PLOS ONE: MED30 Regula la proliferación y la motilidad de cáncer gástrico Cells

Extracto

MED30 es un miembro esencial del complejo mediador que forma un cubo entre activadores de la transcripción y la ARN polimerasa II. Sin embargo, las expresiones y funciones de MED30 han descrito adecuadamente en el cáncer. En este estudio, hemos examinado el papel funcional de MED30 durante la progresión del cáncer gástrico. Se encontró que MED30 se sobreexpresa en tejidos de cáncer gástrico y líneas celulares. Por otra parte, la sobreexpresión MED30 aumentó la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico, mientras que MED30 knockdown inhibió estos efectos. Además, la caída tumorigenicidad inhibió significativamente en ratones SCID. MED30 también promovió la expresión de genes relacionados con la transición epitelio-mesenquimal e indujo una morfología similar a fibroblastos. Este estudio muestra MED30 tiene papeles fisiopatológicos en la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico y sugiere que MED30 debe ser visto como una diana terapéutica potente para el carcinoma gástrico

Visto maligna: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh So (2015) MED30 Regula la proliferación y la motilidad de las células de cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10.1371 /journal.pone.0130826

Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos |

Recibido: septiembre 22, 2014; Aceptado: 26-may de 2015; Publicado: 25 Junio ​​2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Bio & Programa Médico Tecnología para el Desarrollo (2012M3A9C6050213) y la Fundación de Ciencias Básicas de Investigación (2012R1A1A3010521) de la Fundación de Investigación Nacional (NRF), financiado por el gobierno de Corea (MEST) y una subvención del Plan Nacional de I & D del Programa de Control del Cáncer, Ministerio de Salud, Bienestar y la Familia, la República de Corea (0920050). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico es una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo [1, 2]. Aproximadamente el 95% de los cánceres gástricos son adenocarcinomas y en estudios epidemiológicos del cáncer gástrico ha sido clasificado por sitio anatómico como cardias /proximal o noncardia /distal [3] y por el fenotipo histológico intestinal y difuso, o mixta /inclasificable como se describe por Lauren [4 ]. Por otra parte, los pacientes con cáncer gástrico proximal tienen una peor supervivencia independiente del estadio TNM [5]. Helicobacter pylori infección
ha demostrado ser un agente etiológico de cáncer gástrico, especialmente de los cánceres que se encuentran en los estómagos distales de los varones de edad avanzada, que son generalmente del tipo intestinal. Más recientemente, se han propuesto varias clasificaciones moleculares de cáncer gástrico en base a los resultados de todo el genoma estudios de expresión génica y /o estudios de número de copias de genes [6-10].
Reglamento

transcripcional es un paso crucial que controla identidad celular, el crecimiento, la diferenciación y el desarrollo. mediador humano (MED) compleja, que contiene ~ 30 proteínas, es un coactivador clave /activador de la expresión de ARN polimerasa II (pol II) -transcribed genes [11]. complejo MED facilita el montaje complejo de pre-iniciación (PIC) por la interacción con Pol II y genes específicos de factores de transcripción (TFS), tales como, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH y [12, 13]. MED complejo consta de tres submódulos estructurales distintas (cabeza, medio y cola). El módulo de cabecera interactúa directamente con Pol II, mientras que el módulo de la cola alargada interactúa con las proteínas reguladoras de genes específicos [12, 13], y el módulo intermedio actúa en la transferencia de señal reguladora en una etapa de post-vinculante [13]. Aunque el mecanismo no se entiende completamente, complejo MED se une fuertemente a Pol II, cambia su conformación y afecta el proceso de iniciación de la transcripción [14, 15]. Desde complejo MED es un componente esencial de la maquinaria de transcripción, la mayor parte de las subunidades en el núcleo de MED son necesarios para el crecimiento embrionario y la viabilidad celular [16].

estudios de secuenciación del genoma del cáncer han informado de mutaciones o alteraciones en el ARN componentes de la maquinaria de transcripción contenidas en subunidades MED, y correlaciones entre algunos de estos cambios en las subunidades MED, (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8, y ciclina C) y la progresión del cáncer se ha informado de varios tipos de cáncer, aunque los mecanismos responsables de la estas correlaciones son desconocido [17].

Recientemente, se informó de que un MED19 puede participar en la progresión del cáncer gástrico, ya que su caída de detención, inhibió la proliferación celular y la capacidad de colonias de formación, y la fase G1 del ciclo celular inducida por en dos líneas celulares de cáncer gástrico humano (SGC7901 y MGC803) [18]. Sin embargo, los roles funcionales y relevancia patológica de otras subunidades MED en el cáncer gástrico siguen sin estar claros.

En el presente estudio, para revelar la importancia funcional de MED30 durante la progresión del cáncer gástrico, se examinaron sus papeles en la proliferación, la migración, la invasión y la tumorigenicidad de células de cáncer gástrico. Antes de la exploración funcional, nos registramos el patrón de expresión de MED30 en células de cáncer gástrico y tejidos.

Materiales y Métodos

Los cultivos de células y transfección

líneas celulares de cáncer gástrico (snu1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 y N87) fueron adquiridos de la línea celular de Corea del Banco (Seúl). Las células fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con HEPES 25 mM, 10% de suero bovino fetal (FBS), y 100 g /ml de penicilina /estreptomicina (1 × P /S) en 5% de CO _{2/95% de aire a 37 DO. Las células fueron transfectadas con siRNA usando DharmaFECT reactivo 1 o 3 (Dharmacon, Lafayette, CO), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de siRNA usadas fueron las siguientes: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Corea), 5'-CGA GCA ACU UAU UCC AUA U (dTdT) -3 ', 5'-GCU GCC AAA UGG UGU CAC U (dTdT) - 3 'y 5' CGA GAA GAA GCU AUU GUA A (dTdT) 3 '; revueltos (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5'-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) 3 '.}

MED30 sobreexpresión

Con el fin de construir MED30- más de vector de expresión, se utilizó pLenti6.3-V5 /DEST vector lentiviral (Invitrogen, Carlsbad, CA). Brevemente, MED30 cDNA fue clonado en pLenti6.3-V5 /DEST vector usando el in vivo
sistema de clonación de puerta de enlace basado en la recombinación (Invitrogen). El vector donante (pDONR221) que contiene la secuencia de codificación de MED30 (MED30 cDNA) se adquirió de la Ultimate ^{TM ORF clones (Invitrogen), y recombinada con el ccdB contra-seleccionable
gen del vector destino de puerta de enlace pLenti6.3-V5 /DEST utilizando la mezcla de enzima clonasa LR (Invitrogen). El pLenti6.3 vector vacío /V5-DEST se utilizó como control simulado. lentivirus recombinantes se producen en 293FT células, y se utilizaron para infectar células SNU638 acuerdo con las instrucciones del fabricante (ViraPower Lentiviral sistema de expresión; Invitrogen). Las líneas celulares estables fueron establecidos por la selección con blasticidina (7,5 mg /ml) (Invitrogen).}

-PCR en tiempo real

tejidos de cáncer gástrico se obtuvieron después de obtener el consentimiento informado por escrito de los pacientes que se sometieron a cirugía La resección en Pusan ​​National University hospital o el hospital de la Universidad Nacional de Pusan ​​Yangsan. El estudio fue aprobado por el Consejo Nacional de Pusan-Hospital Universitario de Revisión Institucional (IRB-PNUH) y el Consejo Nacional de Pusan ​​Yangsan Hospital Universitario-Revisión Institucional (IRB-PNUYH). ARN total fue extraído a partir de tejidos o células usando el reactivo Trizol (Invitrogen) o el kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cDNA fue sintetizado utilizando MMLV transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI), dNTP, y cebadores oligo-dT. Las secuencias de los cebadores utilizados fueron los siguientes: MED30, 5'-ACC GGT TAA CAA AGC TAC AGG A -3 '(sentido) y 5' TAA GTT GCT CGA CTG GAA TGG G -3 '(antisentido); CDH1, 5'-TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC-3 'y 5'-CTC AGC CCG AGT AAT GGA GG-3'; CDH2, 5'-GGA CAC TGT GCC TGA TGC CA-3 'y 5'-CCA TCC ATG TCT CCA GGG TG-3'; CDH3, 5'-CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC-3 'y 5'-ACG CCA CGC TGG TGA GTT GG-3'; TWIST1, 5'-CGG GAG TCC GCA GTC TTA-3 'y 5'-TGG TTG ATC CTC AGC TTG TC-3'; TWIST2, 5'-CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT-3 'y 5'-TAG CCA AGC AAT CAC GGA GA-3'; VIM, 5'-TGA GTA CCG GAG ACA GGT ACG G-3 'y 5'-TAG CAG CAA CTT CGG CAA AGT TC-3'; Snai1, 5'-GAG GCG GTG ACG GAC TAG-3 'y 5'-GAC ACA TCG GTC AGA CCA G-3'; SNAI2, 5'-TAG GAA GAG ATC TGC CAG AC-3 'y 5'-GGC CCC CAA ACA TAC TGT TA-3'; GAPDH, 5'-GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT-3 'y 5'-TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G-3'. PCR en tiempo real se realizó con un LightCycler ^{TM sistema de PCR 96 en tiempo real (Roche, Nutley, NJ, EE.UU.) con FastStart DNA esencial verde Master (Roche), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. GAPDH se utilizó como control interno.}

análisis de transferencia de Western

Las células se lisaron con tampón RIPA, se añadió cóctel inhibidor de la proteasa, y las concentraciones de proteína se determinaron usando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad ( Bio-Rad, Hercules, CA). Muestras (80 g /pocillo) se sometieron a SDS-PAGE y después se transfirió a membranas de PVDF. Anti-MED30 (1: 500, Proteína Tech§87-1-AP, Chicago, IL), anti-E-cadherina (1: 1000, BD Bioscienceɢ181, San Jose, CA), anti-N-cadherina (1 : 1000, BD Bioscienceɢ920), anti-P-cadherina (1: 1000, BD Bioscienceɢ227), anti-TWIST1 /2 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology # sc-15393, Santa Cruz, CA), anti -vimentin (1: 1000, Dako # M7020, Carpentaria, CA) y anti-β-actina (1: 2000, sc-47778 Santa Cruz Biotechnology #) anticuerpos se diluyeron en leche desnatada al 5% y se incubaron con las membranas a 4 ° C durante la noche. Se aplicó el anticuerpo secundario apropiado (1: 2000, peroxidasa de rábano conjugada anti-ratón o anti-conejo) a temperatura ambiente durante 1 hr. detección de quimioluminiscencia (GE Health Care, Little Chalfont, Reino Unido) se utiliza para visualizar MED30, E-cadherina, N-cadherina, P-cadherina, TWIST1, vimentina, y β-actina. Western blot se realizó por triplicado.

La inmunohistoquímica

secciones de microarrays de tejidos que contienen tejidos de cáncer gástrico de los pacientes se obtuvieron de SuperBiochip (Seúl). diagnósticos histopatológicos se llevaron a cabo en el Departamento de Patología, Hospital de la Universidad Nacional de Pusan, y la estadificación clínico patológica se ha realizado mediante la clasificación TNM (AJCC, 7ª ed.). Todos los pacientes habían confirmado histológicamente cáncer gástrico, y se comprobaron las muestras de tumor para asegurar que el tejido del tumor compuesto más de 80% de las muestras. Para la inmunohistoquímica, las diapositivas se deparaffinized y rehidratada, se trató con peróxido de hidrógeno 0,3% durante 30 min para inactivar la actividad de la peroxidasa endógena, y se bloquearon con 10% de suero normal de burro (NDS) y 1% de BSA en 1 × tampón fosfato salino (PBS). Los portaobjetos se incubaron a continuación durante la noche a 4 ° C en tampón de bloqueo que contiene el anticuerpo primario (anti-MED30 humana; 01:50, Proteintech). El anticuerpo secundario (conjugado a HRP) de unión se realizó a una dilución de 1: 200 en tampón de bloqueo durante 2 horas a RT. Los portaobjetos se tiñeron a continuación para HRP (Vector Laboratories) y de contraste con tampón de tinción hematoxilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 1 min. Los porcentajes de células que se tiñeron de MED30 en secciones fueron determinados y secciones fueron clasificadas usando una escala de 1-4 (1, < 24%; 2, 25-49%; 3, 50-74%; 4, 75-100% ). Las intensidades de tinción de las células tumorales se calificaron como 0, 1, 2, o 3, que correspondía a basal, débil, moderada y fuerte, respectivamente. a continuación, la tinción general estuvo representado por las puntuaciones compuestas, que se calculan multiplicando estos dos grados. De acuerdo con ello, en general manchado fue graduada de 0 a 12.

proliferación de las células de ensayo

Para examinar el efecto de ARNsi sobre la proliferación de células de cáncer gástrico, medios de cultivo se reemplazan con 1% de FBS un medio día después de la transfección de siRNA. Cinco días después de la transfección, se añadieron 10 l de Ez-Cytox (ITSBIO, Seúl) y las células se incubaron durante 0,5 a 2 horas en condiciones de cultivo normales. A continuación, se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de ELISA (TECAN, Männedorf, Suiza). Para examinar el efecto de la sobreexpresión MED30, las células se sembraron en medio FBS 1%. Se añadieron tres días después de la siembra de 10 l de Ez-Cytox.

Boyden ensayo de cámara de

La cámara inferior de una cámara transwell se llenó con medio que contiene 10% de SFB. Un día después de la transfección con revueltos (SCR) o MED30 siRNA, células de cáncer gástrico se sembraron en la cámara superior a una densidad de 5 × 10 ^{5 células /ml en 50 l de medio libre de suero. Para examinar los efectos de la sobreexpresión MED30, las células (simulacros y MED30-over) se sembraron a una densidad de 1 × 10 5 células /ml. Para eliminar la proliferación efectos asociados, mitomicina C (0,01 g /ml, Sigma-Aldrich) se añadió. Las células se dejaron migrar durante cuatro o seis horas. Después las membranas se fijaron y se tiñeron con solución Diff-Quik (Sysmex, Kobe, Japón) y se lavaron con agua destilada. El número de células en 10 campos elegidos al azar se contaron usando un microscopio de luz.}

Matrigel invasión de ensayo

La capacidad de las células de cáncer gástrico para invadir se investigó el uso de 24 pocillos BioCoat ^{TM Matrigel TM insertos de cámara (BD Bioscience, San Jose, CA, EE.UU.). La superficie superior de los insertos en las cámaras de invasión se recubrieron con una reducción de factor de 0,5 mg /ml de crecimiento Matrigel (BD Bioscience) y la superficie inferior con 0,5 mg /ml de fibronectina (Sigma-Aldrich). Un día después de la transfección con SCR o MED30 siRNA, las células se sembraron a una densidad de 5 × 10 4 células /ml en medio libre de suero en 8-micras porosos insertos de cámara BioCoat Matrigel, y se colocan en pozos llenos con 750 l de medio suplementado con 10% de FBS como un quimioatrayente. Para examinar los efectos de la sobreexpresión MED30, las células (simuladas y las células que sobreexpresan MED30) se sembraron a una densidad de 1 × 10 4 células /ml. Para eliminar los efectos de la proliferación asociada, se añadió mitomicina C (0,01 g /ml, Sigma-Aldrich). Después de la incubación durante 24 horas, no-invasores células sobre las superficies superiores de las membranas se retiraron por raspado. células invasoras en las superficies inferiores se fijaron, y se tiñeron con solución de Diff-Quik. Los experimentos se realizaron por triplicado, y al menos 5 campos fueron contados por experimento.}

ensayo xenoinjerto

Las células SNU638 se transfectaron con SCR o MED30 siRNA. Después de 2 días, las células se recogieron por tripsinización, se lavaron dos veces con PBS, y se inyectaron por vía subcutánea (1 × 10 ^{6 células en 100 l de PBS) en ratones inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Los volúmenes tumorales se calculan todas las semanas desde la semana tres a siete semanas después de la inyección utilizando la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm 3) = ( a
× b
2 ) /2, donde a
= longitud en mm y b =
anchura en mm. A las siete semanas, los ratones fueron sacrificados y se registraron los volúmenes tumorales y pesos. Este experimento se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio emitidos por el Instituto Nacional de Salud. El Comité Nacional de Pusan ​​Universidad Institucional de Cuidado y Uso de Animales (PNUIACUC) aprobó el protocolo experimental.}

El análisis estadístico

Los resultados se presentan como medias ± desviaciones estándar. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney U-test no paramétrico o la prueba t de Student (sin pareja) para determinar los significados de las diferencias entre los valores medios de los dos grupos, y se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) seguido de comparaciones múltiples de Tukey unidireccional analizar tres o más grupos. * Indica un valor de P Red de < 0,05. El tiempo de supervivencia se define como el tiempo transcurrido entre el tratamiento y la muerte o hasta que se obtuvo la última información objetiva de seguimiento. Se utilizó el método de Kaplan-Meier para determinar la relación entre la supervivencia y la expresión MED30. Las curvas se compararon mediante la prueba de log-rank a un nivel de significación del 95%. Los valores P Red de < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los datos fueron analizados utilizando el software SPSS versión 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).

Resultados

La sobreexpresión de MED30 en tejidos de cáncer gástrico

Para investigar funciones desempeñadas por MED30 en el cáncer gástrico, lo primero que examinó el estado de la expresión de MED30 en los tejidos tumorales de 23 pacientes con cáncer gástrico. Se encontró proteína MED30 a ser ampliamente sobreexpresa en las regiones de tejido cancerosos (Fig 1A-1D), y, obviamente, se sobreexpresa en la invasión de células de cáncer gástrico (Fig 1C) y en las células cancerosas metastásicas dentro de los ganglios linfáticos afectados (Fig 1D). Con el fin de validar los resultados de inmunohistoquímica, hemos realizado cuantitativa en tiempo real PCR en tejidos de cáncer gástrico utilizando cebadores MED30-específicos. Como se muestra en la figura 1F, DPY30 se sobreexpresa en 10 casos (10/23, 43%). También examinamos el patrón de expresión de MED30 en líneas celulares de cáncer gástrico por PCR en tiempo real, y nos pareció que estaba sobreexpresado en cinco de las líneas celulares de cáncer gástrico probados (excepto snu1) frente a los tejidos gástricos normales (Figura 1E). Para investigar la correlación entre la expresión MED30 y características clínicas, se realizó inmunohistoquímica utilizando 41 muestras de tejido de cáncer gástrico (Tabla 1). Curiosamente, la expresión de MED30 se correlacionó positivamente con el estadio N (Figura 1G), pero no con la supervivencia del paciente (datos no mostrados).

Roles de MED30 en la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico

Para examinar las funciones de MED30 en la carcinogénesis gástrica, se examinaron los efectos de MED30 desmontables o sobreexpresión de la proliferación, la migración y la invasión de las seis líneas celulares de cáncer gástrico (snu1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638, y el Instituto Nacional del cáncer -N87 células). PCR en tiempo real y Western Blot se utilizaron para analizar la caída y la sobreexpresión de MED30 en SNU216 y SNU638 células (Figura 2A-2C). Cuando estas células se transfectaron con MED30 siRNA (100 nM), la expresión MED30 disminuido en la proteína y los niveles de mRNA en alrededor de 80% dos días más tarde frente a SCR siRNA, y MED30 sobreexpresión de cDNA transfección aumentado MED30 ARNm y los niveles de proteína en comparación con vectores de control de vacío transfectadas las células (células mock) en más de 3 veces.

a continuación se investigó el papel de MED30 en la proliferación de células cancerosas. Los ensayos de proliferación se llevaron a cabo 5 días después de la transfección con SCR o MED30 siRNA. Desmontables de MED30 inhibe las proliferaciones de todas las células de cáncer gástrico analizadas (SNU16, SNU216, SNU620 y SNU638) frente a SCR en un 18%, 68%, 98% y 42%, respectivamente (Fig 2D). Se observaron resultados similares cuando se realizaron ensayos de proliferación de dos o tres días después de la transfección (datos no mostrados). Por ello, la sobreexpresión MED30 mejorado los crecimientos de SNU216 y SNU638 células en 1,9 y 2,2 veces, respectivamente, frente a las células simuladas.

Para determinar el papel que desempeñan los MED30 en la migración de células de cáncer gástrico, se utilizó una cámara de Boyden ensayo. Desmontables de MED30 disminuyó migraciones inducidas por el FBS de células SNU216 y SNU638 por 90% y 52%, respectivamente, frente a las células transfectadas (SCR Fig 3A y 3C). Por otra parte, MED30 sobreexpresión aumentó la migración inducida por el FBS de células SNU216 y SNU638 un 3,2 y 2,8 veces, respectivamente, frente a las células falsos (figura 3B y 3C). Estos resultados nos llevaron a examinar el papel de MED30 en la invasión de células de cáncer gástrico. En un ensayo de invasión de Matrigel, MED30 siRNA inhibe invasiones inducidas por el FBS de células SNU216 y SNU638 frente SCR siRNA en un 64% y 47%, respectivamente (Figura 4A y 4C), y MED30 sobreexpresión acelera las invasiones inducidas por el FBS de SNU216 y SNU638 células frente a las células simulacros de 2,5 y 2,2 veces, respectivamente (figura 4B y 4C).

efecto de MED30 caída en in vivo
tumorigenicidad

Para examinar el efecto de MED30 en el crecimiento del tumor, se inyecta por vía subcutánea SNU638 células transfectadas con SCR o MED30 siRNA en ratones SCID y, a continuación, supervisa el crecimiento del tumor durante siete semanas (Fig 5A). Se detectaron tumores palpables dentro de tres semanas en los lados de control de SCR. Sin embargo, las células cancerosas transfectadas con siRNA MED30 mostraron un crecimiento más lento. Siete semanas después de la inyección, los ratones se sacrificaron, y los volúmenes tumorales y los pesos se midieron (Fig 5B y 5C). Los resultados mostraron MED30 desmontables redujo significativamente los volúmenes tumorales y pesos.

Reglamento de la vía de EMT por MED30

Para determinar el mecanismo subyacente a la promoción de la carcinogénesis gástrica por MED30, hemos investigado los patrones de expresión de genes involucrados en la transición epitelio-mesenquimal (EMT: un proceso clave en la metástasis y la invasión) por PCR en tiempo real. Desmontables de MED30 aumentó ligeramente el nivel de E-cadherina (CDH1) mRNA en SNU638 células frente a SCR transfección, pero disminuyó expresiones de N-cadherina (CDH2), P-cadherina (CDH3) y vimentina (VIM) en un 42%, 36% y 41%, respectivamente (figura 6A). Consistentemente, MED30 sobreexpresión disminución de los niveles CDH1 de ARNm en un 35% frente a las células simuladas, pero aumentó la expresión de N-cadherina (CDH2), P-cadherina (CDH3), la familia giro bHLH factor de transcripción 1 y 2 (TWIST1 /2), y vimentina (VIM) por 2,9, 3,3, 3,4, 2,4, 2,2, y 4,2 veces, respectivamente (Fig 6A). Los niveles de mRNA de dedo familia Snail zinc 1 y 2 (Snai1 /2) se mantuvieron sin cambios. a continuación, se confirmó que la sobreexpresión MED30 también aumentó los niveles de la proteína E-cadherina, N-cadherina, P-cadherina, TWIST1, y vimentina (Figura 6B). Un examen de la morfología de las células SNU638 reveló que MED30 sobreexpresión provocó una transición de un adoquín-como a una alargada morfología similar a fibroblastos (Fig 6C), mientras que MED30 caída no alteró la morfología (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que MED30 regula positivamente la EMT.

Discusión

Los roles funcionales de la subunidad MED30 MED (también conocido como TRAP25) son poco conocidos. En un informe reciente, MED30 se encontró que desempeñar un papel importante en la regulación de funciones y la integridad mitocondrial en ratones homocigotos [19]. En el presente estudio, hemos examinado el papel funcional de MED30 durante la progresión del cáncer gástrico. Se encontró MED30 regula la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico y su in vivo
tumorigenicidad. Después de asegurarse de caída y la eficiencia sobreexpresión por cuantitativa en tiempo real PCR y análisis de transferencia Western (Fig 2), se encontró que MED30 knockdown notablemente suprimida la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico, y que MED30 sobreexpresión tenía los efectos opuestos (Figs 2-4). Por otra parte MED30 caída reducida in vivo
tumorigenicidad (figura 5). Por otra parte, también se encontró que MED30 se sobreexpresa en el cáncer gástrico tejidos y líneas celulares de cáncer gástrico (fig 1). Estos resultados sugieren que MED30 podría desempeñar importantes papeles fisiopatológicos durante la carcinogénesis gástrica.

Desde subunidades específicas MED se asocian a factores activados por señales de transcripción y ARN polimerasa II (pol II) [20] y funcionan como conductos e integradores de canalización de diferentes vías de señalización, como por ejemplo, la vía de la hormona nuclear receptor (vía MED1) [21], la vía de TGF-β de señalización (a través de MED12 o MED15) [22, 23], la vía de señalización Wnt (a través de MED12) [ ,,,0],24], y la vía de señalización Ras-MAPK (a través de MED23) [25-27]. Se propuso que estas vías de señalización pueden inducir EMT [28-32], que se sabe que está asociado con la metástasis, invasión, la proliferación y la quimiorresistencia del cáncer epitelial [29, 33, 34]. Por lo tanto, nos preguntamos si MED30 desencadena la EMT. MED30 indujo la expresión de genes relacionados con el EMT (N-cadherina; CDH2, P-cadherina; CDH3, proteína relacionada con el giro 1 y 2; TWIST1 /2, vimentina; VIM), pero inhibe la expresión de E-cadherina (CDH1) una supresor tumoral conocido (Fig 6A y 6B). Por otra parte, MED30 sobreexpresión induce una morfología similar a fibroblastos (Figura 6C), lo que sugiere MED30 desencadena EMT en células de cáncer gástrico.

En resumen, el presente estudio apoya la idea de que MED30 actúa como un oncogén durante la carcinogénesis gástrica y sugiere MED30 podría regular la EMT en el cáncer gástrico. Aunque se necesitan más estudios para determinar cómo MED30 desencadena EMT, nuestros resultados sugieren que MED30 ser considerado como un objetivo molecular novedoso para el tratamiento del cáncer gástrico.

Reconocimientos

Este trabajo fue apoyado por el Bio &erio; Programa Médico Tecnología para el Desarrollo (2012M3A9C6050213) y la Fundación de Ciencias Básicas de Investigación (2012R1A1A3010521) de la Fundación de Investigación Nacional (NRF), financiado por el gobierno de Corea (MEST), y por una subvención del Plan Nacional de I & D del Programa de Control del Cáncer, Ministerio de Sanidad , Bienestar y Asuntos de la Familia, República de Corea (0.920.050).

• PLOS ONE: Roles de DPY30 en la proliferación y motilidad de las células de cáncer gástrico
• PLOS ONE: Photoimmunotherapy de cáncer gástrico carcinomatosis peritoneal en un ratón Model