uttrykk i magekreftceller og intratumoral foxp3 ^{+ Tregs som prognostiske faktorer, som var korrelert med total overlevelse og lymfeknutemetastase i magekreft, i tråd med tidligere funn [25], [ ,,,0],38]. I denne studien, var det interessant at enten CCR7 uttrykk eller intratumoral foxp3 + tregs ble funnet å være en uavhengig prognostisk faktor i magekreft. Dette er, etter beste overbevisning, den første rapporten som viser at høy CCR7 uttrykk i magekreftceller var parallelt med markert infiltrasjon av intratumoral foxp3 + Tregs i svulsten mikromiljøet. Videre studier vil være nødvendig for å forstå om blokaden av SLC /CCR7 samhandling i kombinasjon med foxp3 + Tregs uttømming kan hemme metastase av mage kreftceller til lymfeknuter, og føre til bedre behandlingsresultatene eller ikke.}

som konklusjon, våre resultater viste at både høy CCR7 ekspresjon i tumorceller og øket intratumoral foxp3 ^{+ Tregs var assosiert med dårligere OS i magekreft, positivt korrelert med hverandre, og kan anses som en ko-indikator for klinisk prognose av magekreft. Basert på dette kan utvikle molekylære mål terapi mot CCR7 og foxp3 være en lovende strategi for kreftbehandling.}

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Uttrykk for CCR7 og foxp3 i normale mage vev. Representative immunostainings for CCR7 og foxp3. Som kontrollene, var det ingen CCR7 uttrykk og svært få foxp3 + Tregs i normale mage vev. Scale bar, 50 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074430.s001 plakater (TIFF)

• PLoS ONE: Helicobacter pylori infeksjon synergizes med tre inflammasjonsrelaterte genetiske varianter i GWASs å øke risikoen for magekreft i en kinesisk Population
• PLoS ONE: Rødt og bearbeidet kjøtt inntak er forbundet med høyere Gastric Cancer Risk: En meta-analyse av epidemiologisk Observasjons Studies