PLoS ONE: MED30 Regulerer spredning og motilitet af Gastric Cancer Cells

Abstrakt

MED30 er en væsentlig medlem af mægleren kompleks, der danner et knudepunkt mellem transkriptionelle aktivatorer og RNA-polymerase II. Men de udtryk og roller MED30 er blevet dårligt karakteriseret i kræft. I denne undersøgelse undersøgte vi de funktionelle roller MED30 under mavekræft progression. Det konstateredes, at MED30 blev overudtrykt i gastrisk cancer væv og cellelinier. Desuden MED30 overekspression øget spredning, migration og invasion af gastriske kræftceller, mens MED30 knockdown hæmmede disse virkninger. Endvidere knockdown signifikant inhiberede tumorigenicitet i SCID-mus. MED30 fremmes også udtrykkene for gener relateret til epitel-mesenkymale overgang og inducerede en fibroblast-lignende morfologi. Denne undersøgelse viser MED30 har patofysiologiske roller i proliferation, migration og invasion af gastrisk kræftceller og foreslår, at MED30 skal ses som en potent terapeutisk mål for malign gastrisk karcinom

Henvisning: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) MED30 Regulerer spredning og motilitet af Gastric Cancer Cells. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10,1371 /journal.pone.0130826

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: September 22, 2014 Accepteret: 26 maj 2015; Udgivet: 25 juni 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Bio & Medicinsk Teknologi Development Program (2012M3A9C6050213) og Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) af National Research Foundation (NRF) finansieret af den koreanske regering (MEST) og en bevilling fra National R &D Program for Cancer Control Ministeriet for sundhed, velfærd og familiespørgsmål, Republikken Korea (0920050). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de førende årsager til kræft død på verdensplan [1, 2]. Ca. 95% af gastrisk kræftformer er adenocarcinomer og i epidemiologiske undersøgelser mavekræft er blevet klassificeret af anatomiske websted som mavemunden /proximal eller noncardia /distalt [3] og ved histologisk fænotype som tarm, diffus, eller blandet /ufordelt som beskrevet af Lauren [4 ]. Endvidere patienter med proksimal gastrisk cancer har dårligere overlevelse uafhængigt af TNM trin [5]. Helicobacter pylori
infektion er blevet påvist at være et ætiologisk agens for gastrisk cancer, især for cancere, der findes i de distale maver af ældre mænd, der normalt af den intestinale type. For nylig er der blevet foreslået flere molekylære klassifikationer af mavekræft baseret på resultaterne af hel-genom genekspressionsstudier og /eller gen-kopi nummer undersøgelser [6-10].

Transkriptionel regulering er et afgørende skridt, der styrer celleidentitet, vækst, differentiering og udvikling. Menneskelig mediator (MED) kompleks, som indeholder ~ 30 proteiner, er et centralt coaktivator /aktivator af udtrykkene for RNA-polymerase II (Pol II) -transcribed gener [11]. MED kompleks letter præ-initieringskompleks (PIC) samling ved interaktion med Pol II og genspecifikke transkriptionsfaktorer (TFS), såsom, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, og TFIIH [12, 13]. MED Komplekset består af tre forskellige strukturelle undermoduler (hoved, midterste og hale). Hovedet modul direkte interagerer med Pol II, mens den aflange hale modulet interagerer med gen-specifikke regulatoriske proteiner [12, 13], og den midterste modul handler i regulatorisk signaloverførsel ved en post-bindende fase [13]. Selvom mekanismen ikke er helt forstået, MED kompleks stramt binder sig til Pol II, ændrer sin kropsbygning og påvirker initiering proces transkription [14, 15]. Da MED komplekset er en væsentlig bestanddel af transskription maskiner, de fleste af underenheder i kernen i MED er nødvendige for embryonale vækst og celle levedygtighed [16].

Kræft genomsekvensering undersøgelser har rapporteret mutationer eller ændringer i RNA transskription maskiner komponenter i mED-subunits, og korrelationer mellem nogle af disse ændringer i mED-subunits, (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8, og cyklin C) og kræft progression er blevet rapporteret for forskellige kræftformer, selvom mekanismer der er ansvarlige for disse korrelationer er ukendte [17].

For nylig blev det rapporteret, at en MED19 kan deltage i gastrisk cancer progression, som dens knockdown signifikant inhiberede celleproliferation og koloni-dannelse kapacitet, og induceret G1-fasen celle-cellecyklusstandsnings i to humane gastrisk cancer cellelinjer (SGC7901 og MGC803) [18]. Men de funktionelle roller og patologisk relevans af andre MED underenheder i mavekræft er fortsat uklare.

I den foreliggende undersøgelse, at afsløre den funktionelle betydning MED30 under mavekræft progression, vi undersøgte sine roller i proliferation, migration, invasion og tumorgenicitet af gastriske kræftceller. Før den funktionelle undersøgelse, kontrolleres vi udtrykket mønster af MED30 i mavekræft celler og væv.

Materialer og metoder

cellekulturer og transfektion

mavekræft cellelinjer (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, og N87) blev købt fra den koreanske cellelinje Bank (Seoul). Celler blev dyrket i RPMI1640 tilsat 25 mM HEPES, 10% føtalt bovint serum (FBS), og 100 ug /ml penicillin /streptomycin (1 × P /S) i 5% CO _{2/95% luft ved 37 ° C. Celler blev transficeret med siRNA hjælp DharmaFECT reagens 1 eller 3 (Dharmacon, Lafayette, CO) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Sekvenserne af siRNA brugte var som følger: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Sydkorea), 5'-CGA GCA ACU UAU UCC AUA U (DTDT) -3 ', 5'-GCU GCC AAA UGG UGU CAC U (DTDT) - 3 ', og 5'-CGA GAA AUU GCU GAA GUA A (DTDT) -3 « scrambled (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5'GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (DTDT) -3 ".}

MED30 overekspression

For at konstruere MED30- overekspression vektor, anvendte vi pLenti6.3-V5 /DEST lentiviral vector (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kort fortalt blev MED30 cDNA klonet i pLenti6.3-V5 /DEST vektor ved anvendelse af in vivo
rekombination-baserede Gateway kloningssystemet (Invitrogen). Donoren vektor (pDONR221) indeholdende den kodende sekvens for MED30 (MED30 cDNA) blev indkøbt fra Ultimate ^{TM ORF Kloner (Invitrogen), og rekombineres med tælleren-selekterbare CCDB
gen af ​​Gateway destination vektor pLenti6.3-V5 /DEST hjælp af CLONASE enzymblandingen LR (Invitrogen). Den tomme vektor pLenti6.3 /V5-DEST blev anvendt som en mock kontrol. Rekombinante lentivira fremstillet i 293FT celler og anvendt til at inficere SNU638 celler i overensstemmelse med producentens instruktioner (ViraPower Lentiviral Expression System; Invitrogen). Stabile cellelinjer blev oprettet ved selektion med blasticidin (7,5 ug /m) (Invitrogen).}

Real-time PCR

mavekræft væv blev opnået efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke fra patienter, som gennemgik kirurgisk resektion ved Pusan ​​National University Hospital eller Pusan ​​nationale Universitet Yangsan Hospital. Undersøgelsen blev godkendt af Pusan ​​Rigshospitalet-Institutional Review Board (PNUH-IRB) og Pusan ​​Nationale Universitet Yangsan Hospital-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Totalt RNA blev ekstraheret fra væv eller celler under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) eller RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev syntetiseret under anvendelse af MMLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI), dNTP, og oligo-dT-primere. Sekvenserne for de anvendte primere var som følger: MED30, 5'- ACC GGT TAA CAA AGC TAC AGG A-3 '(sense) og 5'-TAA GTT GCT CGA CTG GAA TGG G-3' (antisense); CDH1, 5'TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC 3 'og 5'- CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG-3'; CDH2, 5'CAC TGT GGA GCC TGA TGC CA -3 'og 5'TCC CCA ATG TCT CCA GGG TG -3 « CDH3, 5'CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC -3 'og 5'ACG CCA CGC TGG TGA GTT GG -3 « TWIST1, 5'CGG GAG TCC GCA GTC TTA 3 'og 5'- TGG ATC TTG CTC AGC TTG TC-3'; TWIST2, 5'CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT -3 'og 5'TAG CCA AGC AAT CAC GGA GA -3 « VIM, 5'TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G -3 'og 5'TAG CAG CTT CAA CGG CAA AGT TC -3 « SNAI1, 5'GAG GCG GTG GCA GAC TAG -3 "og 5'GAC ACA TCG GTC AGA CCA G -3« SNAI2, 5'TAG GAA GAG ATC TGC CAG AC -3 'og 5'CCC CAA GGC ACA TAC TGT TA -3 « GAPDH, 5'GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT -3 'og 5'TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G -3 ". Real-time PCR blev udført under anvendelse af en LightCycler ^{TM 96 Real-time PCR-system (Roche, Nutley, NJ, USA) med FastStart Essential DNA Green Master (Roche) ifølge producentens instruktioner. GAPDH blev anvendt som intern kontrol.}

Western blot-analyse

Celler blev lyseret med RIPA-buffer, proteaseinhibitor cocktail blev tilsat, og proteinkoncentrationer blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad protein assay kit ( Bio-Rad, Hercules, CA). Prøver (80 ug /brønd) blev underkastet SDS-PAGE og derefter overført til PVDF-membraner. Anti-MED30 (1: 500, Protein Tech.787-1-AP, Chicago, IL), anti-E-cadherin (1: 1000, BD Bioscienceɢ.181, San Jose, CA), anti-N-cadherin (1 : 1000, BD Bioscienceɢ.920), anti-P-cadherin (1: 1000, BD Bioscienceɢ.227), anti-Twist1 /2 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology # sc-15393, Santa Cruz, CA), anti -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Carpentaria, CA) og anti-β-actin (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology # sc-47.778) antistoffer blev fortyndet i 5% skummetmælk og inkuberes med membraner ved 4 ° C natten over. Den passende sekundære antistof blev påført (1: 2000, peberrodsperoxidasekonjugeret anti-muse eller anti-kanin) ved stuetemperatur i 1 time. Kemiluminescensdetektion (GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom) blev anvendt til at visualisere MED30, E-cadherin, N-cadherin, P-cadherin, Twist1, vimentin, og β-actin. Western blot analyse blev udført i tre eksemplarer.

Immunhistokemi

Tissue microarray afsnit med mavekræft væv fra patienter blev opnået fra SuperBiochip (Seoul). Histopatologiske diagnoser blev udført ved Institut for Patologi, Pusan ​​Rigshospitalet, og clinicopathologic iscenesættelse blev udført ved hjælp af TNM klassifikationen (AJCC, 7. udg.). Alle patienter havde histologisk bekræftet gastrisk cancer og tumor prøver blev kontrolleret for at sikre, at tumorvæv sammensat mere end 80% af prøverne. For immunohistokemi blev objektglassene afparaffiniseret og rehydreret, behandlet med 0,3% hydrogenperoxid i 30 min for at standse endogen peroxidaseaktivitet, og blokeret med 10% normalt æsel serum (NDS) og 1% BSA i 1 × phosphatbufret saltvand (PBS). Objektglas blev derefter inkuberet natten over ved 4 ° C i blokeringspuffer indeholdende primære antistof (anti-human MED30, 1:50 Proteintech). Sekundært antistof (HRP-konjugeret) binding blev udført ved en fortynding på 1: 200 i blokeringsbuffer i 2 timer ved stuetemperatur. Objektglas blev derefter farvet for HRP (Vector Laboratories) og modfarvet med hematoxylin farvning puffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 1 min. Procenter af celler, der farvet for MED30 i sektioner blev bestemt, og sektioner blev derefter sorteres ved hjælp af en 1-4 skala (1, < 24%, 2, 25-49%, 3, 50-74%, 4, 75-100% ). Intensiteter af tumorcelle-farvning blev gradueret som 0, 1, 2 eller 3, som svarede til basal, svag, moderat og stærk hhv. Samlet farvning blev derefter repræsenteret ved sammensatte scoringer, der blev beregnet ved at multiplicere disse to kvaliteter. Derfor samlede farves blev gradueret fra 0 til 12.

Cell proliferation assay

For at undersøge effekten af ​​siRNA om spredning af gastriske cancerceller, blev dyrkningsmedier erstattet med 1% FBS medium én dag efter siRNA transfektion. Fem dage efter transfektion blev 10 pi Ez-Cytox (ITSBIO, Seoul) tilsat, og cellerne blev inkuberet i 0,5 til 2 timer under normale dyrkningsbetingelser. absorbansen blev derefter målt ved 450 nm med en ELISA-læser (TECAN, Mannedorf, Schweiz). For at undersøge virkningen af ​​MED30 overekspression blev celler podet i 1% FBS-medium. Tre dage efter podning 10 pi Ez-Cytox blev tilsat.

Boyden kammer assay

Den nederste kammer i et Transwell kammer blev fyldt med medium indeholdende 10% FBS. En dag efter transfektion med scrambled (SCR) eller MED30 siRNA blev gastriske cancerceller podet ind i det øvre kammer ved en densitet på 5 x 10 ^{5 celler /ml i 50 pi serum-frit medium. For at undersøge effekten af ​​MED30 overekspression blev celler (mock og MED30-over) udsået ved en tæthed 1 × 10 5 celler /ml. For at eliminere spredning associerede virkninger, mitomycin C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) blev tilsat. Cellerne fik lov til at migrere i fire eller seks timer. Membraner blev derefter fikseret og farvet ved anvendelse af Diff-quik opløsning (Sysmex, Kobe, Japan) og vasket med destilleret vand. Cell numre i 10 tilfældigt valgte felter blev talt ved hjælp af et lysmikroskop.}

Matrigel invasion assay

evne gastrisk kræftceller til at invadere blev undersøgt ved hjælp af 24-godt BioCoat ^{TM Matrigel TM kammer indsatser (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Den øverste overflade af skær i invasion kamre blev coatet med 0,5 mg /ml vækstfaktor-reduceret Matrigel (BD Bioscience), og den nederste overflade med 0,5 mg /ml fibronectin (Sigma-Aldrich). En dag efter transfektion med SCR eller MED30 siRNA blev celler podet med en tæthed på 5 x 10 4 celler /ml i serumfrit medium i 8 um porøse BioCoat Matrigel kammer skær, og anbragt i brønde fyldt med 750 pi medium suppleret med 10% FBS som en kemoattraktant. For at undersøge effekten af ​​MED30 overekspression, celler (mock og MED30-overekspression celler) blev podet ved en tæthed 1 × 10 4 celler /ml. At fjerne sprednings-associerede virkninger, mitomycin C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) blev tilsat. Efter inkubation i 24 timer blev ikke-invaderende celler på overside af membraner fjernes ved skrabning. Invaderende celler på bundfladerne blev fikseret og farvet med Diff-quik opløsning. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og mindst 5 felter blev talt pr eksperiment.}

xenograft assay

De SNU638 celler blev transficeret med SCR eller MED30 siRNA. Efter 2 dage blev celler opsamlet ved trypsinering, vaskes to gange med PBS, og blev injiceret subkutant (1 × 10 ^{6 celler i 100 pi PBS) i alvorlig kombineret immundefekt (SCID) mus. Tumorvolumener blev beregnet hver uge fra uge tre til uge syv efter injektionen ved hjælp af følgende formel: tumor volumen (mm 3) = ( en
× b
2 ) /2, hvor en
= længde i mm og b
= bredde i mm. På syv uger blev musene aflivet, og tumorvolumener og vægte blev registreret. Dette eksperiment blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr udstedt af National Institute of Health. Den Pusan ​​Nationale Universitet Institutional Animal Care og brug Udvalg (PNUIACUC) godkendte forsøgsprotokollen.}

Statistisk analyse

Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SDS. Den ikke-parametrisk Mann-Whitney U-testen eller t-test (uparret) blev anvendt til bestemmelse betydningerne af forskelle mellem middelværdier for to grupper, og envejs blev anvendt variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukeys multiple sammenligninger at analysere tre eller flere grupper. * Angiver en P
værdi < 0,05. Overlevelse tid blev defineret som tidsrummet mellem behandling og død, eller indtil der blev opnået den sidste målsætning opfølgende oplysninger. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at bestemme forholdet mellem overlevelse og MED30 ekspression. Kurver blev sammenlignet under anvendelse af log-rank test ved et signifikansniveau på 95%. P
værdier af < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Data blev analyseret ved hjælp af SPSS software-version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

Overekspression af MED30 i gastrisk kræft væv

For at undersøge roller spilles ved MED30 i gastrisk kræft, vi først undersøgt udtrykket status MED30 i tumorvæv på 23 mavecancerpatienter. MED30 protein blev fundet at være almindeligt overudtrykt i ondartede vævsområder (Fig 1A-1D) og var tydeligvis overudtrykt i invaderende gastriske cancerceller (fig 1C) og i metastatiske cancerceller inde berørte lymfeknuder (Fig 1D). For at validere vores immunhistokemi resultater, udførte vi kvantitativ real-time PCR på mavekræft væv under anvendelse MED30-specifikke primere. Som vist i fig 1F blev DPY30 overudtrykt i 10 tilfælde (10/23, 43%). Vi undersøgte også udtryk mønster af MED30 i gastrisk cancer cellelinier ved real-time PCR, og fandt det at være overudtrykt i fem af de gastriske cancer celle testet (undtagen SNU1) linjer versus normale gastrisk væv (Fig 1E). For at undersøge korrelationen mellem MED30 ekspression og kliniske karakteristika, udførte vi immunhistokemi under anvendelse 41 gastriske cancer vævsprøver (tabel 1). Interessant nok blev ekspression af MED30 positivt korreleret med N etape (Fig 1G), men ikke med patientens overlevelse (data ikke vist).

Roller MED30 i proliferation, migration og invasion af gastriske kræftceller

for at undersøge roller MED30 i gastrisk carcinogenese, vi undersøgt virkningerne af MED30 knockdown eller overekspression om spredning, migration og invasion af de seks gastrisk cancer cellelinjer (SNU1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638, og NCI -N87 celler). Real-time PCR og western blot blev anvendt til at analysere knockdown og overekspression af MED30 i SNU216 og SNU638 celler (fig 2A-2C). Når disse celler blev transficeret med MED30 siRNA (100 nM), MED30 ekspression mindskes ved proteinet og mRNA-niveauer med omkring 80% to dage senere versus SCR siRNA, og MED30 overekspression af cDNA-transfektion forøgede MED30 mRNA og protein niveauer versus tom kontrol vektor- transficerede celler (mock celler) med mere end 3 gange.

Derefter undersøgte vi, hvilken rolle MED30 i proliferationen af ​​cancerceller. Proliferationsassays blev udført 5 dage efter transfektion med SCR eller MED30 siRNA. Knockdown af MED30 inhiberede de proliferationer af alle testede gastrisk kræftceller (SNU16, SNU216, SNU620, og SNU638) versus SCR med 18%, 68%, 98% og 42%, (fig 2D). Lignende resultater blev observeret, når vi udførte proliferationsassays to eller tre dage efter transfektion (data ikke vist). Konsekvent, MED30 overekspression forbedret de bevoksninger af SNU216 og SNU638 celler med 1,9 og 2,2 gange henholdsvis versus mock celler.

For at bestemme den rolle, som MED30 spillet i migrationen af ​​gastriske kræftceller, brugte vi en Boyden kammer assay. Knockdown af MED30 faldt FBS-inducerede vandringer SNU216 og SNU638 celler med 90% og 52% henholdsvis versus SCR transficerede celler (Fig 3A og 3C). Desuden MED30 overekspression øgede FBS-inducerede migration af SNU216 og SNU638 celler ved 3,2 og 2,8 gange, respektivt, versus mock celler (Fig 3B og 3C). Disse resultater førte os til at undersøge den rolle, MED30 i invasionen af ​​gastriske cancerceller. I en Matrigel invasion assay, MED30 siRNA hæmmede FBS-inducerede invasioner af SNU216 og SNU638 celler versus SCR siRNA med 64% og 47%, henholdsvis (fig 4A og 4C), og MED30 overekspression accelereret de FBS-inducerede invasioner af SNU216 og SNU638 celler versus mock celler ved 2,5 og 2,2 gange henholdsvis (fig 4B og 4C).

effekt af MED30 knockdown på in vivo
tumorgenicitet

for at undersøge effekten af ​​MED30 på tumorvækst, vi injiceret subkutant SNU638 celler transficeret med SCR eller MED30 siRNA i SCID-mus, og derefter overvåget tumorvækst i syv uger (fig 5A). Tydelige tumorer blev fundet inden for tre uger i SCR kontrol sider. Men kræftceller transficeret med MED30 siRNA udstillede lavere vækst. Syv uger efter injektion blev musene aflivet, og tumorvolumener og vægte blev målt (Fig 5B og 5C). Resultaterne viste MED30 Knockdown signifikant reduceret tumor volumen og vægt.

Regulering af EMT vej ved MED30

For at bestemme mekanismen bag fremme af gastrisk carcinogenese ved MED30, vi undersøgte ekspressionsmønstre af gener involveret i epitel-mesenkymale overgang (EMT: en vigtig proces i metastase og invasion) af real-time PCR. Knockdown af MED30 let øget niveauet af E-cadherin (CDH1) mRNA i SNU638 celler versus SCR transfektion, men faldt udtryk for N-cadherin (CDH2), P-cadherin (CDH3) og vimentin (VIM) med 42%, 36% og 41%, (fig 6A). Konsekvent, MED30 overekspression faldt CDH1 mRNA-niveauer med 35% versus mock celler, men steg udtrykkene for N-cadherin (CDH2), P-cadherin (CDH3), twist familie bHLH transcription faktor 1 og 2 (TWIST1 /2), vimentin (VIM) med 2,9, 3,3, 3,4, 2,4, 2,2, og 4,2 gange henholdsvis (figur 6A). MRNA-niveauer af sneglen familie zinkfinger 1 og 2 (SNAI1 /2) var uændrede. Vi bekræftede derefter at MED30 overekspression også øgede proteinniveauer ved E-cadherin, N-cadherin, P-cadherin, Twist1, og vimentin (Fig 6B). En undersøgelse af morfologi SNU638 celler afslørede, at MED30 overekspression udløste en overgang fra en brosten-lignende til en langstrakt fibroblastlignende morfologi (Fig 6C), hvorimod MED30 knockdown ikke ændrede morfologi (data ikke vist). Disse resultater tyder på, at MED30 positivt regulerer EMT.

Diskussion

De funktionelle roller MED subunit MED30 (også kendt som TRAP25) er dårligt forstået. I en nylig rapport, blev MED30 sig at spille en væsentlig rolle i reguleringen af ​​mitokondrie funktioner og integritet i homozygot mus [19]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi de funktionelle roller MED30 under mavekræft progression. Det blev fundet MED30 reguleret spredning, migration og invasion af gastrisk kræftceller og deres in vivo
tumorigenicitet. Efter at have sikret knockdown og overekspression effektivitet ved kvantitativ realtids-PCR og Western blot-analyse (figur 2), fandt vi, at MED30 knockdown bemærkelsesværdigt undertrykt proliferation, migration og invasion af gastriske cancerceller, og at MED30 overekspression havde de modsatte virkninger (fig 2-4). Desuden MED30 knockdown reduceret in vivo
tumorgenicitet (figur 5). Endvidere har vi også fundet, at MED30 blev overudtrykt i gastrisk cancer væv og gastriske cancercellelinier (Fig 1). Disse resultater antyder, MED30 kunne spille vigtige patofysiologiske roller under gastrisk carcinogenese.

Da specifikke MED underenheder er forbundet med signal-aktiverede transkriptionsfaktorer og RNA-polymerase II (Pol II) [20] og fungere som ledninger og integratorer for kanalisering forskellige signalveje, såsom den nukleare hormonreceptor pathway (via MED1) [21], TGF-β-signalvejen (via MED12 eller MED15) [22, 23], Wnt-signalvejen (via MED12) [ ,,,0],24], og den Ras-MAPK signalvej (via MED23) [25-27]. Det blev foreslået, at disse signalveje kan inducere EMT [28-32], som vides at være forbundet med metastase, invasion, proliferation og kemoresistens af epitelcancer [29, 33, 34]. Vi spurgte derfor, om MED30 udløser EMT. MED30 inducerede udtrykkene for EMT-beslægtede gener (N-cadherin; CDH2, P-cadherin; CDH3, twist relateret protein 1 og 2; TWIST1 /2, vimentin, VIM), men inhiberede ekspressionen af ​​E-cadherin (CDH1) a kendt tumorsuppressor (fig 6A og 6B). Endvidere MED30 overekspression inducerede en fibroblastlignende morfologi (fig 6C), hvilket tyder MED30 udløser EMT i gastriske cancerceller.

Sammenfattende den foreliggende undersøgelse støtter den opfattelse, at MED30 virker som et onkogen under gastrisk carcinogenese og foreslår MED30 kunne regulere EMT i mavekræft. Selvom yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme, hvordan MED30 udløser EMT, vores resultater tyder på, at MED30 betragtes som en ny molekylær mål for behandling af mavekræft.

Tak

Dette arbejde blev støttet af Bio & Medicinsk Teknologi Development Program (2012M3A9C6050213) og Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) af National Research Foundation (NRF) finansieret af den koreanske regering (MEST), og ved en bevilling fra National R &D Program for Cancer Control Ministeriet for Sundhed , Velfærd og familiespørgsmål, Republikken Korea (0.920.050).

• PLoS ONE: roller DPY30 i spredning og motilitet af mavekræft Cells
• PLoS ONE: Photoimmunotherapy af mavekræft Peritoneal carcinomatose i en musemodel