PLoS ONE: MED30 Regelt de verspreiding en de beweeglijkheid van maagkanker Cells

Abstract

MED30 is een essentieel lid van de mediator complex dat een hub tussen transcriptieactievatoren en RNA-polymerase II vormt. Echter, de uitdrukkingen en de rol van MED30 zijn slecht met het kenmerk van kanker. In dit onderzoek onderzochten we de functionele rol van MED30 tijdens maagkanker progressie. Het bleek dat MED30 werd overexpressie in maagkanker weefsels en cellijnen. Bovendien MED30 overexpressie verhoogde de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen, terwijl MED30 knockdown deze effecten remde. Verder is de knockdown remde significant tumorvorming in SCID muizen. MED30 bevorderde ook de uitingen van genen betrokken bij epitheliale-mesenchymale transitie en geïnduceerde een fibroblast-achtige morfologie. Deze studie toont MED30 heeft pathofysiologische rol bij de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen en stelt MED30 moet worden gezien als een krachtig therapeutisch doelwit voor maligne maagcarcinoom

Citation: YJ Lee, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) MED30 Regelt de verspreiding en de beweeglijkheid van maagkanker Cells. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10.1371 /journal.pone.0130826

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 22 september 2014; Geaccepteerd: 26 mei 2015; Gepubliceerd: 25 juni 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door de Bio & Medical Technology Development Program (2012M3A9C6050213) en Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) van de National Research Foundation (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (MEST) en een subsidie ​​van de National R & D Program for Cancer Control, Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Gezin, de Republiek Korea (0.920.050). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een van de belangrijkste oorzaken van overlijden door kanker wereldwijd [1, 2]. Ongeveer 95% van de maag kankers zijn adenocarcinomen en in epidemiologische studies maagkanker is geclassificeerd door anatomische site als cardia /proximale of noncardia /distale [3] en door histologische fenotype als intestinale, diffuus, of gemengde /niet te classificeren, zoals beschreven door Lauren [4 ]. Bovendien patiënten met proximale maagkanker slechtere overleving onafhankelijk van TNM [5]. Helicobacter pylori
infectie is aangetoond dat een etiologisch agens van gastrische kanker, met name kanker in het distale magen van oudere mannen, die meestal van de intestinale type zijn. Meer recent zijn verschillende moleculaire classificaties van maagkanker voorgesteld op basis van de bevindingen van de hele genoom genexpressie studies en /of gen kopie aantal studies [6-10].

gentranscriptieregulatie is een cruciale stap dat de controles celidentiteit, groei, differentiatie en ontwikkeling. Menselijke mediator (MED) complex, dat geheel ~ 30 eiwitten, is een belangrijke co-activator /activator van de uitingen van RNA polymerase II (Pol II) -transcribed genen [11]. MED complex vergemakkelijkt de pre-initiatie complex (PIC) montage door interactie met Pol II en gen-specifieke transcriptiefactoren (TF), zoals TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF en TFIIH [12, 13]. MED complex bestaat uit drie verschillende structurele submodules (hoofd, midden en staart). Het hoofd module direct samenwerkt met Pol II, terwijl de langgerekte staart module interageert met gen-specifieke regulerende eiwitten [12, 13], en de middelste module werkt in de regelgeving signaaloverdracht bij een post-bindende fase [13]. Hoewel het mechanisme niet volledig begrepen, MED complex strak bindt aan Pol II, verandert de conformatie en gaat de transcriptie initiatie proces [14, 15]. Aangezien MED complex is een essentieel onderdeel van de transcriptie machinerie meeste subeenheden in de kern van MED vereist voor embryonale groei en levensvatbaarheid van de cellen [16].

Cancer genoom sequencing studies hebben gemeld mutaties of veranderingen in de RNA transcriptie machines componenten in MED subeenheden en correlaties tussen een aantal van deze veranderingen in MED subeenheden, (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8 en cycline C) en de progressie van kanker zijn gemeld voor diverse vormen van kanker, hoewel de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de deze correlaties onbekend [17].

Onlangs werd bericht dat een MED19 kan deelnemen aan maagkanker progressie als knockdown remde significant celproliferatie en kolonie vorming capaciteit en geïnduceerde fase G1 celcyclus arrestatie twee menselijke maagkanker cellijnen (SGC7901 en MGC803) [18]. De functionele rollen en pathologische belang van andere subeenheden MED bij maagkanker onduidelijk.

In deze studie, het functionele belang van MED30 onthullen tijdens maagkanker progressie we de rollen in proliferatie onderzocht migratie invasie en tumorigeniciteit van maagkanker cellen. Voordat het functieonderzoek, checkten we de expressie patroon van MED30 bij maagkanker cellen en weefsels.

Materialen en methoden

celculturen en transfectie

Maagkanker cellijnen (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 en N87) werden gekocht van de Koreaanse Cell Line Bank (Seoul). Cellen werden gekweekt in RPMI1640 gesupplementeerd met 25 mM HEPES, 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 ug /ml penicilline /streptomycine (1 x P /S) in 5% CO _{2/95% lucht bij 37 ° C. Cellen werden getransfecteerd met siRNA gebruikt DharmaFECT reagens 1 of 3 (Dharmacon, Lafayette, CO), volgens de instructies van de fabrikant. De sequenties van siRNA waren als volgt: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea), 5'-GCA CGA UCC ACU UAU AUA U (dTdT) -3 ', 5'-GCU GCC AAA CAC UGG UGU U (dTdT) - 3 'en 5'-CGA GAA GAA GCU AUU GUA A (dTdT) -3'; roerei (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5'-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 '.}

MED30 overexpressie

Met het oog op de bouw van MED30- overexpressie vector, gebruikten we pLenti6.3-V5 /DEST lentivirale vector (Invitrogen, Carlsbad, CA). In het kort werd MED30 cDNA gekloond in pLenti6.3-V5 /DEST vector met behulp van de In vivo
-recombinatie gebaseerde Gateway klonen systeem (Invitrogen). De donorvector (pDONR221) die de coderende sequentie van MED30 (MED30 cDNA) werd gekocht bij Ultimate ^{TM ORF klonen (Invitrogen), en opnieuw met het contra-selecteerbare ccdB
gen van de Gateway bestemmingsvector pLenti6.3-V5 /DEST met behulp van de LR clonase enzymmengsel (Invitrogen). De lege vector pLenti6.3 /V5-DEST werd gebruikt als een mock controle. Recombinant lentivirussen werden geproduceerd in 293FT cellen en gebruikt om SNU638 cellen te infecteren volgens de instructies van de fabrikant (ViraPower Lentivirale Expression System, Invitrogen). Stabiele cellijnen werden vastgesteld door selectie met blasticidine (7,5 ug /ml) (Invitrogen).}

Real-time PCR

Maagkanker weefsels werden verkregen na verkregen schriftelijke toestemming van patiënten die chirurgie ondergingen resectie van Pusan ​​National University Hospital of Pusan ​​National University Yangsan Hospital. De studie werd goedgekeurd door de Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) en de Pusan ​​National University Hospital Yangsan-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Totaal RNA werd geëxtraheerd uit weefsels of cellen met behulp van Trizol reagens (Invitrogen) of de RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) volgens de instructies van de fabrikant. cDNA werd gesynthetiseerd met behulp MMLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI), dNTP en oligo-dT primers. De sequenties van de primers waren als volgt: MED30, 5'- ACC GGT CAA TAA AGC TAC AGG A-3 '(sense) en 5'-GTT TAA GCT CGA CTG GAA TGG G-3' (antisense); CDH1, 5'-TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC -3 'en 5'-CTC AGC AGT CCG GGA AAT GG -3'; CDH2, 5'CAC TGT GGA GCC TGA TGC CA -3 'en 5'-TCC CCA ATG TCT CCA GGG TG -3'; CDH3, 5'-CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC -3 'en 5'-ACG CCA CGC TGG TGA GTT GG -3'; TWIST1, 5'-CGG GAG TCC GCA GTC TTA-3 'en 5'-TGG ATC TTG CTC AGC TTG TC -3'; TWIST2, 5'-CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT-3 'en 5'-TAG CCA AGC AAT CAC GGA GA -3'; VIM, 5'-TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G-3 'en 5'-TAG CAG CTT CAA CGG CAA AGT TC -3'; SNAI1, 5'-GAG GCG GTG GCA GAC TAG-3 'en 5'-GAC ACA TCG GTC AGA CCA G-3'; SNAI2, 5'-TAG GAA GAG ATC TGC CAG AC-3 'en 5'-CCC CAA GGC ACA TAC TGT TA -3'; GAPDH, 5'-GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT-3 'en 5'-TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G-3'. Real-time PCR werd uitgevoerd met een LightCycler ^{TM 96 real-time PCR systeem (Roche, Nutley, NJ, USA) met FastStart DNA Essentiele Green Master (Roche) volgens de instructies van de fabrikant. GAPDH werd gebruikt als interne controle.}

Western blotanalyse

De cellen werden gelyseerd met RIPA buffer, cocktail van proteaseremmers werd toegevoegd en proteïneconcentraties werden bepaald met de Bio-Rad eiwit assay kit ( Bio-Rad, Hercules, CA). Monsters (80 ug /putje) werden onderworpen aan SDS-PAGE en vervolgens overgebracht op PVDF-membranen. Anti-MED30 (1: 500, Protein Tech.787-1-AP, Chicago, IL), anti-E-cadherine (1: 1000, BD Bioscienceɢ.181, San Jose, CA), anti-N-cadherine (1 1000, BD Bioscienceɢ920), anti-P-cadherine (1: 1000, BD Bioscienceɢ227), anti-TWIST1 /2 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology # sc-15393, Santa Cruz, CA), anti -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Carpentaria, CA) en anti-β-actine (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology # sc-47.778) antilichamen werden verdund in 5% magere melk en geïncubeerd met membranen bij 4 ° C 's nachts. De geschikte secundaire antilichaam werd toegepast (1: 2000, mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-muis of anti-konijn) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Chemiluminescentiedetectie (GE Healthcare, Little Chalfont, Verenigd Koninkrijk) werd gebruikt voor het visualiseren MED30, E-cadherine, N-cadherine, P-cadherine, TWIST1, vimentine en β-actine. Western blot analyse werd uitgevoerd in drievoud.

Immunohistochemie

Tissue microarray secties met maagkanker weefsels van patiënten werden verkregen uit SuperBiochip (Seoul). Histopathologische diagnoses werden uitgevoerd bij de afdeling Pathologie, Pusan ​​National University Hospital, en clinicopathologic enscenering werd uitgevoerd met behulp van de TNM classificatie (AJCC, 7th ed.). Alle patiënten hadden histologisch bevestigd maagkanker en tumormonsters werden geverifieerd aan tumorweefsel bestaat meer dan 80% van de monsters te verzekeren. Voor immunohistochemie werden objectglaasjes paraffine ontdaan en gerehydrateerd, behandeld met 0,3% waterstofperoxide gedurende 30 minuten om endogene peroxidase activiteit te blussen, en geblokkeerd met 10% normaal serum ezel (NDS) en 1% BSA in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). De objectglaasjes werden vervolgens gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C in blokkerende buffer met primair antilichaam (anti-humaan MED30, 01:50, Proteintech). Secundair antilichaam (HRP-geconjugeerd) binding werd uitgevoerd bij een verdunning van 1: 200 in blokkerende buffer gedurende 2 uur bij KT. Glasplaatjes werden daarna gekleurd voor HRP (Vector Laboratories) en tegengekleurd met hematoxyline kleuring buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gedurende 1 min. Percentages van cellen die gekleurd voor MED30 in secties werden bepaald en secties werden vervolgens ingedeeld met behulp van een 1-4 schaal (1, < 24%, 2, 25-49%, 3, 50-74%, 4, 75-100% ). Intensiteiten van tumorcel kleuring werden beoordeeld als 0, 1, 2 of 3, die respectievelijk overeenkwamen met basale, zwak, matig en sterk. Gemiddelde kleuring werd vervolgens vertegenwoordigd door samengestelde scores die werden berekend met deze twee klassen te vermenigvuldigen. Dienovereenkomstig totale bevlekt werd ingedeeld van 0 tot 12.

celproliferatie assay

Om het effect van siRNA op de proliferatie van maagkanker cellen onderzocht kweekmedia werden vervangen door 1% FBS medium een dag na de siRNA transfectie. Vijf dagen na de transfectie werd 10 gl Ez-Cytox (ITSBIO, Seoul) toegevoegd en cellen werden gedurende 0,5 tot 2 uur bij normale kweekomstandigheden. Vervolgens werd de absorptie bij 450 nm met een ELISA reader (TECAN, Mannedorf, Zwitserland). Om het effect van overexpressie MED30 onderzoeken werden cellen geënt in 1% FBS medium. Drie dagen na het zaaien 10 ul van Ez-Cytox werd toegevoegd.

Boyden kamer assay

De onderste kamer van een transwell kamer werd gevuld met medium dat 10% FBS. Eén dag na transfectie met scrambled (SCR) of MED30 siRNA werden maagkanker cellen gezaaid in de bovenste kamer met een dichtheid van 5 x 10 ^{5 cellen /ml in 50 ul serumvrij medium. Om de effecten van overexpressie MED30 onderzoeken cellen (mock en MED30-over) werden geënt bij een dichtheid 1 x 10 5 cellen /ml. Proliferatie geassocieerde effecten, mitomycine C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) werd toegevoegd elimineren. Men liet de cellen migreren gedurende vier tot zes uur. Membranen werden vervolgens gefixeerd en gekleurd met Diff-Quik-oplossing (Sysmex, Kobe, Japan) en gewassen met gedestilleerd water. Cel aantallen in 10 willekeurig gekozen velden werden geteld met behulp van een lichtmicroscoop.}

Matrigel invasie assay

Het vermogen van maagkanker cellen binnen te vallen werd onderzocht met behulp van 24-well BioCoat ^{TM Matrigel TM kamer inserts (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Het bovenoppervlak van inserts invasie kamers werden gecoat met 0,5 mg /ml groeifactor-gereduceerde Matrigel (BD Bioscience) en het bodemoppervlak met 0,5 mg /ml fibronectine (Sigma-Aldrich). Eén dag na transfectie met SCR of MED30 siRNA werden cellen geënt bij een dichtheid van 5 x 10 4 cellen /ml in serum-vrij medium tot 8 um poreuze BioCoat Matrigel kamer inserts, en geplaatst in putjes gevuld met 750 gl medium aangevuld met 10% FBS als een chemoattractant. Om de effecten van MED30 overexpressie cellen (mock en MED30-overexpressie cellen) te onderzoeken werden uitgezaaid met een dichtheid 1 x 10 4 cellen /ml. Om proliferatie geassocieerde effecten, mitomycine C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) werd toegevoegd verwijderen. Na incubatie gedurende 24 uur werden de niet-binnendringende cellen op bovenoppervlakken van membranen verwijderd door schrapen. Binnenvallende cellen op bodemvlakken werden vastgesteld, en gekleurd met Diff-Quik-oplossing. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd en ten minste 5 velden werden geteld per experiment.}

xenograft assay

De SNU638 cellen werden getransfecteerd met SCR of MED30 siRNA. Na 2 dagen werden de cellen verzameld door behandeling met trypsine, tweemaal met PBS gewassen en werden subcutaan (1 x 10 ^{6 cellen in 100 pi PBS) in ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID) muizen. Tumorvolumes werden berekend per week vanaf week drie tot zeven weken na de injectie met de volgende formule: tumorvolume (mm 3) = ( een
× b
2 ) /2, waarbij een
= lengte in mm en b
= breedte in mm. Zeven weken werden de muizen opgeofferd en tumorvolumes en gewichten werden geregistreerd. Dit experiment werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, afgegeven door de National Institute of Health. De Pusan ​​National University Institutional Animal Care en gebruik Comite (PNUIACUC) keurde het experimentele protocol.}

Statistische analyse

De resultaten worden weergegeven als het gemiddelde ± SD's. Niet-parametrische Mann-Whitney U test of t-toets (ongepaard) werd toegepast om de betekenissen van verschillen tussen de gemiddelde waarden van twee groepen te bepalen, en één-factor variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door meervoudige vergelijkingen Tukey gebruikt analyseren drie of meer groepen. * Geeft een P
waarde van < 0,05. Overlevingstijd werd gedefinieerd als de tijd tussen behandeling en dood of totdat de laatste doelstelling follow-up informatie werd verkregen. De Kaplan-Meier-methode werd gebruikt om de relatie tussen de overleving en MED30 expressie te bepalen. Curves werden vergeleken met behulp van de log-rank test bij een significantie niveau van 95%. P
waarden van < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van SPSS-software versie 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultaten

Overexpressie van MED30 bij maagkanker weefsels

Om rollen te onderzoeken door MED30 bij maagkanker, we eerst gekeken naar de expressie status van MED30 in de tumor weefsel van 23 patiënten met maagkanker. MED30 eiwit bleek schaal overexpressie in kankerweefsel gebieden (figuur 1A-1D), en is uiteraard overexpressie in binnendringende maagkanker cellen (figuur 1C) en in metastatische kankercellen in lymfklieren (figuur 1D). Om onze immunohistochemie valideren, voerden we kwantitatieve real-time PCR op maagkanker weefsels met behulp MED30-specifieke primers. Zoals getoond in figuur 1F, is DPY30 overexpressie in 10 gevallen (10/23, 43%). We onderzochten ook de expressie patroon van MED30 bij maagkanker cellijnen door real-time PCR, en vond het te zijn overexpressie in vijf van de maagkanker cellijnen getest (behalve SNU1) versus normale maag weefsels (figuur 1E). De correlatie tussen MED30 expressie en klinische eigenschappen te onderzoeken, voerden we immunohistochemie gebruikt 41 maagkanker weefselmonsters (tabel 1). Interessant is dat de expressie van MED30 positief gecorreleerd met N-stadium (figuur 1G), maar niet bij patiënten overleven (gegevens niet getoond).

Rollen van MED30 bij de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen

Om rollen van MED30 in de maag carcinogenese te onderzoeken, onderzochten we de effecten van MED30 knock-down of overexpressie op de proliferatie, migratie en invasie van de zes maagkanker cellijnen (SNU1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638 en NCI -N87 cellen). Real-time PCR en Western blot werden gebruikt om de knockdown en overexpressie van MED30 in SNU216 en SNU638 cellen (figuur 2A-2C) te analyseren. Wanneer deze cellen werden getransfecteerd met siRNA MED30 (100 nM), MED30 expressie verminderd op het eiwit en mRNA met ongeveer 80% twee dagen later versus SCR siRNA en MED30 overexpressie van cDNA transfectie toegenomen MED30 mRNA en eiwitniveaus versus lege controle vector- getransfecteerde cellen (mock cellen) van meer dan 3-voudige.

vervolgens onderzochten we de rol van MED30 bij de proliferatie van kankercellen. Proliferatiebepalingen werden 5 dagen na transfectie met SCR of MED30 siRNA. Knockdown van MED30 remde de proliferatie van maagkanker cellen getest (SNU16, SNU216, SNU620 en SNU638) versus SCR met 18%, 68%, 98% en 42%, respectievelijk (figuur 2D). Soortgelijke resultaten werden waargenomen wanneer we proliferatie assays uitgevoerd twee of drie dagen na transfectie (gegevens niet getoond). Consequent, MED30 overexpressie de gezwellen van SNU216 en SNU638 cellen verbeterde met 1,9 en 2,2 maal, respectievelijk, versus mock-cellen.

Om de rol van MED30 in de migratie van maagkanker cellen te bepalen, gebruikten we een Boyden-kamer assay. Knockdown van MED30 verlaagde FBS geïnduceerde migratie van SNU216 en SNU638 cellen met 90% en 52%, respectievelijk, versus SCR getransfecteerde cellen (Figuur 3A en 3C). Bovendien MED30 overexpressie verhoogde de FBS-geïnduceerde migratie van SNU216 en SNU638 cellen door 3,2 en 2,8 maal, hetgeen versus Mock-cellen (Figuur 3B en 3C). Dit resultaat leidde ons naar de rol van MED30 bij de invasie van maagkanker cellen onderzocht. In een Matrigel invasie assay MED30 siRNA remde FBS geïnduceerde invasies van SNU216 en SNU638 cellen versus SCR siRNA met 64% en 47%, respectievelijk (figuur 4A en 4C) en MED30 overexpressie versneld FBS geïnduceerde invasies van SNU216 en SNU638 cellen versus mock cellen met 2,5 en 2,2 maal, respectievelijk (figuur 4B en 4C).

effect van MED30 knock-down op de in vivo
tumorgeniciteitsonderzoek

Om het effect van MED30 op onderzoeken tumorgroei, we subcutaan SNU638 cellen die met SCR of MED30 siRNA in SCID muizen en vervolgens gecontroleerd tumorgroei gedurende zeven weken (figuur 5A). Voelbare tumoren werden ontdekt binnen drie weken in de SCR controle zijkanten. Echter, kankercellen getransfecteerd met siRNA MED30 vertoonden langzamere groei. Zeven weken na injectie werden de muizen opgeofferd en tumor volumes en gewichten werden gemeten (Figuur 5B en 5C). De resultaten toonden aan MED30 knock-down aanzienlijk verminderd tumor volumes en gewichten.

verordening van EMT route door MED30

Om het mechanisme achter de bevordering van de maag carcinogenese door MED30 bepalen, onderzochten we de expressie patronen van genen die betrokken zijn bij epitheliale-mesenchymale transitie (EMT: een belangrijke proces metastase en invasie) door real-time PCR. Knockdown van MED30 licht verhoogd het niveau van E-cadherine (CDH1) mRNA in SNU638 cellen versus SCR transfectie, maar daalde uitingen van N-cadherine (CDH2), P-cadherine (CDH3) en vimentine (VIM) met 42%, 36% en 41%, respectievelijk (figuur 6A). Consequent, MED30 overexpressie verlaagde CDH1 mRNA met 35% versus mock cellen, maar verhoogde de uitingen van N-cadherine (CDH2), P-cadherine (CDH3), draai familie bHLH transcriptiefactor 1 en 2 (TWIST1 /2), en vimentine (VIM) van 2,9, 3,3, 3,4, 2,4, 2,2 en 4,2 maal, respectievelijk (figuur 6A). De mRNA-niveaus van slak familie zinkvinger 1 en 2 (SNAI1 /2) waren onveranderd. Vervolgens bevestigde dat MED30 overexpressie verhoogde ook de eiwitniveaus van E-cadherine, N-cadherine, P-cadherine, TWIST1 en vimentine (figuur 6B). Een onderzoek van de morfologie van SNU638 cellen onthulde dat MED30 overexpressie leidde tot een overgang van een geplaveide-achtige om een ​​langwerpig fibroblast-achtige morfologie (figuur 6C), terwijl MED30 knockdown niet morfologie heeft gewijzigd (gegevens niet getoond). Deze resultaten suggereren dat MED30 positief reguleert EMT.

Discussie

De functionele rol van de MED-subunit MED30 (ook bekend als TRAP25) worden slecht begrepen. In een recent rapport, werd MED30 gevonden om een ​​belangrijke rol in het reguleren van de mitochondriale functies en integriteit in homozygote muizen [19] spelen. In de huidige studie, onderzochten we de functionele rol van MED30 tijdens maagkanker progressie. Gebleken MED30 regelde de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen en hun In vivo
tumorigeniciteit. Nadat verzekerd knockdown en overexpressie efficiëntie door kwantitatieve real-time PCR en Western blot analyse (figuur 2), vonden we dat MED30 knockdown opmerkelijk onderdrukt de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen en dat MED30 overexpressie had het tegenovergestelde effect (Fig 2-4). Bovendien MED30 knockdown verminderd In vivo
tumorgeniciteitsonderzoek (Figuur 5). Verder vonden we ook dat MED30 werd overexpressie in maagkanker weefsels en maagkanker cellijnen (figuur 1). Deze resultaten suggereren dat MED30 belangrijke pathofysiologische rol bij maagkanker kan spelen.

Sinds specifieke MED subeenheden zijn gekoppeld signaal geactiveerde transcriptiefactoren en RNA polymerase II (Pol II) [20] en functioneren als kanalen en integrators channeling verschillende signaalwegen, zoals de nucleaire hormoon receptor route (via MED1) [21], de TGF-β signaleringsroute (via MED12 of MED15) [22, 23], de Wnt-signaleringsroute (via MED12) [ ,,,0],24], en de Ras-MAPK signaalroute (via MED23) [25-27]. Er werd voorgesteld dat deze signaalroutes EMT [28-32], waarvan bekend is dat betrokken bij de metastase, invasie, proliferatie en chemoresistance van epitheliale kanker [29, 33, 34] kan induceren. Daarom hebben we gevraagd of MED30 triggers EMT. MED30 geïnduceerde uitingen van EMT-gerelateerde genen (N-cadherine, CDH2, P-cadherine, CDH3, draai gerelateerd eiwit 1 en 2, TWIST1 /2, vimentine, VIM), maar remde de expressie van E-cadherine (CDH1) een bekende tumor suppressor (figuur 6A en 6B). Bovendien MED30 overexpressie veroorzaakte een fibroblast-achtige morfologie (figuur 6C), wat suggereert MED30 triggers EMT bij maagkanker cellen.

Samenvattend, de huidige studie ondersteunt de gedachte dat MED30 fungeert als een oncogen tijdens de maag carcinogenese en suggereert MED30 kunnen reguleren EMT bij maagkanker. Hoewel verdere studies zijn nodig om te bepalen hoe MED30 triggers EMT, onze resultaten suggereren dat MED30 worden beschouwd als een nieuwe moleculaire doelwit voor de behandeling van maagkanker.

Dankwoord

Dit werk werd ondersteund door de Bio & Medical Technology Development Program (2012M3A9C6050213) en Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) van de National Research Foundation (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (MEST), en door een subsidie ​​van het Nationaal R & D Program for Cancer Control, Ministerie van Volksgezondheid , Welzijn en Gezin, de Republiek Korea (0.920.050).

• PLoS: Rol van DPY30 in de proliferatie en motiliteit van maagkanker Cells
• PLoS ONE: Photoimmunotherapy van maagkanker peritonitis carcinomatosa in een muis Model