PLoS ONE: MED30 Regola la proliferazione e la motilità del cancro gastrico Cells

Estratto

MED30 è una componente essenziale del complesso mediatore che forma un hub tra attivatori trascrizionali e RNA polimerasi II. Tuttavia, le espressioni ei ruoli di MED30 sono state scarsamente caratterizzato cancro. In questo studio, abbiamo esaminato i ruoli funzionali di MED30 durante la progressione del cancro gastrico. Si è constatato che MED30 stato overexpressed in tessuti di cancro gastrico e linee cellulari. Inoltre, MED30 sovraespressione aumentato la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico, mentre MED30 atterramento inibito questi effetti. Inoltre, l'atterramento tumorigenicità inibito significativamente nei topi SCID. MED30 anche promosso le espressioni di geni legati alla transizione epitelio-mesenchimale e indotto una morfologia dei fibroblasti-like. Questo studio mostra MED30 ha ruoli fisiopatologici della proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico e suggerisce che MED30 dovrebbe essere considerata come un obiettivo terapeutico potente per la gastrica carcinoma

Visto maligno: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, oh così (2015) MED30 Regola la proliferazione e la motilità delle cellule cancro gastrico. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10.1371 /journal.pone.0130826

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Stati Uniti |

Ricevuto: 22 settembre 2014; Accettato: 26 Maggio 2015; Pubblicato: 25 giugno 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

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Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Bio & Medical Technology Program Development (2012M3A9C6050213) e Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF), finanziato dal governo coreano (MEST) e una sovvenzione da parte di R &nazionale; D Programma per il controllo del cancro, Ministero della Salute, del Welfare e della Famiglia, Repubblica di Corea (0920050). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico è una delle principali cause di morte per cancro in tutto il mondo [1, 2]. Circa il 95% dei tumori gastrici sono adenocarcinomi e negli studi epidemiologici cancro gastrico è stato classificato dal sito anatomico come cardias /prossimale o noncardia /distale [3] e dal fenotipo istologico come intestinale, diffuso, o misto /non classificabile come descritto da Lauren [4 ]. Inoltre, i pazienti con cancro gastrico prossimale hanno più poveri indipendenti sopravvivenza della TNM fase [5]. Helicobacter pylori
infezione è stato dimostrato di essere un agente eziologico del cancro gastrico, in particolare di tumori trovati negli stomaci distali dei maschi anziani, che sono di solito di tipo intestinale. Più di recente, diverse classificazioni molecolari del cancro gastrico sono stati proposti sulla base dei risultati di studi di espressione genica dell'intero genoma e /o studi numero di copie del gene [6-10].
Regolamento

trascrizionale è un passo cruciale che controlla l'identità delle cellule, la crescita, la differenziazione e lo sviluppo. mediatore umano (MED) complessa, che contiene circa 30 proteine, è una chiave coactivator /attivatore delle espressioni di RNA polimerasi II (Pol II) -transcribed geni [11]. complesso MED facilita l'assemblaggio complesso pre-apertura (PIC) per interazione con Pol II e geni specifici fattori di trascrizione (TFS), quali, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH [12, 13]. MED complesso è costituito da tre moduli strutturali distinti (testa, mezza, e la coda). Il modulo principale interagisce direttamente con Pol II, mentre il modulo di coda allungata interagisce con le proteine ​​specifiche del gene regolatore [12, 13], e il modulo centrale agisce in trasferimento del segnale normativo in una fase post-binding [13]. Anche se il meccanismo non è pienamente compreso, complesso MED si lega strettamente a Pol II, cambia la sua conformazione e influisce sul processo di iniziazione di trascrizione [14, 15]. Dal complesso MED è un componente essenziale del meccanismo di trascrizione, la maggior parte delle subunità nel nucleo di MED sono necessari per la crescita embrionale e vitalità cellulare [16].

studi di sequenziamento del genoma cancro hanno riferito mutazioni o alterazioni del RNA componenti di macchine di trascrizione contenuti nel subunità MED, e le correlazioni tra alcuni di questi cambiamenti nella subunità MED, (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8, e ciclina C) e la progressione del cancro sono stati segnalati per vari tipi di cancro, anche se i meccanismi responsabili queste correlazioni non sono noti [17].

di recente, è stato riferito che un MED19 può partecipare nella progressione del cancro gastrico, come il suo atterramento significativamente inibito la proliferazione cellulare e la capacità di colonia-formazione, e la fase G1 indotta ciclo cellulare arresto in due linee di cellule di cancro gastrico umano (SGC7901 e MGC803) [18]. Tuttavia, i ruoli funzionali e rilevanza patologica di altre subunità Med in cancro gastrico rimangono poco chiari.

Nel presente studio, a rivelare l'importanza funzionale di MED30 durante la progressione del cancro gastrico, abbiamo esaminato i suoi ruoli nella proliferazione, la migrazione, invasione e tumorigenicità delle cellule di cancro gastrico. Prima dell'esame funzionale, abbiamo controllato il pattern di espressione di MED30 in cellule di cancro gastrico e tessuti.

Materiali e Metodi

Le colture cellulari e trasfezione

linee di cellule di cancro gastrico (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, e N87) sono stati acquistati dalla Corea Cell Line Bank (Seoul). Le cellule sono state coltivate in RPMI1640 integrato con 25 mM HEPES, il 10% di siero fetale bovino (FBS), e 100 mg /ml di penicillina /streptomicina (1 × P /S) a 5% di CO _{2/95% di aria a 37 ° C. Le cellule sono state trasfettate con siRNA usando DharmaFECT reagente 1 o 3 (Dharmacon, Lafayette, CO), secondo le istruzioni del produttore. Le sequenze di siRNA utilizzati sono stati i seguenti: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Corea), 5'-CGA GCA ACU UAU UCC AUA U (dTdT) -3 ', 5'-GCU GCC AAA UGG UGU CAC U (dTdT) - 3 'e 5'-CGA GAA AUU GCU GAA GUA A (dTdT) -3'; strapazzate (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5'-GAU CCG CAA AAG GAA AGC A (dTdT) -3 '.}

MED30 sovraespressione

Al fine di costruire MED30- sopra vettore di espressione, abbiamo usato pLenti6.3-V5 /DEST vettori lentivirali (Invitrogen, Carlsbad, CA). In breve, MED30 cDNA è stato clonato in pLenti6.3-V5 /DEST vettore utilizzando il in vivo
ricombinazione basato sul sistema di clonazione Gateway (Invitrogen). Il vettore del donatore (pDONR221) che contiene la sequenza codificante del MED30 (MED30 cDNA) è stato acquistato da ultimo ^{TM ORF cloni (Invitrogen), e ricombinato con il CCDB contro-selezionabile
gene della destinazione vettore Gateway pLenti6.3-V5 /DEST usando la miscela di enzimi clonase LR (Invitrogen). Il vettore pLenti6.3 /V5-DEST vuoto è stato utilizzato come controllo finto. lentivirus ricombinanti sono state prodotte in 293FT cellule, e utilizzati per infettare le cellule SNU638 secondo le istruzioni del produttore (ViraPower lentivirali Espressione di sistema; Invitrogen). linee cellulari stabili sono stati stabiliti dalla selezione con blasticidin (7,5 mg /ml) (Invitrogen).}

Real-time PCR

tessuti cancro gastrico sono stati ottenuti dopo aver ottenuto il consenso informato scritto da pazienti sottoposti a chirurgia resezione a Pusan ​​National University Hospital o Yangsan Hospital Pusan ​​National University. Lo studio è stato approvato dalla National University Hospital-Institutional Review Board Pusan ​​(PNUH-IRB) e la National University Hospital Yangsan-Institutional Review Board Pusan ​​(PNUYH-IRB). L'RNA totale è stato estratto da tessuti o cellule utilizzando il reagente Trizol (Invitrogen) o il RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), secondo le istruzioni del produttore. cDNA è stato sintetizzato con MMLV trascrittasi inversa (Promega, Madison, WI), dNTP, e primer oligo-DT. Le sequenze dei primer utilizzati sono stati i seguenti: MED30, 5'-ACC GGT TAA CAA AGC TAC AGG A -3 '(senso) e 5'-TAA GTT GCT CGA CTG GAA TGG G -3' (antisenso); CDH1, 5'-TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC -3 'e 5'-CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG -3'; CDH2, 5'-CAC TGT GGA GCC TGA TGC CA -3 'e 5'-TCC ATG CCA TCT CCA GGG TG -3'; CDH3, 5'-CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC -3 'e 5'-ACG CCA CGC TGG TGA GTT GG -3'; TWIST1, 5'-CGG GAG TCC GCA GTC TTA -3 'e 5'-TGG ATC TTG CTC AGC TTG TC -3'; TWIST2, 5'-CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT -3 'e 5'-TAG CCA AGC AAT CAC GGA GA -3'; VIM, 5'-TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G -3 'e 5'-TAG CAG CTT CAA CGG CAA AGT TC -3'; SNAI1, 5'-GAG GCG GTG GCA GAC TAG -3 'e 5'-GAC ACA TCG GTC AGA CCA G -3'; SNAI2, 5'-TAG GAA GAG ATC TGC CAG AC -3 'e 5'-CCC CAA GGC ACA TAC TGT TA -3'; GAPDH, 5'-GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT -3 'e 5'-TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G -3'. Real-time PCR è stata effettuata utilizzando un LightCycler ^{TM 96 in tempo reale del sistema PCR (Roche, Nutley, NJ, USA) con FastStart Essential DNA verde Master (Roche), secondo le istruzioni del produttore. GAPDH è stato utilizzato come controllo interno.}

Western Blot

Le cellule sono state lisate con tampone RIPA, è stato aggiunto inibitore della proteasi cocktail, e le concentrazioni di proteina sono stati determinati utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​Bio-Rad ( Bio-Rad, Hercules, CA). I campioni (80 ug /pozzetto) sono stati sottoposti a SDS-PAGE e poi trasferito su membrana PVDF. Anti-MED30 (1: 500, proteine ​​Tech.787-1-AP, Chicago, IL), anti-E-caderina (1: 1000, BD Bioscienceɢ.181, San Jose, CA), anti-N-caderina (1 1000, BD Bioscienceɢ.920), anti-P-caderina (1: 1000, BD Bioscienceɢ.227), anti-TWIST1 /2 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology # sc-15393, Santa Cruz, CA), anti -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Carpentaria, CA) e anti-β-actina (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology # sc-47778) anticorpi sono stati diluiti in 5% di latte scremato e incubate con membrane a 4 ° C durante la notte. L'anticorpo secondario appropriato è stato applicato (1: 2000, perossidasi di rafano-coniugato anti-topo o anti-coniglio) a temperatura ambiente per 1 ora. rilevazione chemiluminescenza (GE Healthcare, Little Chalfont, Regno Unito) è stato utilizzato per visualizzare MED30, E-caderina, N-caderina, P-caderina, TWIST1, vimentina, e β-actina. Western blot è stata eseguita in triplicato.

L'immunoistochimica

Le sezioni di tessuto microarray contenenti tessuti di cancro gastrico di pazienti sono stati ottenuti da SuperBiochip (Seoul). diagnosi istopatologiche sono state effettuate presso il Dipartimento di Patologia, Pusan ​​National University Hospital, e messa in scena clinicopathologic è stata effettuata utilizzando la classificazione TNM (AJCC, 7 ° ed.). Tutti i pazienti avevano confermato istologicamente cancro gastrico, e campioni di tumore sono stati controllati per garantire che il tessuto tumorale composto più di 80% dei campioni. Per l'immunoistochimica, vetrini sono stati deparaffinate e reidratati, trattato con perossido di idrogeno allo 0,3% per 30 minuti per placare attività della perossidasi endogena, e bloccato con il 10% di siero normale asino (NDS) e 1% di BSA in 1 × tampone fosfato (PBS). I vetrini sono state poi incubate overnight a 4 ° C in tampone di bloccaggio contenente anticorpo primario (MED30 anti-umano; 1:50 Proteintech). anticorpo secondario (HRP-coniugato) legame è stata eseguita ad una diluizione di 1: 200 in tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente. I vetrini sono stati poi colorate per HRP (Vector Laboratories) e di contrasto con ematossilina buffer di colorazione (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) per 1 min. Le percentuali di cellule che macchiato a MED30 nelle sezioni sono state determinate e sezioni sono state quindi classificate utilizzando una scala 1-4 (1, < 24%; 2, 25-49%, 3, 50-74%; 4, 75-100% ). Le intensità di colorazione delle cellule tumorali sono stati classificati come 0, 1, 2 o 3, che corrisponde, rispettivamente, al basale, debole, moderata e forte. colorazione Nel complesso è stato poi rappresentato da punteggi compositi, che sono stati calcolati moltiplicando questi due gradi. Di conseguenza, nel complesso macchiato è stato classificato da 0 a 12.

La proliferazione cellulare saggio

Per esaminare l'effetto di siRNA sulla proliferazione delle cellule di cancro gastrico, terreni di coltura sono stati sostituiti con 1% FBS media uno giorno dopo la trasfezione di siRNA. Cinque giorni dopo la transfezione, 10 ml di Ez-Cytox (ITSBIO, Seoul) è stato aggiunto e le cellule sono state incubate per 0,5-2 ore in condizioni di coltura normali. Poi l'assorbanza è stata misurata a 450 nm usando un lettore ELISA (TECAN, Mannedorf, Svizzera). Per esaminare l'effetto della sovraespressione MED30, le cellule sono state seminate in 1% di media FBS. è stato aggiunto Tre giorni dopo la semina 10 ml di Ez-Cytox.

Boyden test camera di

La camera di fondo di una camera di transwell è stato riempito con terreno contenente 10% FBS. Un giorno dopo la trasfezione con criptato (SCR) o MED30 siRNA, cellule di cancro gastrico sono state seminate nella camera superiore ad una densità di 5 × 10 ^{5 cellule /ml in 50 ml di mezzo privo di siero. Per esaminare gli effetti del MED30 sovraespressione, cellule (finte e MED30-over) sono state seminate ad una densità 1 × 10 5 cellule /ml. Per eliminare proliferazione effetti associati, mitomicina C (0,01 mg /ml, Sigma-Aldrich) è stato aggiunto. Le cellule sono stati autorizzati a migrare per quattro o sei ore. Le membrane sono state poi fissate e colorate utilizzando la soluzione Diff-Quik (Sysmex, Kobe, Giappone) e lavati con acqua distillata. il numero di cellule in 10 campi scelti a caso sono state contate utilizzando un microscopio ottico.}

Matrigel saggio di invasione

La capacità delle cellule di cancro gastrico per invadere è stato studiato utilizzando 24 pozzetti BIOCOAT ^{TM Matrigel inserti in camera TM (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). La superficie superiore di inserti nelle camere invasione sono stati rivestiti con 0,5 mg /ml crescita fattore ridotto Matrigel (BD Bioscience) e la superficie inferiore con 0,5 mg /ml di fibronectina (Sigma-Aldrich). Un giorno dopo la trasfezione con SCR o MED30 siRNA, le cellule sono state seminate ad una densità di 5 × 10 4 cellule /ml in mezzo privo di siero in 8 micron porosi inserti camera BIOCOAT Matrigel, e posti in pozzetti riempiti con 750 microlitri del mezzo supplementato con 10% FBS come fattore chemiotattico. Per esaminare gli effetti del MED30 sovraespressione, cellule (finti e le cellule MED30-overexpressing) sono state seminate ad una densità 1 × 10 4 cellule /ml. Per rimuovere gli effetti di proliferazione associati, mitomicina C (0,01 mg /ml, Sigma-Aldrich) è stato aggiunto. Dopo incubazione per 24 ore, non invadere le cellule sulle superfici superiori delle membrane sono stati rimossi mediante raschiatura. cellule che invadono su superfici inferiori sono state fissate e colorate con soluzione Diff-Quik. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia, e almeno 5 campi sono stati contati per esperimento.}

test dello xenotrapianto

Le cellule sono state trasfettate con SNU638 SCR o MED30 siRNA. Dopo 2 giorni, le cellule sono state raccolte mediante tripsinizzazione, lavate due volte con PBS, e sono state iniettate per via sottocutanea (1 × 10 ^{6 cellule in 100 microlitri di PBS) in combinata grave immunodeficienza (topi SCID). volumi tumorali sono stati calcolati ogni settimana da tre settimana in settimana sette dopo l'iniezione utilizzando la seguente formula: volume del tumore (mm 3) = (
a × b
2 ) /2, dove
a = lunghezza in mm e b
= larghezza in mm. A sette settimane, i topi sono stati sacrificati e sono stati registrati volumi tumorali e pesi. Questo esperimento è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio rilasciate dal National Institute of Health. L'Università Istituzionale cura degli animali e Usa Comitato Pusan ​​National (PNUIACUC) ha approvato il protocollo sperimentale.}

Analisi statistica

I risultati sono presentati come media ± DS. Il non parametrico di Mann-Whitney U-test o t-test di Student (spaiato) è stato utilizzato per determinare i significati delle differenze tra i valori medi di due gruppi, e uno-analisi della varianza (ANOVA) seguita da confronti multipli di Tukey è stato utilizzato analizzare tre o più gruppi. * Indica un Valore P
di < 0.05. Il tempo di sopravvivenza è stato definito come il tempo intercorso tra il trattamento e la morte o fino all'ultimo informazioni oggettive follow-up è stato ottenuto. Il metodo di Kaplan-Meier è stata utilizzata per determinare la relazione tra la sopravvivenza e l'espressione MED30. Le curve sono state confrontate utilizzando il log-rank test a un livello di significatività del 95%. valori P
di < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. I dati sono stati analizzati utilizzando il software SPSS versione 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Risultati

sovraespressione di MED30 nel cancro gastrico tessuti

Per studiare ruoli da MED30 nel carcinoma gastrico, in primo luogo abbiamo esaminato lo stato espressione di MED30 nei tessuti tumorali di 23 pazienti affetti da cancro gastrico. proteine ​​MED30 è risultato essere ampiamente sovraespresso nelle regioni tessuto canceroso (Fig 1A-1D), ed è stato, ovviamente, sovraespresso nel invadere cellule di cancro gastrico (Fig 1C) e nelle cellule tumorali metastatiche all'interno dei linfonodi colpiti (Fig 1D). Al fine di convalidare i nostri risultati di immunoistochimica, abbiamo effettuato quantitativa real-time PCR sui tessuti di cancro gastrico con primer MED30-specifici. Come mostrato in figura 1F, DPY30 è sovraespresso in 10 casi (10/23, 43%). Abbiamo inoltre esaminato il pattern di espressione di MED30 in linee cellulari di cancro gastrico di real-time PCR, e ci è sembrato sovraespresso in cinque delle linee di cellule di cancro gastrico testati (tranne SNU1) rispetto a normali tessuti gastrici (Fig 1E). Per studiare la correlazione tra l'espressione MED30 e le caratteristiche cliniche, abbiamo effettuato immunoistochimica utilizzando 41 campioni di tessuto di cancro gastrico (Tabella 1). È interessante notare che l'espressione di MED30 è stata positivamente correlata con lo stadio N (Fig 1G), ma non con la sopravvivenza del paziente (dati non riportati).

Ruoli di MED30 nella proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico

Per esaminare i ruoli di MED30 nella carcinogenesi gastrica, abbiamo esaminato gli effetti di MED30 atterramento o sovraespressione sulla proliferazione, la migrazione e l'invasione delle sei linee di cellule di cancro gastrico (SNU1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638, e NCI -N87 celle). Real-time PCR e Western Blot sono stati usati per analizzare l'atterramento e sovraespressione di MED30 in SNU216 e SNU638 cellule (fig 2A-2C). Quando queste cellule sono state trasfettate con MED30 siRNA (100 Nm), espressione MED30 diminuita in proteine ​​e livelli di mRNA di circa l'80%, due giorni dopo contro SCR siRNA, e MED30 sovraespressione da cDNA trasfezione maggiore MED30 mRNA e livelli di proteine ​​rispetto vettore di controllo vuota cellule trasfettate (cellule finte) di oltre 3 volte.

Abbiamo poi studiato il ruolo del MED30 nella proliferazione delle cellule tumorali. saggi di proliferazione sono stati eseguiti 5 giorni dopo la transfezione con SCR o MED30 siRNA. Knockdown di MED30 ha inibito la proliferazione di tutte le cellule del cancro gastrico testati (SNU16, SNU216, SNU620, e SNU638) rispetto SCR del 18%, 68%, 98% e 42%, rispettivamente (Fig 2D). Risultati simili sono stati osservati quando abbiamo eseguito saggi di proliferazione due o tre giorni dopo la transfezione (dati non mostrati). Coerentemente, MED30 sovraespressione migliorato le crescite di SNU216 e SNU638 cellule di 1,9 e 2,2 volte, rispettivamente, contro le cellule finte.

Per determinare il ruolo svolto dalla MED30 nella migrazione delle cellule di cancro gastrico, abbiamo usato una camera di Boyden saggio. Knockdown di MED30 diminuita migrazioni FBS-indotta di cellule SNU216 e SNU638 del 90% e 52% rispettivamente, contro cellule trasfettate SCR (Fig 3A e 3C). Inoltre, l'iperespressione MED30 aumentato la migrazione FBS-indotta delle cellule SNU216 e SNU638 del 3,2 e 2,8 volte, rispettivamente, contro le cellule finte (Fig 3b e 3c). Questi risultati ci hanno portato a esaminare il ruolo del MED30 nell'invasione delle cellule di cancro gastrico. In un saggio di invasione Matrigel, MED30 siRNA inibito invasioni FBS-indotta di cellule SNU216 e SNU638 contro SCR siRNA del 64% e 47%, rispettivamente (Fig 4A e 4C), e MED30 sovraespressione accelerato le invasioni FBS-indotti di SNU216 e SNU638 cellule contro le cellule finte rispettivamente 2,5 e 2,2 volte, (fig 4B e 4C).

effetto del MED30 atterramento su in vivo
tumorigenicità

Per esaminare l'effetto di MED30 su la crescita del tumore, che per via sottocutanea iniettato SNU638 cellule trasfettate con SCR o MED30 siRNA in topi SCID, e poi monitorato la crescita del tumore per sette settimane (Fig 5A). tumori palpabili sono stati rilevati entro tre settimane nei lati di controllo SCR. Tuttavia, le cellule tumorali trasfettate con siRNA MED30 esposti crescita più lenta. Sette settimane dopo l'iniezione, i topi sono stati sacrificati e volumi tumorali e pesi sono stati misurati (Fig 5B e 5C). I risultati hanno mostrato MED30 atterramento ridotto significativamente i volumi tumorali e pesi.

Regolamento di EMT percorso da MED30

Per determinare il meccanismo alla base della promozione della carcinogenesi gastrica da MED30, abbiamo studiato i pattern di espressione di geni coinvolti in epitelio-mesenchimale transizione (EMT: un processo chiave in metastasi e l'invasione) mediante real-time PCR. Knockdown di MED30 leggermente aumentato il livello di E-caderina (CDH1) mRNA in SNU638 cellule contro SCR trasfezione, ma è diminuita espressione di N-caderina (CDH2), P-caderina (CDH3) e vimentina (VIM) del 42%, 36% e 41%, rispettivamente (Fig 6A). Coerentemente, MED30 sovraespressione diminuzione dei livelli CDH1 mRNA del 35% rispetto a cellule finte, ma ha aumentato le espressioni di N-caderina (CDH2), P-caderina (CDH3), famiglia torsione bHLH fattore di trascrizione 1 e 2 (TWIST1 /2), e vimentina (VIM) di 2.9, 3.3, 3.4, 2.4, 2.2, e 4.2 volte, rispettivamente (Fig 6A). I livelli di mRNA della famiglia lumaca zinc finger 1 e 2 (SNAI1 /2) sono rimasti invariati. Abbiamo poi confermato che MED30 sovraespressione anche aumentato i livelli di proteina di E-caderina, N-caderina, P-caderina, TWIST1, e vimentina (Fig 6B). Un esame della morfologia delle cellule SNU638 rivelato che MED30 sovraespressione innescato una transizione da un acciottolato simile a un allungata fibroblasti simile morfologia (figura 6C), mentre MED30 atterramento non ha alterato la morfologia (dati non riportati). Questi risultati suggeriscono che MED30 regola positivamente EMT.

Discussione

I ruoli funzionali della subunità MED30 MED (noto anche come TRAP25) sono poco conosciuti. In un recente rapporto, MED30 è stata trovata a svolgere un ruolo significativo nella regolazione delle funzioni e l'integrità mitocondriale nei topi omozigote [19]. Nel presente studio, abbiamo esaminato i ruoli funzionali di MED30 durante la progressione del cancro gastrico. E 'stato trovato MED30 regolata la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico e la loro in vivo
tumorigenicità. Dopo aver verificato atterramento ed efficienza sovraespressione da quantitativa real-time PCR e l'analisi Western Blot (Figura 2), abbiamo scoperto che MED30 atterramento notevolmente soppressa la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico, e che MED30 sovraespressione ha avuto gli effetti opposti (Figs 2-4). Inoltre MED30 atterramento ridotto in vivo
tumorigenicità (Fig 5). Inoltre, abbiamo anche scoperto che MED30 è stato overexpressed nei tessuti di cancro gastrico e linee di cellule di cancro gastrico (Figura 1). Questi risultati suggeriscono che MED30 potrebbe svolgere importanti ruoli fisiopatologici durante la carcinogenesi gastrica.

Dal specifici subunità MED sono associati con fattori di segnalazione attivati ​​trascrizione e RNA polimerasi II (Pol II) [20] e la funzione come condotti e integratori per canalizzazione diverse vie di segnalazione, ad esempio, il percorso di ormone nucleare recettore (via MED1) [21], il TGF-β-segnalazione (con MED12 o MED15) [22, 23], la via di Wnt-segnalazione (con MED12) [ ,,,0],24], e la via di segnalazione Ras-MAPK (via MED23) [25-27]. È stato proposto che queste vie di segnalazione possono indurre EMT [28-32], che è nota per essere associata con la metastasi, l'invasione, la proliferazione e chemioresistenza del tumore epiteliale [29, 33, 34]. Pertanto, abbiamo chiesto se MED30 innesca EMT. MED30 indotto le espressioni di geni EMT-correlati (N-caderina, CDH2, P-caderina, CDH3, legati torsione proteina 1 e 2; TWIST1 /2, vimentina, VIM), ma ha inibito l'espressione di E-caderina (CDH1) una noto soppressore tumorale (Fig 6A e 6B). Inoltre, MED30 sovraespressione indotto una morfologia dei fibroblasti-like (Fig 6C), il che suggerisce MED30 innesca EMT in cellule di cancro gastrico.

Riassumendo, questo studio supporta l'idea che MED30 agisce come un oncogene durante la carcinogenesi gastrica e suggerisce MED30 potrebbe regolare EMT nel cancro gastrico. Anche se sono necessari ulteriori studi per determinare come MED30 innesca EMT, i nostri risultati suggeriscono che MED30 essere considerato un nuovo bersaglio molecolare per il trattamento del cancro gastrico.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da Bio & Medical Technology Program Development (2012M3A9C6050213) e Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF), finanziato dal governo coreano (MEST), e da una sovvenzione da parte di R &nazionale; D Programma per il controllo del cancro, Ministero della Salute , Welfare e della Famiglia, Repubblica di Corea (0.920.050).

• PLoS ONE: Ruoli di DPY30 nella proliferazione e la motilità di cellule cancro gastrico
• PLoS ONE: Photoimmunotherapy di cancro gastrico peritoneale carcinosi in un modello murino