PLOS ONE: MED30 régule la prolifération et la motilité des cellules cancéreuses gastriques

Résumé

MED30 est un élément essentiel du complexe médiateur qui forme une plaque tournante entre les activateurs de la transcription et l'ARN polymérase II. Cependant, les expressions et les rôles des MED30 ont été mal caractérisé en ce cancer. Dans cette étude, nous avons étudié les rôles fonctionnels de MED30 lors de la progression du cancer gastrique. On a constaté que MED30 était surexprimé dans les tissus du cancer de l'estomac et des lignées cellulaires. En outre, la surexpression MED30 augmente la prolifération, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques, tandis que MED30 effet de choc a inhibé les effets. En outre, le knock-down de la tumorigénicité inhibé de manière significative chez les souris SCID. MED30 a également favorisé l'expression de gènes liés à la transition épithéliale-mésenchymateuse et induit une morphologie de type fibroblaste. Cette étude montre MED30 a des rôles physiopathologiques dans la prolifération, la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique et suggère que MED30 devrait être considérée comme une cible thérapeutique puissante pour maligne gastrique carcinome

Citation: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) MED30 régule la prolifération et la motilité des cellules de cancer gastrique. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10.1371 /journal.pone.0130826

Editeur: Aamir Ahmad, École Wayne State University of Medicine, ETATS-UNIS

Reçu le 22 Septembre 2014; Accepté: 26 mai 2015; Publié le 25 Juin, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Lee et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier

financement:. Ce travail a été soutenu par le Bio & Programme Medical Technology Development (2012M3A9C6050213) et de la Fondation de base de recherche en sciences (2012R1A1A3010521) de la National Research Foundation (NRF), financé par le gouvernement coréen (MEST) et une subvention de la National R & D Programme de lutte contre le cancer, Ministère de la Santé, du bien-être et de la famille, de la République de Corée (0920050). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde entier [1, 2]. Environ 95% des cancers gastriques sont des adénocarcinomes et dans les études épidémiologiques du cancer gastrique a été classé par site anatomique que cardia /proximal ou noncardia /distale [3] et par le phénotype histologique intestinal, diffuse, ou mixte /inclassables comme décrit par Lauren [4 ]. En outre, les patients atteints de cancer gastrique proximal ont moins bonne survie indépendante de stade TNM [5]. Helicobacter pylori
infection a été démontrée pour être un agent étiologique du cancer gastrique, en particulier des cancers trouvés dans les estomacs distales des hommes âgés, qui sont généralement de type intestinal. Plus récemment, plusieurs classifications moléculaires du cancer gastrique ont été proposées sur la base des résultats de l'ensemble du génome des études d'expression génique et /ou d'études de nombre de copies du gène [6-10].
Règlement

transcriptionnelle est une étape cruciale qui contrôle une identité cellulaire, la croissance, la différenciation et le développement. médiateur humain (MED) complexe, qui contient ~ 30 protéines, est une clé coactivateur /activateur des expressions de l'ARN polymérase II (Pol II) -transcribed gènes [11]. complexe MED facilite l'assemblage du complexe de pré-initiation (PIC) par interaction avec la Pol II et des facteurs de gènes spécifiques de la transcription (TFS), tels que TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF et TFIIH [12, 13]. complexe MED se compose de trois sous-modules structuraux distincts (tête, milieu et arrière). Le module de tête interagit directement avec Pol II, tandis que le module de queue allongé interagit avec les protéines spécifiques du gène de régulation [12, 13], et le module intermédiaire agit dans le transfert de signal réglementaire à un stade post-liaison [13]. Bien que le mécanisme ne soit pas totalement compris, complexe MED se lie étroitement à Pol II, change sa conformation et influe sur le processus d'initiation de la transcription [14, 15]. Depuis complexe MED est une composante essentielle de la machinerie de transcription, la plupart des sous-unités dans le noyau de MED sont nécessaires pour la croissance embryonnaire et la viabilité cellulaire [16].

études de séquençage du génome du cancer ont rapporté des mutations ou des altérations de l'ARN composants de machines de transcription contenues dans les sous-unités MED, et les corrélations entre certains de ces changements dans les sous-unités MED, (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8 et cycline C) et la progression du cancer ont été rapportés pour divers cancers, bien que les mécanismes responsables de la ces corrélations ne sont pas connus [17].

récemment, il a été signalé qu'un MED19 peut participer à la progression du cancer de l'estomac, comme son knockdown inhibé de manière significative la prolifération cellulaire et la capacité des colonies de formation, et de la phase G1 induite par arrêt du cycle cellulaire dans deux lignées humaines gastriques de cellules cancéreuses (et SGC7901 MGC803) [18]. Cependant, les rôles fonctionnels et la pertinence pathologique des autres sous-unités MED dans le cancer gastrique restent floues.

Dans la présente étude, de révéler l'importance fonctionnelle de MED30 lors de la progression du cancer de l'estomac, nous avons examiné son rôle dans la prolifération, la migration, l'invasion et la tumorigénicité des cellules cancéreuses gastriques. Avant l'examen fonctionnel, nous avons vérifié le profil d'expression de MED30 dans les cellules et les tissus de cancer gastrique.

Matériel et méthodes

Cultures cellulaires et transfection

lignées cellulaires de cancer gastrique (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 et N87) ont été achetés à partir de la Korean Cell Line Bank (Séoul). Les cellules ont été cultivées dans du RPMI 1640 supplémenté avec 25 mM d'HEPES, 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 ug /ml de pénicilline /streptomycine (1 × P /S) à 5% de CO _{2/95% d'air à 37 ° C ° C. Les cellules ont été transfectées avec l'ARNsi en utilisant le réactif DharmaFECT 1 ou 3 (Dharmacon, Lafayette, CO), selon les instructions du fabricant. Les séquences de siRNA utilisées sont les suivantes: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Corée), 5'-CGA GCA ACU UAU UCC AUA U (dTdT) -3 ', 5'-GCU GCC AAA UGG UGU CAC U (dTdT) - 3 'et 5'-CGA GAA AUU GCU GAA GUA A (dTdT) -3'; brouillés (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5'GAU GCC CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 '.}

MED30 surexpression

Afin de construire MED30- sur le vecteur d'expression, nous avons utilisé pLenti6.3-V5 /DEST vecteur lentiviral (Invitrogen, Carlsbad, CA). En bref, MED30 ADNc a été cloné dans pLenti6.3-V5 /DEST vecteur en utilisant le in vivo
système basé sur la recombinaison Gateway clonage (Invitrogen). Le vecteur donneur (pDONR221) contenant la séquence codante de MED30 (MED30 ADNc) a été acheté de Ultimate ^{MC ORF Clones (Invitrogen) et recombinée avec la contre-sélectionnable ccdB
gène de la destination vecteur Passerelle pLenti6.3-V5 /DEST en utilisant le mélange d'enzymes LR clonase (Invitrogen). Le vecteur pLenti6.3 vide /V5-DEST a été utilisé comme témoin maquette. lentivirus recombinants ont été produits dans des cellules 293FT et utilisés pour infecter des cellules SNU638 selon les instructions du fabricant (système d'expression lentiviral ViraPower; Invitrogen). Des lignées cellulaires stables ont été établies par sélection avec blasticidine (7,5 pg /ml) (Invitrogen).}

en temps réel
PCR

tissus de cancer gastrique ont été obtenus après l'obtention du consentement éclairé des patients qui ont subi une chirurgie résection à Pusan ​​national University Hospital ou de l'hôpital de l'Université nationale de Pusan ​​Yangsan. L'étude a été approuvée par le Conseil de Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review (PNUH-IRB) et le Conseil de Pusan ​​National University Hospital Yangsan-Institutional Review (PNUYH-IRB). L'ARN total a été extrait à partir de tissus ou de cellules en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) ou le kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) selon les instructions du fabricant. L'ADNc a été synthétisé en utilisant la transcriptase inverse MMLV (Promega, Madison, WI), des dNTP et des amorces oligo-dT. Les séquences des amorces utilisées sont les suivantes: MED30, 5'ACC GGT TAA CAA AGC TAC AGG A-3 '(sens) et 5'TAA GTT GCT CGA CTG GAA TGG G-3' (antisens); CDH1, 5'TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC -3 'et 5'-CTC AGC GCC AGT GGA AAT GG -3'; CDH2, 5'CAC TGT GGA GCC TGA TGC CA -3 'et 5'TCC CCA ATG TCT CCA GGG TG -3'; CDH3, 5'CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC-3 'et 5'-ACG CCA CGC TGG TGA GTT GG -3'; TWIST1, 5'CGG GAG TCC GCA TTA GTC -3 'et 5'TGG ATC TTG CTC AGC TTG TC-3'; TWIST2, 5'CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT -3 'et 5'TAG CCA AGC AAT CAC GGA GA -3'; VIM, 5'TGA GTA GCC GAG ACA GGT GCA G-3 'et 5'TAG CAG CTT CAA CAA CGG AGT TC-3'; SNAI1, 5'GAG GCG GTG GCA GAC TAG-3 'et 5'GAC ACA TCG GTC AGA CCA G-3'; SNAI2, 5'TAG GAA GAG ATC TGC CAG AC-3 'et 5'CCC CAA GGC ACA TAC TGT TA -3'; GAPDH, 5'GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT-3 'et 5'TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G -3'. PCR en temps réel a été réalisée en utilisant un LightCycler ^{TM système PCR 96 en temps réel (Roche, Nutley, NJ, USA) avec FastStart DNA Essential Vert Master (Roche), selon les instructions du fabricant. GAPDH a été utilisé comme contrôle interne.}

Analyse par Western blot

Les cellules ont été lysées avec du tampon RIPA, on a ajouté cocktail inhibiteur de protease, et les concentrations en protéines ont été déterminées en utilisant le kit de dosage de protéine Bio-Rad ( Bio-Rad, Hercules, CA). Des échantillons (80 pg /puits) ont été soumis à une SDS-PAGE, puis transférés sur des membranes PVDF. Anti-MED30 (1: 500, Protein Tech§87-1-AP, Chicago, IL), anti-E-cadhérine (1: 1000, BD Bioscienceɢ181, San Jose, CA), anti-N-cadhérine (1 : 1000, BD Bioscienceɢ920), anti-P-cadhérine (1: 1000, BD Bioscienceɢ227), anti-TWIST1 /2 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology # sc-15393, Santa Cruz, CA), anti -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Carpentaria, CA) et anti-β-actine (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology # sc-47778) anticorps ont été dilués dans 5% de lait écrémé et incubées avec des membranes à 4 ° C pendant la nuit. L'anticorps secondaire approprié a été appliqué (1: 2000, conjugué à la peroxydase de raifort anti-souris ou anti-lapin) à la température ambiante pendant 1 h. détection de chimioluminescence (soins GE Santé, Little Chalfont, Royaume-Uni) a été utilisé pour visualiser MED30, E-cadhérine, la N-cadhérine, P-cadhérine, TWIST1, vimentine, et β-actine. L'analyse Western blot a été réalisée en triple.

immunohistochimie

sections de microréseaux de tissus contenant des tissus de cancer gastrique de patients ont été obtenus à partir de SuperBiochip (Séoul). diagnostics histopathologiques ont été réalisées au Département de pathologie, hôpital universitaire national de Pusan, et la mise en scène clinicopathologique a été réalisée en utilisant la classification TNM (AJCC, 7e éd.). Tous les patients avaient un cancer gastrique confirmé histologiquement, et des échantillons de tumeur ont été vérifiés pour s'assurer que le tissu tumoral composé de plus de 80% des échantillons. Pour l'immunohistochimie, les lames ont été déparaffinées et réhydratées, traité avec 0,3% de peroxyde d'hydrogène pendant 30 minutes pour désactiver l'activité de peroxydase endogène, et bloquées avec 10% de sérum d'âne normale (PDN) et 1% de BSA dans 1 x tampon phosphate salin (PBS). Les lames ont été ensuite mises en incubation pendant une nuit à 4 ° C dans un tampon de blocage contenant un anticorps primaire (anti-humaine MED30; 01:50, Proteintech). L'anticorps secondaire (conjugué à la HRP), la liaison a été effectuée à une dilution de 1: 200 dans un tampon de blocage pendant 2 h à température ambiante. Les lames ont été ensuite colorées pour HRP (Vector Laboratories) et de contraste avec le tampon hématoxyline de coloration (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pendant 1 min. Les pourcentages de cellules qui se coloraient pour MED30 dans les sections ont été déterminées et les sections ont ensuite été classés en utilisant une échelle 1-4 (1, < 24%; 2, 25-49%; 3, 50-74%; 4, 75-100% ). Intensité de coloration des cellules tumorales ont été classés en tant que 0, 1, 2 ou 3, ce qui correspond à la base, faible, modérée et forte, respectivement. coloration globale a ensuite été représenté par les scores composites, qui ont été calculées en multipliant ces deux qualités. En conséquence, dans l'ensemble teinté a été classé de 0 à 12.

La prolifération cellulaire test

Pour examiner l'effet de siRNA sur la prolifération des cellules cancéreuses gastriques, les milieux de culture ont été remplacés par 1% de milieu un FBS jour après la transfection ARNsi. Cinq jours après la transfection, 10 pi de Ez-Cytox (ITSBIO, Séoul) ont été ajoutés et les cellules ont été mises en incubation pendant 0,5 à 2 heures dans des conditions normales de culture. Ensuite, l'absorbance a été mesurée à 450 nm en utilisant un lecteur ELISA (TECAN, Mannedorf, Suisse). Pour examiner l'effet de la surexpression MED30, les cellules ont été ensemencées dans 1% de FBS. Trois jours après l'ensemencement de 10 pi de Ez-Cytox a été ajouté.

Boyden test de chambre

La chambre inférieure d'une chambre de Transwell a été rempli avec un milieu contenant 10% de FBS. Un jour après la transfection avec embrouillé (SCR) ou MED30 ARNsi, des cellules de cancer de l'estomac ont été ensemencés dans la chambre supérieure à une densité de 5 × 10 ^{5 cellules /ml dans 50 ul de milieu exempt de sérum. Pour examiner les effets de MED30 surexpression, les cellules (simulées et MED30-plus) ont été ensemencées à une densité de 1 x 10 5 cellules /ml. Pour éliminer les effets de prolifération associés, la mitomycine C (0,01 pg /ml, Sigma-Aldrich) a été ajouté. Les cellules ont été autorisés à migrer pendant quatre ou six heures. Les membranes ont été ensuite fixées et colorées en utilisant la solution Diff-quik (Sysmex, Kobe, Japon) et lavés avec de l'eau distillée. Les nombres de cellules dans 10 champs choisis au hasard ont été comptées à l'aide d'un microscope optique.}

Matrigel test d'invasion

La capacité des cellules de cancer gastrique pour envahir a été étudiée à l'aide de 24 puits BioCoat ^{TM Matrigel inserts de chambre de TM (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). La surface supérieure des inserts dans des chambres d'invasion ont été revêtues avec 0,5 mg /ml de facteur de croissance réduit matrigel (BD Bioscience) et la surface inférieure à 0,5 mg /ml de fibronectine (Sigma-Aldrich). Un jour après la transfection avec des SCR ou MED30 ARNsi, les cellules ont été ensemencées à une densité de 5 x 10 4 cellules /ml dans un milieu sans sérum dans 8 um poreuses inserts de chambre BioCoat Matrigel et placés dans des puits remplis de 750 ul de milieu additionné de SBF à 10% en tant que facteur chimiotactique. Pour examiner les effets de MED30 surexpression, les cellules (cellules simulées et MED30-surexprimant) ont été ensemencées à une densité de 1 x 10 4 cellules /ml. Pour éliminer les effets de la prolifération associée, mitomycine C (0,01 pg /ml, Sigma-Aldrich) a été ajouté. Après une incubation de 24 heures, les cellules non-envahissantes sur les surfaces supérieures des membranes ont été éliminées par grattage. invasion des cellules sur des surfaces inférieures ont été fixées et colorées avec une solution Diff-Quik. Des expériences ont été réalisées en triple, et au moins 5 champs ont été comptés par expérience.}

test de xénogreffe

Les cellules SNU638 ont été transfectées avec SCR ou MED30 siRNA. Au bout de 2 jours, les cellules ont été recueillies par trypsinisation, lavées deux fois avec du PBS et ont été injectées par voie sous-cutanée (1 x 10 ^{IO6 cellules dans 100 ul de PBS) à des souris grave d'immunodéficience combinée (SCID). Les volumes des tumeurs ont été calculés chaque semaine de trois semaine à sept après l'injection en utilisant la formule suivante: volume de la tumeur (mm 3) = ( a
× b
2 ) /2, où a
= longueur en mm et b
= largeur en mm. Au bout de sept semaines, les souris ont été sacrifiées et les volumes tumoraux et les poids ont été enregistrés. Cette expérience a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire publiées par l'Institut national de la santé. Le Comité Universitaire Institutionnelle soin et l'utilisation des animaux Pusan ​​National (PNUIACUC) a approuvé le protocole expérimental.}

L'analyse statistique

Les résultats sont présentés sous forme de moyennes ± SDs. Le Mann-Whitney U-test non paramétrique ou test t de Student (non apparié) a été utilisé pour déterminer les significations des différences entre les valeurs moyennes des deux groupes, et d'une analyse de variance (ANOVA) suivie par des comparaisons multiples de Tukey a été utilisé pour analyser au moins trois groupes. * Indique un P
valeur de < 0,05. Le temps de survie a été défini comme étant le temps écoulé entre le traitement et la mort ou jusqu'à ce que la dernière information de suivi objectif a été obtenu. La méthode de Kaplan-Meier a été utilisée pour déterminer la relation entre la survie et l'expression MED30. Les courbes ont été comparées en utilisant le test du log-rank à un niveau de 95% de signification. Les valeurs P
de < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Les données ont été analysées en utilisant la version du logiciel SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

surexpression de résultats de MED30 dans les tissus de cancer gastrique

Pour étudier les rôles joués par MED30 dans le cancer gastrique, nous avons d'abord examiné l'état d'expression de MED30 dans les tissus tumoraux de 23 patients atteints d'un cancer gastrique. protéine MED30 a été jugée largement surexprimé dans les régions de tissus cancéreux (Figure 1A-1D), et a été évidemment surexprimé dans l'invasion des cellules cancéreuses gastriques (figure 1C) et dans les cellules cancéreuses métastatiques à l'intérieur des ganglions lymphatiques atteints (figure 1D). Afin de valider les résultats d'immunohistochimie, nous avons réalisé une PCR quantitative en temps réel sur les tissus du cancer de l'estomac en utilisant des amorces spécifiques MED30. Comme cela est représenté sur la figure 1F, DPY30 était surexprimé dans 10 cas (10/23, 43%). Nous avons également examiné le profil d'expression des MED30 dans gastriques lignées cellulaires de cancer par PCR en temps réel, et l'a trouvé à surexprimé dans cinq des lignées cellulaires de cancer gastrique testés (sauf SNU1) versus tissus gastriques normaux (Fig 1E). Afin d'étudier la corrélation entre l'expression et MED30 caractéristiques cliniques, nous avons réalisé une immunohistochimie en utilisant 41 échantillons de tissu du cancer gastrique (tableau 1). Fait intéressant, l'expression de MED30 est positivement corrélé avec le stade N (Fig 1G), mais pas avec la survie des patients (données non présentées).

Rôles de MED30 dans les cellules cancéreuses de la prolifération, la migration et l'invasion de l'estomac

Pour examiner les rôles de MED30 dans la carcinogenèse gastrique, nous avons examiné les effets de MED30 knockdown ou surexpression sur la prolifération, la migration et l'invasion des six lignées de cellules de cancer gastrique (SNU1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638 et NCI -N87 cellules). PCR en temps réel et western blot ont été utilisés pour analyser l'effet de choc et la surexpression de MED30 en SNU216 et SNU638 cellules (figure 2A-2C). Lorsque ces cellules ont été transfectées avec MED30 ARNsi (100 nM), l'expression MED30 diminué au taux d'ARNm de protéine et d'environ 80% deux jours plus tard par rapport à SCR ARNsi et MED30 surexpression par transfection d'ADNc a augmenté les taux de protéine MED30 ARNm et par rapport à vide contrôle par vecteur cellules transfectées (cellules simulées) de plus de 3 fois.

Nous avons ensuite étudié le rôle de MED30 dans la prolifération des cellules cancéreuses. Les tests de prolifération ont été réalisées 5 jours après transfection avec SCR ou MED30 siRNA. Knockdown de MED30 inhibé les proliférations de toutes les cellules cancéreuses gastriques testés (SNU16, SNU216, SNU620 et SNU638) versus SCR de 18%, 68%, 98% et 42%, respectivement (figure 2D). Des résultats similaires ont été observés lorsque nous avons effectué des essais de prolifération de deux ou trois jours après la transfection (données non représentées). Constamment, MED30 surexpression amélioré les croissances de SNU216 et SNU638 cellules de 1,9 et 2,2 fois, respectivement, par rapport aux cellules simulées.

Pour déterminer le rôle joué par MED30 dans la migration des cellules de cancer gastrique, nous avons utilisé une chambre de Boyden essai. Knockdown de diminution de la migration MED30 FBS induites par des cellules et SNU216 SNU638 de 90% et 52%, respectivement, par rapport aux cellules transfectées (SCR figure 3A et 3C). En outre, MED30 surexpression augmente la migration FBS-induite des cellules SNU216 et SNU638 de 3,2 et 2,8 fois, respectivement, par rapport aux cellules simulées (figure 3B et 3C). Ces résultats nous ont amenés à examiner le rôle de MED30 dans l'invasion des cellules cancéreuses gastriques. Dans un essai d'invasion Matrigel, MED30 siRNA inhibée invasions FBS-induites de cellules SNU216 et SNU638 contre SCR siRNA de 64% et 47%, respectivement (figure 4A et 4C), et MED30 surexpression accéléré les invasions FBS-induites de SNU216 et SNU638 cellules par rapport aux cellules simulées par 2,5 et 2,2 fois, respectivement (figure 4B et 4C).

effet de MED30 knockdown sur in vivo
tumorigénicité

Pour examiner l'effet de MED30 sur la croissance tumorale, on a injecté par voie sous- cutanée SNU638 cellules transfectées avec SCR ou MED30 ARNsi dans des souris SCID, puis suivie de la croissance tumorale pendant sept semaines (figure 5A). Des tumeurs palpables ont été détectés dans les trois semaines dans les côtés de contrôle SCR. Cependant, les cellules cancéreuses transfectées avec l'ARNsi MED30 ont présenté une croissance plus lente. Sept semaines après l'injection, les souris ont été sacrifiées et les volumes tumoraux et les poids ont été mesurés (figure 5B et 5C). Les résultats ont montré MED30 volumes et les poids des tumeurs knockdown considérablement réduit.

Réglementation de la voie EMT par MED30

Pour déterminer le mécanisme sous-jacent à la promotion de la cancérogenèse gastrique par MED30, nous avons étudié les profils d'expression des gènes impliqué dans épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT: un processus clé dans la métastase et l'invasion) par PCR en temps réel. Knockdown de MED30 a légèrement augmenté le niveau de la E-cadhérine (CDH1) ARNm dans SNU638 cellules contre SCR transfection, mais a diminué expressions de N-cadhérine (CDH2), P-cadhérine (CDH3) et vimentine (VIM) de 42%, 36% et 41%, respectivement (figure 6A). Constamment, MED30 surexpression a diminué les taux CDH1 d'ARNm de 35% par rapport aux cellules simulées, mais il a augmenté les expressions de N-cadhérine (CDH2), P-cadhérine (CDH3), la famille de torsion bHLH facteur de transcription 1 et 2 (TWIST1 /2), et vimentine (VIM) de 2,9, 3,3, 3,4, 2,4, 2,2 et 4,2 fois, respectivement (figure 6A). Les taux d'ARNm de la famille d'escargot doigt de zinc 1 et 2 (SNAI1 /2) sont demeurés inchangés. Nous avons ensuite confirmé que MED30 surexpression a également augmenté les niveaux de E-cadhérine, la N-cadhérine, P-cadhérine, TWIST1 et vimentine (figure 6B) protéines. Un examen de la morphologie des cellules SNU638 a révélé que MED30 surexpression déclenché une transition d'un pavé semblable à un fibroblaste morphologie allongée (figure 6C), alors que MED30 knockdown n'a pas modifié la morphologie (données non présentées). Ces résultats suggèrent que MED30 régule positivement EMT.

Discussion

Les rôles fonctionnels de la sous-unité MED30 MED (également connu sous le nom TRAP25) sont mal compris. Dans un rapport récent, MED30 a été trouvé à jouer un rôle important dans la régulation des fonctions et de l'intégrité mitochondriale chez les souris homozygotes [19]. Dans la présente étude, nous avons examiné les rôles fonctionnels de MED30 lors de la progression du cancer gastrique. Il a été trouvé MED30 réglementé la prolifération, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques et leur in vivo
tumorigène. Après s'être assuré knock-down et de l'efficacité de la surexpression par quantitative PCR en temps réel et analyse par Western Blot (Figure 2), nous avons constaté que MED30 effet de choc remarquablement supprimé la prolifération, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques et que MED30 surexpression a les effets opposés (fig 2-4). De plus MED30 knockdown réduite in vivo
tumorigénicité (figure 5). Par ailleurs, nous avons également constaté que MED30 était surexprimé dans les tissus du cancer de l'estomac et des lignées cellulaires de cancer gastrique (figure 1). Ces résultats suggèrent que MED30 pourrait jouer un rôle physiopathologiques importants pendant la carcinogenèse gastrique.

Depuis les sous-unités MED spécifiques sont associés à des facteurs de signal activé par transcription et de l'ARN polymérase II (Pol II) [20] et fonctionnent comme des conduits et des intégrateurs pour canaliser différentes voies de signalisation, comme par la voie de l'hormone nucléaire du récepteur (par l'intermédiaire MED1) [21], la voie du TGF-β et de signalisation (par l'intermédiaire MED12 ou MED15) [22, 23], la voie de signalisation Wnt (par l'intermédiaire MED12) [ ,,,0],24] et la voie de signalisation Ras-MAPK (par l'intermédiaire MED23) [25-27]. Il a été proposé que ces voies de signalisation peuvent induire EMT [28-32], qui est connue pour être associée à la métastase, l'invasion, la prolifération et la chimiorésistance du cancer épithélial [29, 33, 34]. Par conséquent, nous avons demandé si MED30 déclenche EMT. MED30 induit l'expression de gènes EMT-connexes (N-cadhérine; CDH2, P-cadhérine; CDH3, twist related protein 1 et 2; TWIST1 /2, vimentine; VIM), mais a inhibé l'expression de la E-cadhérine (CDH1) un suppresseur de tumeur connu (figure 6A et 6B). En outre, MED30 surexpression induit une morphologie de type fibroblaste (figure 6C), ce qui suggère MED30 déclenche EMT dans les cellules de cancer gastrique.

Résumer, la présente étude soutient l'idée que MED30 agit comme un oncogène durant la carcinogenèse gastrique et suggère MED30 pourrait réguler EMT dans le cancer gastrique. Bien que d'autres études sont nécessaires pour déterminer comment MED30 déclenche EMT, nos résultats suggèrent que MED30 être considéré comme une cible moléculaire nouvelle pour le traitement du cancer gastrique.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Bio & Programme Medical Technology Development (2012M3A9C6050213) et de la Fondation de base de recherche en sciences (2012R1A1A3010521) de la National Research Foundation (NRF), financé par le gouvernement coréen (MEST), et par une subvention de la National R & D Programme de lutte contre le cancer, Ministère de la Santé , le bien-être et de la famille, République de Corée (0.920.050).

• PLOS ONE: Rôles de DPY30 dans la prolifération et la motilité du cancer gastrique Cells
• PLOS ONE: Photoimmunotherapy de cancer gastrique carcinose péritonéale dans un Model