PLoS ONE: MED30 Regelt die Proliferation und Motilität des Magen-Krebszellen

Abstrakt

MED30 ist ein wesentliches Element des Mediators Komplex, der eine Drehscheibe zwischen Transkriptionsaktivatoren und RNA-Polymerase II bildet. Allerdings wurden die Ausdrücke und Rollen von MED30 schlecht in Krebs charakterisiert. In dieser Studie untersuchten wir die funktionelle Rolle der MED30 bei Magenkrebs Progression. Es wurde festgestellt, dass MED30 wurde in Magenkrebsgewebe und Zelllinien überexprimiert. Darüber hinaus erhöhte die MED30 Überexpression der Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen, während MED30 Knockdown diese Effekte gehemmt. Des Weiteren die Zuschlags signifikant gehemmt tumorigenicity in SCID-Mäusen. MED30 förderte auch die Ausdrücke von Genen im Zusammenhang mit epithelial-mesenchymale Transition und induziert eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie. Diese Studie zeigt, MED30 pathophysiologische Rolle bei der Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen hat und schlägt vor, dass MED30 sollte als potentes therapeutisches Ziel für bösartige Magenkarzinom

Citation eingesehen werden: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) MED30 Regelt die Proliferation und Motilität des Magen-Krebszellen. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10.1371 /journal.pone.0130826

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Empfangen: 22. September 2014; Akzeptiert: 26. Mai 2015; Veröffentlicht: 25. Juni 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb der Papier

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der Bio &unterstützt wurde; Medical Technology Development Program (2012M3A9C6050213) und Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) der National Research Foundation (NRF) gefördert von der koreanischen Regierung (MEST) und einem Zuschuss von der National R & D-Programm für Cancer Control, Ministerium für Gesundheit, Wohlfahrt und Familienangelegenheiten, Republik Korea (0.920.050). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der führenden Ursachen für Krebstod weltweit [1, 2]. Etwa 95% der Magenkrebs sind Adenokarzinome und in epidemiologischen Studien Magenkrebs wurde von anatomischen Stelle als Cardia /proximal oder noncardia /distal [3] und durch histologische Phänotyp als Darm-, diffus oder gemischt /unklassifizierbare wie von Lauren eingestuft worden [4 ]. Darüber hinaus Patienten mit proximalen Magenkrebs haben schlechteren Überleben unabhängig von TNM-Stadium [5]. Helicobacter pylori
Infektion nachgewiesen wurde eine ätiologische Agens von Magenkrebs zu sein, insbesondere in den distalen Magen von älteren Männern gefunden Krebsarten, die in der Regel der intestinalen Typ sind. In jüngster Zeit wurden mehrere molekulare Klassifikationen von Magenkrebs auf der Grundlage der Ergebnisse des gesamten Genoms Genexpressionsstudien und /oder der Anzahl der Genkopien Studien [6-10].

Transkriptions-Regulierung ist ein entscheidender Schritt, der steuert, vorgeschlagen worden, Zellidentität, Wachstum, Differenzierung und Entwicklung. Menschlichen Vermittler (MED) Komplex, der ~ 30 Proteine ​​enthält, ist ein wichtiger Co-Aktivator /Aktivator der Ausdrücke der RNA-Polymerase II (Pol II) -transcribed Gene [11]. MED Komplexes erleichtert die Präinitiationskomplex (PIC) -Anordnung durch Wechselwirkung mit Pol II und genspezifische Transkriptionsfaktoren (TFs), wie TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF und TFIIH [12, 13]. MED-Komplex besteht aus drei verschiedenen strukturellen Submodule (Kopf, Mitte und Schwanz). Das Kopfmodul interagiert direkt mit Pol II, während der längliche Schwanz-Modul mit Gen-spezifischen regulatorischen Proteinen interagiert [12, 13], und das mittlere Modul wirkt in regulatorischen Signalübertragung bei einer Post-Bindungsstufe [13]. Obwohl der Mechanismus nicht vollständig verstanden wird, MED-Komplex bindet fest an Pol II, ändert sich seine Konformation und wirkt sich auf die Transkriptionsinitiationsprozesses [14, 15]. Da MED-Komplex eine wesentliche Komponente des Transkriptionsmaschinerie, die meisten von Untereinheiten in dem Kern von MED für embryonale Wachstum und die Lebensfähigkeit der Zellen erforderlich ist [16].

Cancer Genomsequenzierungsstudien haben Mutationen oder Veränderungen in der RNA berichtet Transkriptionsmaschinerie Komponenten in MED-Untereinheiten enthalten, und Korrelationen zwischen einigen dieser Veränderungen in der MED-Untereinheiten, (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8 und Cyclin C) und Krebsprogression wurden für verschiedene Krebsarten berichtet, obwohl Mechanismen, die für diese Korrelationen sind nicht bekannt [17].

Vor kurzem wurde berichtet, dass ein MED19 bei Magenkrebs Progression teilnehmen können, wie der Zuschlags signifikant gehemmt Zellproliferation und Koloniebildungsvermögen und induzierte G1-Phase des Zellzyklus Verhaftung in zwei menschlichen Magenkrebszelllinien (SGC7901 und MGC803) [18]. Jedoch bleiben die funktionalen Rollen und pathologische Bedeutung anderer MED-Untereinheiten bei Magenkrebs unklar.

In der vorliegenden Studie, die funktionelle Bedeutung der MED30 bei Magenkrebs Progression zu offenbaren, die wir untersucht seine Rolle bei der Proliferation, Migration, Invasion und Tumorigenität von Magenkrebszellen. Vor der Funktionsprüfung, überprüften wir das Expressionsmuster von MED30 bei Magenkrebs Zellen und Geweben.

Materialien und Methoden

Die Zellkulturen und Transfektion

Magenkrebs-Zelllinien (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 und N87) wurden von der koreanischen Zelllinie Bank (Seoul) erworben. Die Zellen wurden in RPMI1640 kultiviert, supplementiert mit 25 mM HEPES, 10% fötales Rinderserum (FBS) und 100 ug /ml Penicillin /Streptomycin (1 × P /S) in 5% CO _{2/95% Luft bei 37 ° C. Die Zellen wurden transfiziert mit siRNA DharmaFECT Reagenz 1 oder 3 (Dharmacon, Lafayette, CO) verwendet, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Sequenzen der siRNA verwendet wurden, waren wie folgt: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea), 5'-CGA GCA ACU UAU UCC AUA U (dTdT) -3 ', 5'-AVV GCC AAA UGG UGU CAC U (dTdT) - 3 'und 5'-CGA GAA GAA AUU GCU GUA A (dTdT) -3'; Rührei (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5 'GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3'.}

MED30 Überexpression

Um MED30- zu konstruieren über Expressionsvektor verwendeten wir pLenti6.3-V5 /DEST lentiviralen Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kurz gesagt, wurde in pLenti6.3-V5 /DEST Vektor mit dem In-vivo-Rekombination
-basierten Gateway-Klonen System (Invitrogen) MED30 cDNA kloniert. Der Spender-Vektor (pDONR221) wurde im Ultimate gekauft die codierende Sequenz von MED30 (MED30 cDNA) enthält ^{TM ORF-Klone (Invitrogen), und mit dem Gegen wählbar ccdB
Gen des Gateway-Zielvektor rekombiniert pLenti6.3-V5 /DEST mit dem LR Clonase Enzymmischung (Invitrogen). Der leere Vektor pLenti6.3 /V5-DEST wurde als Mock-Kontrolle verwendet. Rekombinante Lentiviren wurden in 293FT Zellen produziert und verwendet SNU638 Zellen zu infizieren, gemäß den Anweisungen des Herstellers (ViraPower Lentivirale Expression System, Invitrogen). Stabile Zelllinien wurden durch Selektion mit Blasticidin (7,5 ug /ml) (Invitrogen) hergestellt.}

Real-time PCR

Magenkrebsgewebe nach Erhalt schriftlicher Einwilligung von Patienten erhalten wurden, die unterzog chirurgische Resektion bei Pusan ​​National University Hospital oder Pusan ​​National University Yangsan Hospital. Die Studie wurde von der Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) und der Pusan ​​National University Yangsan Krankenhaus-Institutional Review Board (PNUYH-IRB) genehmigt. Gesamt-RNA wurde aus Geweben oder Zellen unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen) oder dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) extrahiert, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. cDNA wurde unter Verwendung von MMLV reversen Transkriptase (Promega, Madison, WI), dNTP und oligo-dT-Primern synthetisiert. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt verwendet: MED30, 5'- ACC GGT TAA CAA AGC TAC AGG A-3 '(sense) und 5'-TAA GTT GCT CGA CTG GAA TGG G-3' (Antisense); CDH1, 5 'TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC-3' und 5 'CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG-3'; CDH2, 5 'CAC TGT GGA GCC TGA TGC CA-3' und 5 'TCC CCA ATG TCT CCA GGG TG-3'; CDH3, 5 'CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC-3' und 5 'ACG CCA CGC TGG TGA GTT GG-3'; TWIST1, 5 'CGG GAG TCC GCA GTC TTA-3' und 5 'TGG ATC TTG CTC AGC TTG TC-3'; Twist2, 5 'CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT-3' und 5 'TAG CCA AGC AAT CAC GGA GA-3'; VIM, 5 'TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G-3' und 5 'TAG CAG CTT CAA CGG CAA AGT TC-3'; SNAI1, 5 'GAG GCG GTG GCA GAC TAG 3' und 5 'GAC ACA TCG GTC AGA CCA G-3'; SNAI2, 5 'TAG GAA GAG ATC TGC CAG AC-3' und 5 'CCC CAA GGC ACA TAC TGT TA-3'; GAPDH, 5 'GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT-3' und 5 'TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G-3'. Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung eines LightCycler ^{TM 96 Echtzeit-PCR-System durchgeführt (Roche, Nutley, NJ, USA) mit Faststart DNA Wesentliche Grün Master (Roche) gemäß der Anleitung des Herstellers. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet.}

Western-Blot-Analyse

Die Zellen mit RIPA-Puffer wurden, wurde Protease-Inhibitor-Cocktail gegeben und Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bio-Rad-Protein-Assay-Kits bestimmt ( Bio-Rad, Hercules, CA). Proben (80 &mgr; g /Vertiefung) wurden einer SDS-PAGE unterzogen und dann auf PVDF-Membranen überführt. Anti-MED30 (1: 500, Protein Tech§87-1-AP, Chicago, IL), Anti-E-Cadherin (1: 1000, BD Bioscienceɢ181, San Jose, CA), Anti-N-Cadherin (1 1000, BD Bioscienceɢ920), Anti-P-Cadherin (1: 1000, BD Bioscienceɢ227), Anti-TWIST1 /2 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology # sc-15393, Santa Cruz, CA), Anti -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Carpentaria, CA) und Anti-β-Actin (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology # sc-47778) Antikörper wurden bei 4 ° C mit Membranen in 5% Magermilch und inkubiert verdünnt über Nacht. Die geeignete sekundäre Antikörper angewendet wurde (1: 2000, Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus oder Anti-Kaninchen) bei Raumtemperatur für 1 Std. Chemolumineszenznachweise (GE Health Care, Little Chalfont, Vereinigtes Königreich) wurde verwendet, MED30, E-Cadherin, N-Cadherin, P-Cadherin, TWIST1, Vimentin und β-Actin zu visualisieren. Western-Blot-Analyse wurde dreifach durchgeführt.

Immunhistochemie

Tissue Microarray-Abschnitte Magenkrebsgewebe von Patienten enthielten, wurden aus SuperBiochip erhalten (Seoul). Die histopathologische Diagnosen wurden am Institut für Pathologie, Pusan ​​National University Hospital durchgeführt und klinisch-pathologische Inszenierung wurde mit der TNM-Klassifikation durchgeführt (AJCC, 7. Aufl.). zusammengesetzt mehr als 80% der Proben Alle Patienten hatten histologisch Magenkrebs bestätigt und Tumorproben wurden überprüft, um das Tumorgewebe gewährleisten. Für die Immunhistochemie wurden die Objektträger entparaffiniert und rehydriert, behandelt mit 0,3% Wasserstoffperoxid für 30 Minuten, um endogene Peroxidase-Aktivität und blockiert mit 10% normalem Eselserum (NDS) und 1% BSA in 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) quenchen. Die Objektträger wurden dann über Nacht bei 4 ° C inkubiert, in Blockierungspuffer mit primären Antikörper (anti-human MED30; 1:50 Proteintech). 200 in Blockierungspuffer für 2 h bei RT: Sekundär-Antikörper (HRP-konjugiertem) Bindung wurde bei einer Verdünnung von 1 durchgeführt. Die Objektträger wurden dann gebeizt für HRP (Vector Laboratories) und mit Hämatoxylin gegengefärbt Färbepuffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) für 1 min. Prozentsätze von Zellen, die für MED30 gefärbten abschnitts bestimmt wurden, und Abschnitte wurden dann eine abgestufte Skala von 1-4 (1, < 24%, 2, 25-49%, 3, 50-74%, 4, 75-100% ). Intensities von Tumorzellfärbung wurden als 0, 1, 2 oder 3 eingestuft, was zu basalen entsprach, schwach, mittel und stark sind. Gesamt Färbung wurde dann durch Verbund Noten dargestellt, die durch Multiplikation dieser beiden Klassen berechnet. Dementsprechend wurde

Zellproliferationsassays
von 0 bis 12 insgesamt gefärbt abgestuft

Um die Wirkung von siRNA auf die Proliferation von Magenkrebszellen untersuchen, Kulturmedien wurden mit 1% FBS-Medium ersetzt Tag nach der siRNA-Transfektion. Fünf Tage nach der Transfektion wurden 10 ul Ez-Cytox (ITSBIO, Seoul) wurde zugegeben, und die Zellen wurden für 0,5 bis 2 h unter normalen Kulturbedingungen inkubiert. Dann wurde die Absorption bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Reader (TECAN, Männedorf, Schweiz) gemessen. Um die Wirkung der MED30 Überexpression zu untersuchen, wurden die Zellen in 1% FBS-Medium ausgesät. Drei Tage nach der 10 ul Ez-Cytox Impfen wurde hinzugefügt.

Boyden-Kammer-Assay

Die untere Kammer einer Transwell Kammer gefüllt wurde mit Medium, das 10% FBS enthält. Einen Tag nach der Transfektion mit verwürfelt (SCR) oder MED30 siRNA, wurden Magenkrebszellen ausgesät in die obere Kammer mit einer Dichte von 5 x 10 ^{5 Zellen /ml in 50 ul serumfreiem Medium. Um die Auswirkungen der MED30 Überexpression, Zellen (mock und MED30-over) untersuchen wurden in einer Dichte 1 x 10 5 Zellen /ml ausgesät. Proliferation assoziiert Effekte, Mitomycin C (0,01 &mgr; g /ml, Sigma-Aldrich) zugegeben beseitigen. Die Zellen wurden für vier oder sechs Stunden wandern kann. Die Membranen wurden dann fixiert und gefärbt mit Diff-Quik-Lösung (Sysmex, Kobe, Japan) und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Zellzahlen in 10 zufällig ausgewählten Feldern wurden mit einem Lichtmikroskop gezählt.}

Matrigel Invasionstest

Die Fähigkeit von Magenkrebszellen untersucht einzufallen mit 24-Well BioCoat ^{TM Matrigel TM Kammereinsätze (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Die obere Oberfläche der Einsätze in Invasionskammern wurden mit 0,5 mg /ml Wachstumsfaktor reduziert Matrigel (BD Bioscience) und der Bodenfläche mit 0,5 mg /ml Fibronectin (Sigma-Aldrich) beschichtet. Einen Tag nach der Transfektion mit SCR oder MED30 siRNA, Zellen wurden in einer Dichte von 5 ausgesät × 10 4 Zellen /ml in serumfreiem Medium in 8-um poröse BioCoat Matrigel Kammereinsätze, und platziert in Vertiefungen mit 750 &mgr; l gefüllt Medium mit 10% FBS als chemoattractant ergänzt. Um die Auswirkungen der MED30 Überexpression, Zellen (mock und MED30-überexprimierenden Zellen) untersuchen wurden in einer Dichte 1 x 10 ausgesät 4 Zellen /ml. Proliferationsassoziierten Effekte, Mitomycin C (0,01 &mgr; g /ml, Sigma-Aldrich) zugegeben entfernen. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden, nicht eindringenden Zellen auf Oberflächen von Membranen wurden durch Schaben entfernt. Eindringenden Zellen auf Bodenflächen wurden fixiert und mit Diff-Quik-Lösung. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und mindestens 5 Feldern pro Experiment wurden gezählt.}

Xenograft-Test

Die SNU638 Zellen wurden mit SCR oder MED30 siRNA transfiziert. Nach 2 Tagen wurden durch Trypsinisierung gesammelt, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und wurden subkutan (1 × 10 ^{6 Zellen in 100 &mgr; l PBS) in severe combined immunodeficiency (SCID) Mäuse injiziert. Tumorvolumen (mm 3) = ( ein
× b
2: Die Tumorvolumina wurden jede Woche von Woche drei bis sieben Wochen nach der Injektion mit der folgenden Formel berechnet ) /2, wobei ein
= Länge in mm und b
= Breite in mm. An sieben Wochen wurden die Mäuse getötet und die Tumorvolumina und Gewichte wurden aufgezeichnet. Dieses Experiment wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren herausgegeben vom National Institute of Health durchgeführt. Die Pusan ​​National University Institutional Animal Care und Use Committee (PNUIACUC) genehmigt das Versuchsprotokoll.}

Die statistische Analyse

Die Ergebnisse werden dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichungen. Die nichtparametrischer Mann-Whitney-U-Test oder der t-Tests von Student (ungepaarten) wurde verwendet, um die Wertigkeiten der Unterschiede zwischen den Mittelwerten der beiden Gruppen zu bestimmen, und eine Einwegvarianzanalyse (ANOVA) durch Tukey multiple Vergleiche gefolgt wurde verwendet, drei oder mehr Gruppen zu analysieren. * Zeigt ein P
Wert von < 0,05. Die Überlebenszeit wurde als die Zeit zwischen Behandlung und Tod oder bis das letzte Ziel Follow-up-Informationen abgelaufen definiert wurde erhalten. Die Kaplan-Meier-Methode wurde verwendet, um die Beziehung zwischen Überleben und MED30 Ausdruck zu bestimmen. Die Kurven wurden mit dem Log-Rank-Test auf einem Signifikanzniveau von 95% verglichen. P
Werte von < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Daten wurden mit SPSS-Software Version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) analysiert.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Rollen von DPY30 in der Proliferation und Motilität des Magen-Krebs Cells
• PLoS ONE: Photoimmunotherapy von Magenkrebs Peritonealkarzinose in einer Maus Model