PLoS ONE: MED30 Säätelee leviämisen ja Liikkuvuus mahasyövän Cells

tiivistelmä

MED30 on olennainen jäsen välittäjänä monimutkainen, joka muodostaa navan väliin transkription aktivaattoreita ja RNA-polymeraasi II. Kuitenkin ilmaisuja ja roolit MED30 on huonosti tunnettu syöpää. Tässä tutkimuksessa selvitimme toiminnalliset roolit MED30 aikana mahalaukun syövän etenemisessä. Todettiin, että MED30 oli yli-ilmentynyt mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa. Lisäksi MED30 yliekspressio lisäsi proliferaatiota, migraatiota, ja invaasion mahasyövän solujen, kun taas MED30 knockdown esti nämä vaikutukset. Lisäksi Knockdown esti merkitsevästi kasvainten muodostumiseen SCID-hiirissä. MED30 edistetään myös ilmaisuja liittyvien geenien epiteelin-mesenkymaalitransitioon ja indusoi fibroblastien kaltainen morfologia. Tämä tutkimus osoittaa, MED30 on patofysiologisia rooleja solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion mahasyövän solujen ja ehdottaa, että MED30 olisi pidettävä voimakas terapeuttinen tavoite malignin mahakarsinoo-

Citation: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) MED30 Säätelee leviämisen ja Liikkuvuus mahasyövän Cells. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10,1371 /journal.pone.0130826

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 22 syyskuu 2014; Hyväksytty: 26 toukokuu 2015; Julkaistu: 25 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Bio & Medical Technology Development Program (2012M3A9C6050213) ja Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) National Research Foundation (NRF) rahoittama Korean hallitus (MEST) ja avustusta National R &D Program for Cancer Control terveysministeriö, hyvinvoinnin ja perheasiain, Korean tasavalta (0920050). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi johtavista syistä syövän kuoleman maailmanlaajuisesti [1, 2]. Noin 95% mahasyövistä ovat adenokarsinoomia ja epidemiologisissa tutkimuksissa mahasyövässä on luokitellut anatomiset sivuston cardia /proksimaalinen tai noncardia /distaalinen [3] ja histologiset fenotyyppiä kuten suoliston, hajanainen, tai seka /unclassifiable kuvatulla Lauren [4 ]. Lisäksi potilailla, joilla on proksimaalinen mahalaukun syövän huonompi selviytyminen riippumaton TNM [5]. Helicobacter pylori
infektio on osoitettu olevan etiologinen aine mahalaukun syövän, erityisesti syöpien löytyy distaalisessa vatsat iäkkäillä miehillä, jotka ovat yleensä suolen tyyppiä. Viime aikoina useat molekyyli- luokitukset mahasyövän on ehdotettu perustuu havaintoihin koko genomin geenien ilmentyminen tutkimukset ja /tai geenikopiomäärä tutkimuksissa [6-10].

kopioinnin säätely on ratkaiseva askel, joka ohjaa solun identiteetti, kasvuun, erilaistumiseen, ja kehitys. Ihmisen välittäjänä (MED) kompleksi, joka sisältää ~ 30 proteiineja, on avain koaktivaattorikompleksien /aktivaattori ilmaisujen RNA polymeraasi II (Pol II) -transcribed geenejä [11]. MED kompleksi helpottaa ennalta initiaatiokompleksin (PIC) kokoonpano vuorovaikutus Pol II ja geenispesifistä transkriptiotekijöiden (TF: t), kuten TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, ja TFIIH [12, 13]. MED kompleksi koostuu kolmesta erillisestä rakenteellisten alimoduulit (pää, keski, ja häntää). Pää moduuli suoraan vuorovaikutuksessa Pol II, kun taas pitkänomainen hännän moduuli vuorovaikutuksessa geenispesifiseen säätelyproteiineja [12, 13], ja keskimmäinen moduuli toimii sääntelyä siirtää signaalin at post-sitova vaiheessa [13]. Vaikka mekanismia ei täysin ymmärretä, MED monimutkainen tiukasti sitoutuu Pol II, muuttaa rakenne ja vaikuttaa transkription aloitusta prosessi [14, 15]. Koska MED kompleksi on olennainen osa transkription koneiden, useimmat alayksiköiden ytimessä MED tarvitaan alkion kasvun ja solujen elinkelpoisuus [16].

Syöpä Genomikartoituksen tutkimuksissa on raportoitu mutaatioita tai muutoksia RNA transkriptio koneen komponenttien sisältämien MED alayksiköissä, ja korrelaatioita joitakin näistä muutoksista MED alayksiköissä, (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8, ja sykliini C) ja syövän etenemistä on raportoitu erilaisiin syöpiin, vaikka vastaavat elimistön nämä korrelaatiot ovat tuntemattomia [17].

Äskettäin kerrottiin, että MED19 voivat osallistua mahalaukun syövän etenemisessä, sillä sen knockdown esti merkitsevästi solujen lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostumista kapasiteettia, ja aiheuttama G1 vaiheen solusyklin pidätyksen kahdessa ihmisen mahasyövän solulinjoissa (SGC7901 ja MGC803) [18]. Kuitenkin toiminnallisten roolien ja patologinen merkitys muiden MED alayksiköiden mahasyövän jäävät epäselviksi.

Tässä tutkimuksessa, paljastaa toiminnallista merkitystä MED30 aikana mahalaukun syövän etenemisessä, tarkastelimme sen roolit solujen lisääntymisen, migraation invaasio ja kasvainten muodostumiseen mahalaukun syöpäsoluja. Ennen toiminnallinen tutkiminen, tarkastetaan ekspressiokuviota MED30 mahasyövän soluja ja kudoksia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät ja transfektio

Mahalaukun syöpäsolulinjoissa (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, ja N87) ostettiin Korean Cell Line Bank (Seoul). Soluja viljeltiin RPMI1640-täydennetty 25 mM HEPES, 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ja 100 ug /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (1 x P /S), 5% CO _{2/95% ilmaa 37 ° C: ° C. Solut transfektoitiin siRNA: lla käyttäen DharmaFECT reagenssia 1 tai 3 (Dharmacon, Lafayette, CO), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sekvenssit siRNA olivat seuraavat: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea), 5'-CGA GCA ACU UAU UCC AUA U (dTdT) -3 ', 5'-GCU GCC AAA UGG UGU CAC U (dTdT) - 3 ', ja 5'-CGA GAA AUU GCU GAA GUA A (dTdT) -3'; salattu (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5'- GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 ".}

MED30 yliekspressio

Jotta rakentaa MED30- yli ekspressiovektoria, käytimme pLenti6.3-V5 /DEST lentivirusvektorilla (Invitrogen, Carlsbad, CA). Lyhyesti, MED30 cDNA kloonattiin pLenti6.3-V5 /DEST vektoriin käyttäen in vivo
rekombinaation-pohjainen Gateway kloonaus järjestelmä (Invitrogen). Luovuttaja-vektoria (pDONR221), joka sisältää koodaavan sekvenssin MED30 (MED30 cDNA) hankittiin Ultimate ^{TM ORF Clones (Invitrogen), ja yhdistettiin laskuri valittavissa ccdB
geenin Gateway kohde vektori pLenti6.3-V5 /DEST käyttäen LR klonaasia entsyymi seoksessa (Invitrogen). Tyhjän vektorin pLenti6.3 /V5-DEST käytettiin mock ohjaus. Rekombinantti lentivirukset tuotettiin 293FT soluissa, ja käytettiin infektoimaan SNU638 soluista valmistajan ohjeiden mukaisesti (ViraPower Lentivirusvektorikonstruktit Expression System, Invitrogen). Vakaa solulinjat perustettiin selektoimalla blastisidiinia (7,5 ug /ml) (Invitrogen).}

Reaaliaikainen PCR

Mahasyöpää kudokset saatiin saatuaan kirjallinen lupa potilailta, joille tehtiin kirurginen resektio at Pusan ​​National University Hospital tai Pusan ​​National University Yangsan Hospital. Tutkimuksen hyväksyi Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) ja Pusan ​​National University Yangsan Hospital-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Kokonais-RNA uutettiin kudoksista tai soluista käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) tai RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin käyttäen MMLV käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI), dNTP: tä, ja oligo-dT-alukkeita. Sekvenssit käytetyt alukkeet olivat seuraavat: MED30, 5'- ACC GGT TAA CAA AGC TAC AGG -3 '(sense) ja 5'- TAA GTT GCT CGA CTG GAA TGG G -3' (antisense); CDH1, 5'- TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC -3 'ja 5'CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG -3'; CDH2, 5'- CAC TGT GGA GCC TGA TGC CA -3 'ja 5'- TCC CCA ATG TCT CCA GGG TG -3'; CDH3, 5'- CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC -3 'ja 5'- ACG CCA CGC TGG TGA GTT GG -3'; TWIST1, 5'- CGG GAG TCC GCA GTC TTA -3 'ja 5'- TGG ATC TTG CTC AGC TTG TC -3'; TWIST2, 5'- CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT -3 'ja 5'TAG CCA AGC AAT CAC GGA GA -3'; VIM, 5'- TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G -3 'ja 5'TAG CAG CTT CAA CGG CAA AGT TC -3'; SNAI1, 5'- GAG GCG GTG GCA GAC TAG -3 'ja 5'- GAC ACA TCG GTC AGA CCA G -3'; SNAI2, 5'- TAG GAA GAG ATC TGC CAG AC -3 'ja 5'- CCC CAA GGC ACA TAC TGT TA -3'; GAPDH, 5'- GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT -3 'ja 5'- TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G -3'. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen LightCycler ^{TM 96 Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Roche, Nutley, NJ, USA) FastStart Essential DNA Green Master (Roche) mukaan valmistajan ohjeiden. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina.}

Western blot-analyysi

Solut lyysattiin RIPA-puskurilla, proteaasiestäjäseostabletit lisättiin, ja proteiinin konsentraatiot määritettiin käyttämällä Bio-Rad proteiinimäärityksellä kit ( Bio-Rad, Hercules, CA). Näytteet (80 ug /kuoppa) tehtiin SDS-PAGE ja sen jälkeen siirrettiin PVDF-membraaneille. Anti-MED30 (1: 500, Protein Tech§87-1-AP, Chicago, IL), anti-E-kadheriini (1: 1000, BD Bioscienceɢ181, San Jose, CA), anti-N-kadheriinin (1 : 1000, BD Bioscienceɢ920), anti-P-kadheriini (1: 1000, BD Bioscienceɢ227), anti-Twist1 /2 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology # sc-15393, Santa Cruz, CA), anti- -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Carpentaria, CA) ja anti-β-aktiini (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology # sc-47778) vasta-aineet laimennettiin 5% rasvatonta maitoa, ja inkuboitiin kalvojen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Sopivan sekundäärisen vasta-ainetta (1: 2000, piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri tai anti-kani) huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Kemiluminesenssidetektiolla (GE Healthcare, Little Chalfont, Iso-Britannia) käytettiin visualisoimaan MED30, E-kadheriinin, N-kadheriinin, P-kadheriinin, Twist1, vimentiinin, ja β-aktiini. Western blot -analyysi suoritettiin kolmena kappaleena.

immunohistokemia

Tissue microarray kohdat sisältävät mahasyövän kudoksia potilailta saatiin SuperBiochip (Seoul). Histopatologisten diagnoosit tehtiin patologian osaston, Pusan ​​National University Hospital, ja ennusteeseen viittaavia lavastus suoritettiin käyttäen TNM luokittelu (AJCC, 7th ed.). Kaikki potilaat olivat histologisesti vahvistettu mahasyövän, ja kasvaimen tarkastettiin sen varmistamiseksi, että kasvainkudoksen koostuu yli 80% näytteistä. Immunohistokemiaa, kalvot poistettiin parafiini ja rehydratoitiin, käsiteltiin 0,3% vetyperoksidia 30 minuuttia sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus, ja blokattiin 10% normaalia aasi seerumia (NDS) ja 1% BSA: ta 1 x fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Leikkeitä inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: ssa estopuskurilla, joka sisälsi primäärisenä vasta-aineena (anti-ihmisen MED30, 01:50, Proteintech). Sekundaarinen vasta-aine (HRP-konjugoitua) sitoutuminen suoritettiin laimennoksena 1: 200 estopuskurissa 2 h RT: ssa. Objektilasit värjättiin sitten HRP (Vector Laboratories) ja vastavärjättiin hematoksyliinillä värjäyspuskurilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 1 min. Prosenttiosuudet solujen värjätään MED30 kohdissa määritettiin ja osat arvioitiin sitten käyttäen 1-4 asteikkoa (1, < 24%, 2, 25-49%, 3, 50-74%, 4, 75-100% ). Intensiteetit kasvainsolun värjäys luokiteltiin 0, 1, 2 tai 3, joka vastasi pohjapinta, heikko, kohtalainen, ja vahva vastaavasti. Kaiken kaikkiaan värjäytyminen sitten edustaa komposiitti tulokset, jotka lasketaan kertomalla nämä kaksi laatua. Näin ollen, kaiken värjättiin luokiteltiin 0 12.

Soluproliferaatiomääritys

vaikutuksen tutkimiseksi siRNA proliferaatioon mahalaukun syövän solujen viljelyalustassa korvattiin 1% FBS: ia yhdessä jälkeisenä päivänä siRNA transfektion. Viisi päivää transfektion jälkeen, 10 ui Ez-Cytox (ITSBIO, Seoul) lisättiin ja soluja inkuboitiin 0,5-2 tuntia normaaleissa viljelyolosuhteissa. Sitten absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä käyttäen ELISA-lukijaa (TECAN, Mannedorf, Sveitsi). Jotta voidaan tutkia vaikutuksen MED30 yli-ilmentymisen, soluja siirrostettiin 1% FBS: ia. Kolmen päivän kuluttua kylvö 10 ui Ez-Cytox lisättiin.

Boyden kammion määritys

pohja kamari siirtokuoppaan kammio täytettiin alustalla, joka sisälsi 10% FBS. Yksi päivä transfektion jälkeen salattu (SCR) tai MED30 siRNA, mahalaukun syövän solut ympättiin ylempään kammioon tiheyteen 5 x 10 ^{5 solua /ml 50 ul: aan seerumia. Tutkia vaikutuksia MED30 yli-ilmentymisen, solujen (mock ja MED30-over) ympättiin tiheydellä 1 x 10 5 solua /ml. Poistamaan leviämisen liittyvät vaikutukset, mitomysiini C: llä (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) lisättiin. Solujen annettiin kulkeutua neljä tai kuusi tuntia. Sitten kalvot kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen Diff-quik liuosta (Sysmex, Kobe, Japan), ja pestiin tislatulla vedellä. Solumäärät 10 satunnaisesti valittua kenttiä laskettiin valomikroskoopilla.}

Matrigel invaasiomääritys

Kyky mahalaukun syövän solujen hyökätä tutkittiin käyttämällä 24-kuoppaista BioCoat ^{TM Matrigel TM kammio insertit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Yläpinta inserttien hyökkäyksen kammiot päällystettiin 0,5 mg /ml kasvutekijä vähentää matrigeeliin (BD Bioscience), ja alapinnan, jossa 0,5 mg /ml fibronektiiniä (Sigma-Aldrich). Yksi päivä transfektion jälkeen SCR tai MED30 siRNA, solut ympättiin tiheydellä 5 x 10 4 solua /ml seerumivapaassa väliaineessa 8 um huokoinen BioCoat Matrigel kammion insertit ja sijoitetaan kuoppaa täytettyinä 750 ui keskipitkän täydennetty 10% FBS: ää, kuten kemoattraktantti. Tutkia vaikutuksia MED30 yli-ilmentymisen, soluja (mock ja MED30 yli-ilmentäviä soluja) ympättiin tiheydellä 1 x 10 4 solua /ml. Poistaminen leviämisen liittyville, mitomysiini C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) lisättiin. Inkuboitiin 24 tuntia, ei-tunkeutuvat soluihin päälle pinnoille kalvot poistettiin kaapimalla. Tunkeutuvat solut alhaalla pinnoille kiinnitettiin ja värjättiin Diff-quik ratkaisu. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena, ja vähintään 5 aloilla laskettiin koetta kohti.}

Vieraslajisiirteen määritys

SNU638 Solut transfektoitiin SCR tai MED30 siRNA. Jälkeen 2 päivää, solut kerättiin trypsinoimalla, pestiin kahdesti PBS: llä, ja ne injektoitiin subkutaanisesti (1 x 10 ^{6 solua 100 ul: ssa PBS: ssä) otetaan vaikea sekamuotoinen immuunivajavuus (SCID) hiirillä. Kasvaintilavuudet laskettiin viikoittain viikosta kolmeen viikkoon seitsemän pistoksen jälkeen käyttäen seuraavaa kaavaa: kasvaimen tilavuus (mm 3) = (
× b
2 ) /2, jossa
= pituus mm ja b
= leveys mm. Seitsemän viikon kuluttua hiiret tapettiin ja kasvaimen tilavuutta ja painot kirjattiin. Tämä koe suoritettiin noudattaen täysin suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals antamien National Institute of Health. Pusan ​​National University Institutional Animal Care ja Käytä komitea (PNUIACUC) hyväksyi koesuunnitelmalla.}

Tilastollinen

Tulokset esitetään keskiarvoina ± SDS. Parametrisella Mann-Whitneyn U-testiä tai Studentin t-testiä (pariton), käytettiin määrittämään merkitykset välisten erojen keskiarvoista kaksi ryhmää, ja yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Tukey monivertai- käytettiin analysoimaan kolme tai useampia ryhmiä. * Tarkoittaa P
arvo < 0,05. Elinaika määriteltiin välinen aika hoidon ja kuoleman tai kunnes viime tavoite seurantatiedot saatiin. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin määrittämään suhdetta selviytymisen ja MED30 ilmaisun. Käyrät verrattiin käyttäen log-rank-testiä, jonka merkitys on 95%. P
arvoja < 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä. Aineisto analysoitiin SPSS ohjelmistoversio 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Tulokset

yli-ilmentyminen MED30 mahasyövän kudoksissa

Tutkia roolit by MED30 mahasyövän, ensin tarkasteltiin ilmentymisen tilan MED30 kasvainkudoksessa 23 mahasyöpäpotilaista. MED30 proteiinin havaittiin laajalti yli-ilmentynyt syöpäkudoksessa alueilla (kuvio 1A-1D), ja ilmeisesti yli-ilmentynyt tunkeutuvat mahasyövän soluissa (kuvio 1C) ja metastaattisessa syöpäsolut sisällä vaikuttaa imusolmukkeiden (kuvio 1 D). Voidakseen vahvistaa meidän immunohistokemia tuloksia, suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: mahasyövän kudoksiin käyttämällä MED30 alukkeita. Kuten on esitetty kuviossa 1F, DPY30 oli yli-ilmentynyt 10 tapauksessa (10/23, 43%). Tutkimme myös ekspressiokuviota MED30 mahasyövän solulinjoissa reaaliaikaisella PCR, ja todennut sen yliekspressoituvan viidessä mahasyövän testatuissa solulinjoissa (paitsi SNU1) ja normaalissa mahalaukun kudoksissa (kuvio 1 E). Tutkia korrelaatio MED30 ilmaisun ja kliinisiä piirteitä, teimme immunohistokemialla käyttämällä 41 mahasyövän kudosnäytteistä (taulukko 1). Mielenkiintoista, ilmaus MED30 korreloi positiivisesti N vaiheessa (kuvio 1 G), mutta ei potilaan selviytymistä (tuloksia ei ole esitetty).

roolit MED30 että solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen

tutkia roolit MED30 vuonna mahasyövän, tutkimme vaikutuksia MED30 knockdown tai yli-ilmentyminen on solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion kuusi mahasyövän solulinjoissa (SNU1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638, ja NCI -N87 solut). Reaaliaikainen PCR ja western blot käytettiin analysoimaan knockdown ja yli-ilmentyminen MED30 vuonna SNU216 ja SNU638 soluja (kuvio 2A-2C). Kun nämä solut transfektoitiin MED30 siRNA (100 nM), MED30 ilmentyminen väheni proteiini- ja mRNA-tasoja noin 80% kaksi päivää myöhemmin vastaan ​​SCR siRNA, ja MED30 yliekspressio cDNA transfektion lisääntynyt MED30 mRNA: ta ja proteiinia tasot verrattuna tyhjään ohjaus vektori- transfektoituja soluja (mock-solut) yli 3-kertaiseksi.

tutkimme seuraavaksi roolia MED30 että syöpäsolujen lisääntymistä. Proliferaatiomääritykset suoritettiin 5 päivän transfektion SCR tai MED30 siRNA. Knockdovvn MED30 esti proliferaatiot kaikkien mahalaukun syövän solut testattiin (SNU16, SNU216, SNU620, ja SNU638) verrattuna SCR 18%, 68%, 98%, ja 42%, vastaavasti (kuvio 2D). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, kun suoritetaan lisääntymismäärityksissä kaksi tai kolme päivää transfektion jälkeen (tuloksia ei ole esitetty). Johdonmukaisesti, MED30 yli-ilmentyminen tehosti kasvaimet SNU216 ja SNU638 solut 1,9 ja 2,2 kertaiseksi, verrattuna mock soluja.

määrittämiseksi roolia MED30 maahanmuuttoprosessissa mahalaukun syövän soluja, käytimme Boyden kammio määritys. Knockdovvn MED30 laski FBS aiheuttama vaellukset SNU216 ja SNU638 soluissa 90% ja 52%, vastaavasti, verrattuna SCR transfektoidut solut (kuvio 3A ja 3C). Lisäksi MED30 yliekspressio lisäsi FBS aiheuttamaa kulkeutumista SNU216 ja SNU638 solut 3,2 ja 2,8 kertaiseksi, verrattuna mock-soluissa (kuvio 3B ja 3C). Nämä tulokset johtivat meidät tutkimaan roolia MED30 vuonna hyökkäyksen mahalaukun syöpäsoluja. Matrigel invaasiomääritys, MED30 siRNA esti FBS aiheuttama hyökkäykset SNU216 ja SNU638 soluja versus SCR siRNA 64% ja 47%, vastaavasti (kuvio 4A ja 4C), ja MED30 yli-ilmentyminen nopeuttanut FBS aiheuttama hyökkäykset SNU216 ja SNU638 solujen versus mock solut 2,5 ja 2,2 kertaiseksi (kuvio 4B ja 4C).

vaikutus MED30 knockdown on in vivo
kasvainten muodostumiseen

vaikutuksen tutkimiseksi MED30 on kasvaimen kasvua, me ihon alle injektoidaan SNU638 transfektoitujen solujen SCR tai MED30 siRNA SCID hiiriin, ja sitten tarkkaillaan kasvaimen kasvua seitsemän viikon ajan (kuvio 5A). Kouraantuntuva kasvaimia havaittiin kolmen viikon kuluessa SCR valvonta puolin. Kuitenkin syöpäsolut transfektoitu MED30 siRNA näytteillä hitaampi kasvu. Seitsemän viikkoa injektion jälkeen, hiiret tapettiin, ja kasvainten ja painot mitattiin (kuvio 5B ja 5C). Tulokset osoittivat MED30 Knockdown vähensi kasvainten ja painot.

asetukseen EMT-reitin MED30

Voit selvittää taustalla oleva mekanismi edistämistä mahasyövän mukaan MED30, tutkimme ilmentymiskuviot geenien mukana epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT: keskeinen prosessi etäpesäkkeitä ja invaasiota) reaaliaikaisella PCR: llä. Knockdovvn MED30 hieman lisääntynyt taso E-kadheriinin (CDH1) mRNA SNU638 soluissa verrattuna SCR transfektio, mutta laski ilmauksia N-kadheriinin (CDH2), P-kadheriinin (CDH3) ja vimentiinista (VIM) 42%, 36% ja 41%, vastaavasti (kuvio 6A). Johdonmukaisesti, MED30 yliekspressio vähentynyt CDH1 mRNA-tasoja 35% vs. mock soluista, mutta lisäsi ilmaisuja N-kadheriinin (CDH2), P-kadheriinin (CDH3), twist perhe bHLH transkriptiotekijän 1 ja 2 (TWIST1 /2), ja vimentiinistä (VIM) 2,9, 3,3, 3,4, 2,4, 2,2, ja 4,2 kertaiseksi (kuvio 6A). MRNA-tasot etana perheen sinkkisormi 1 ja 2 (SNAI1 /2) pysyivät muuttumattomina. Sitten vahvisti, että MED30 yli-ilmentyminen on myös lisääntynyt proteiinin tasot E-kadheriinin, N-kadheriinin, P-kadheriinin, Twist1, ja vimentiinin (kuvio 6B). Tarkastelu morfologian SNU638 solujen paljasti, että MED30 yli-ilmentyminen aiheutti siirtyminen mukulakivi-kaltainen pitkänomainen fibroblastin kaltaisen morfologia (kuvio 6C), kun taas MED30 pudotus ei muuttanut morfologian (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että MED30 säätelee positiivisesti EMT.

Keskustelu

toiminnallisten roolien MED alayksikön MED30 (tunnetaan myös nimellä TRAP25) ovat huonosti tunnettuja. Tuoreessa raportissa, MED30 havaittiin merkittävä rooli säätelyssä mitokondrioiden toimintoja ja eheyden homotsygoottisia hiirissä [19]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme toiminnalliset roolit MED30 aikana mahalaukun syövän etenemisessä. Todettiin MED30 säännelty lisääntymistä, muuttoliike, ja invaasion mahasyövän solujen ja niiden in vivo
kasvainten muodostumiseen. Sen jälkeen varmistetaan Knockdown ja yliekspressio tehokkuutta kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR ja western blot-analyysi (kuvio 2), huomasimme, että MED30 Knockdown merkittävästi tukahdutti solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion mahasyövän soluja, ja että MED30 yli-ilmentyminen oli vastakkaiset vaikutukset (kuviot 2-4). Lisäksi MED30 Knockdown alennetaan in vivo
kasvainten muodostumiseen (kuvio 5). Lisäksi olemme havainneet, että MED30 yliekspressoitui mahasyövän kudoksissa ja mahasyövän solulinjoissa (kuvio 1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että MED30 voisi olla tärkeä patofysiologinen rooleja mahasyövän.

Koska erityisiä MED alayksiköt liittyvät signaali transkriptiotekijöitä ja RNA-polymeraasi II (Pol II) [20] ja toimivat putket ja integraattoreita varten kanavointi eri signalointireittejä, kuten ydin- hormonin reseptorin reitin (via MED1) [21], TGF-β-signalointireitistä (via MED12 tai MED15) [22, 23] Wnt-signalointireitin (via MED12) [ ,,,0],24], ja Ras-MAPK signalointireitin (via MED23) [25-27]. Ehdotettiin, että nämä signalointipolkujen voi aiheuttaa EMT [28-32], jonka tiedetään olevan yhteydessä etäpesäkkeiden invaasio, proliferaatio ja chemoresistance epiteelin syöpä [29, 33, 34]. Siksi kysyimme MED30 laukaisee EMT. MED30 indusoi ilmaisuja EMT liittyvien geenien (N-kadheriinin, CDH2, P-kadheriinin, CDH3, kierre liittyvä proteiini 1 ja 2, TWIST1 /2, vimentiinin, VIM), mutta esti ilmentyminen E-kadheriinin (CDH1) tunnettu tuumorisuppressori (kuvio 6A ja 6B). Lisäksi MED30 yliekspressio indusoi fibroblastien kaltainen morfologia (kuvio 6C), mikä viittaa siihen, MED30 laukaisee EMT mahalaukun syöpäsoluja.

yhteenveto esillä tutkimus tukee käsitystä, että MED30 toimii onkogeenin aikana mahasyövän ja ehdottaa MED30 voisi säädellä EMT mahasyövän. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään, kuinka MED30 laukaisee EMT, tulokset viittaavat siihen, että MED30 pidettävä uutena molekyylikohteena hoitoon mahasyövän.

Kiitokset

Tätä työtä tukivat Bio & Medical Technology Development Program (2012M3A9C6050213) ja Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) National Research Foundation (NRF) rahoittama Korean hallitus (MEST), ja jonka avustusta National R &D Program for Cancer Control terveysministeriö , hyvinvointi ja perhe-, Korean tasavalta (0920050).

• PLoS ONE: roolit DPY30 in leviämisen ja Liikkuvuus mahasyöpä- Cells
• PLoS ONE: Photoimmunotherapy mahasyövän peritoneaalisille carcinomatosis hiirimallissa