Plos ONE: MED30 Uravnava širjenju in gibljivost želodčnega raka celic

Povzetek

MED30 je pomemben član mediatorja kompleks, ki tvori vozlišče med transkripcijskih aktivatorjev in RNA polimerazo II. Vendar pa se izrazi in vloge MED30 so slabo označena s tem rakom. V tej študiji smo preučili funkcionalne vloge MED30 v želodcu napredovanju raka. Ugotovljeno je bilo, da je bil MED30 prekomerno v želodčnih tkivih onkoloških in celičnih linij. Poleg tega MED30 čezmernim povečala proliferacijo, migracijo in invazijo želodčnih rakavih celic, medtem ko MED30 rasklapanje zavrl te učinke. Poleg tega je rasklapanje močno inhibirana tumorogenosti v SCID miši. MED30 spodbuja tudi izraze genov, povezanih z epitela-mezenhimskih tranzicije in sprožilo fibroblastov podobno morfologijo. Ta študija kaže MED30 ima patofiziološke vloge v proliferacijo, migracijo in vdor želodčnih rakavih celic in predlaga, da se MED30 gledati kot močan terapevtski cilj za maligni želodčni rak

Navedba: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) MED30 Uravnava širjenju in gibljivost želodca rakavih celic. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10,1371 /journal.pone.0130826

Urednik: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Prejeto: 22. september 2014; Sprejeto: 26. maj 2015; Objavljeno: 25. junij 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v prispevku

Financiranje:. To delo je bilo podprto z Bio & Medicinska Program tehnološki razvoj (2012M3A9C6050213) in Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) National Research Foundation (NRF), ki jih je korejska vlada (MEST) in nepovratnih sredstev iz državnega R &financira; D Program za raka nadzor, Ministrstvo za zdravje, dobro počutje in družinske zadeve, republika Koreja (0920050). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je eden od glavnih vzrokov smrti zaradi raka v svetu [1, 2]. Približno 95% želodca raka so adenokarcinomov in v epidemioloških študijah je bil rak želodca razvrščeni po anatomskem mestu kot Cardia /proksimalno ali noncardia /distalnem [3] in po histološko fenotip kot črevesju, difuzni ali mešano /razvrstiti kot ga Lauren opisanem [4 ]. Poleg tega bolniki z proksimalnem rakom želodca, še slabše preživetje neodvisna od stopnje TNM [5]. Helicobacter pylori
okužba je bilo dokazano, da je etiološke agent raka želodca, predvsem raka najdemo v distalnih želodcev starejših moških, ki so običajno črevesne tipa. V zadnjem času je bilo predlaganih več molekularne klasifikacije raka želodca, ki temelji na ugotovitvah celotnega genoma študij izražanja genov in /ali študij, število kopij genov [6-10].
Uredbe

Transkripcijska je pomemben korak, ki nadzoruje identiteta celično rast, diferenciacijo in razvoj. Human mediator (MED) kompleks, ki vsebuje ~ 30 beljakovine, je ključni coactivator /aktivator izrazov RNA polimeraze II (Pol II) -transcribed gene [11]. MED kompleks omogoča pre-iniciacija kompleks (PIC), montažo z interakcijo s Pol II in genov specifičnih faktorjev transkripcije (TFS), kot so TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF in TFIIH [12, 13]. MED kompleks je sestavljen iz treh različnih strukturnih podmodulov (glave, srednjih in rep). Modul glava neposredno komunicira s Pol II, medtem ko modul podaljšan rep komunicira s genov specifičnih regulatornih proteinov [12, 13], in srednji modul deluje v regulativnem prenos signala na pošti veže fazi [13]. Čeprav mehanizem ni povsem jasen, MED kompleks tesno veže Pol II, spremeni svojo konformacijo in vpliva iniciacijski proces prepisu [14, 15]. Ker MED kompleks je bistvena sestavina strojev transkripcije, večina podenote v jedru MED so potrebni za zarodka rast in preživetje celic [16].

Študije zaporedja Rak genoma so poročali mutacije ali spremembe v RNA prepis stroji komponente iz mED podenote, in korelacije med nekaterimi od teh sprememb mED podenot (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8 in ciklin C) in napredovanje raka so poročali za različnimi vrstami raka, čeprav mehanizmov, ki so odgovorni za te korelacije so neznani [17].

Pred kratkim so poročali, da lahko MED19 sodelujejo v želodcu napredovanje raka, kot njegov rasklapanje močno zaviral proliferacijo celic in sposobnost kolonije oblikovanje in povzroča G1 faza prijetje celičnega cikla v dveh človeških želodčnih raka celičnih linijah (SGC7901 in MGC803) [18]. Vendar funkcionalne vloge in patološki pomen drugih MED podenot pri bolnikih z rakom želodca, še vedno nejasna.

V tej raziskavi, da razkrije funkcionalno pomen MED30 v želodcu napredovanje raka, smo pregledali svoje vloge pri širjenju, migracije, invazija in tumorogenosti želodčnih rakavih celic. Pred funkcionalnega pregleda, smo preverili izraz vzorec MED30 v želodčnih rakavih celic in tkiv.

Materiali in metode

Celične kulture in transfekciji

želodčni rak celičnih linijah (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 in N87) so bile kupljene od korejske Cell Line banke (Seul). Celice smo kultivirali v RPMI1640 dopolnjenem z 25 mM HEPES, 10% fetalni goveji serum (FBS) in 100 ug /ml penicilina /streptomicina (1 x P /S) v 5% zraka CO _{2/95% na 37 ° C. Celice smo transficirali z uporabo siRNA DharmaFECT reagenta 1 ali 3 (Dharmacon, Lafayette, CO), v skladu z navodili proizvajalca. Sekvence siRNA, ki se uporabljajo, so bili naslednji: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Koreja), 5'-CGA GCA ACU UAU UCC AUA U (dTdT) -3 ', 5'-GCU GCC AAA UGG UGU CAC U (dTdT) - 3 'in 5'-CGA GAA AUU OUP GAA GUA A (dTdT) -3'; umešana (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5'-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 ".}

MED30 prekomerno

Za gradnjo MED30- preko izražanja vektor smo uporabili pLenti6.3-V5 /dest lentivirusni vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA). Na kratko, je MED30 cDNA klonirali v pLenti6.3-V5 /DEST vektorja z vivo
temelji na rekombinacije Gateway sistem tvorbe klonov (Invitrogen). Vektor donor (pDONR221), ki vsebuje kodirano sekvenco MED30 (MED30 cDNA) je bila kupljena od Ultimate ^{TM ORF Kloni (Invitrogen) in kombiniranimi z nasprotnega izbira ccdB
gena Gateway ciljni vektor pLenti6.3-V5 /CILJ pomočjo clonase encimsko mešanico LR (Invitrogen). Prazen vektor pLenti6.3 /V5-CILJ smo uporabili kot modelno kontrolo. Rekombinantni lentiviruses so bili proizvedeni v 293FT celicah, in se uporablja za okužbo SNU638 celic v skladu z navodili proizvajalca (ViraPower lentivirusni Expression sistema; Invitrogen). Stabilne celične linije so bile določene z izbiro z blasticidin (7,5 pg /ml) (Invitrogen).}

Sprotna PCR

Rak želodca tkiva so bili pridobljeni po pridobitvi pisno privolitev pri bolnikih, ki so bile opravljene kirurške resekcijo na nacionalni bolnišnici Pusan ​​univerzitetne ali Yangsan bolnišnica Pusan ​​National University. Študija je bila odobrena s National University Hospital-Institutional Review Board Pusan ​​(PNUH-IRB) in Narodni univerzitetni Yangsan Hospital-Institutional Review Board Pusan ​​(PNUYH-IRB). Celotno RNA je bila vzeta iz tkiv ali celic, ki uporabljajo TRIzola reagenta (Invitrogen) ali RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) po navodilih proizvajalca. cDNA smo sintetizirali z uporabo MMLV reverzno transkriptazo (Promega, Madison, WI), dNTP in oligo-dT oligonukleotidov. Sekvence oligonukleotidnih začetnikov, ki se uporabljajo, so bili naslednji: MED30, 5'-ACC GGT TAA CAA AGC TAC AGG -3 "(občutek) in 5'-TAA GTT GCT CGA CTG GAA TGG G -3" (antisense); CDH1, 5'-TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC -3 'in 5' CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG -3 "; CDH2, 5'-CAC TGT GGA GCC TGA TGC CA -3 'in 5' TCC CCA ATG TCT CCA GGG TG -3 "; CDH3, 5'CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC -3 'in 5' ACG CCA CGC TGG TGA GTT GG -3 "; TWIST1, 5'CGG GAG TCC GCA GTC TTA -3 "in 5'-TGG ATC TTG CTC AGC TTG TC -3"; TWIST2, 5'-CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT -3 'in 5' TAG CCA AGC AAT CAC GGA GA -3 "; VIM, 5'TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G -3 'in 5' TAG CAG CTT CAA CGG CAA AGT TC -3 "; SNAI1, 5'-GAG GCG GTG GCA GAC TAG -3 'in 5' GAC ACA TCG GTC AGA CCA G -3 "; SNAI2, 5'-TAG GAA GAG ATC TGC OAS AC -3 'in 5' CCC CAA GGC ACA TAC TGT TA -3 "; GAPDH, 5'GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT -3 "in 5'-TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G -3". PCR v realnem času smo izvedli z uporabo LightCycler ^{TM 96 PCR v realnem času sistem (Roche, Nutley, NJ, ZDA) z FastStart Essential DNK Green Master (Roche), v skladu z navodili proizvajalca. GAPDH je bila uporabljena kot notranji nadzor.}

Western blot analiza

Celice smo lizirali z RIPA pufrom, dodamo inhibitor proteaze koktajl, in koncentracije beljakovin je bila določena z Bio-Rad protein Preskusno komplet ( Bio-Rad, Hercules, CA). Vzorci (80 g /dobro) so bili izpostavljeni SDS-PAGE in nato prenese na PVDF membrane. Anti-MED30 (1: 500, Protein Tech§87-1-AP, Chicago, IL), anti-E-kadherina (1: 1000, BD Bioscienceɢ181, San Jose, CA), anti-N-kadherina (1 : 1000, BD Biološka znanostɢ920), anti-P-kadherina (1: 1000, BD Biološka znanostɢ227), anti-Twist1 /2 (1: 750, santa Cruz Biotechnology # sc-15393, santa Cruz, CA), anti -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Carpentarijski, CA) in anti-β-aktina (1: 2000, santa Cruz Biotechnology # sc-47.778) protitelesa smo razredčili v 5% posnetega mleka in inkubiramo z membrano pri 4 ° C preko noči. je bila uporabljena ustrezna sekundarna protitelesa (1: 2000, hrenove peroksidaze-konjugiranim anti-miš ali anti-zajec) pri sobni temperaturi 1 uro. odkrivanje Kemiluminescenca (GE Health Care, Mali Chalfont, Združeno kraljestvo), je bila uporabljena za vizualizacijo MED30, E-kadherina, N-kadherina, P-kadherina, Twist1, vimentin in β-aktina. Western blot analiza je bila izvedena v treh izvodih.

Imunohistokemija

Tissue mikromrež sekcije, ki vsebujejo želodčne rakavih tkiv pri bolnikih, ki so bili pridobljeni iz SuperBiochip (Seoul). Histopatološka diagnoza smo izvedli na Oddelku za patologijo, National University Hospital Pusan ​​in clinicopathologic uprizoritev je bila izvedena v skladu s klasifikacijo TNM (AJCC, 7. ed.). Vsi bolniki so histološko potrjeni raka želodca, in vzorci tumor bilo preveriti, da se zagotovi, da tumorske tkiva, ki ga sestavljajo več kot 80% vzorcev. Za imunohistokemijo smo drsi deparaffinized in rehidrirani obdelamo z 0,3% vodikovega peroksida na 30 min pogasiti endogenega peroksidaze aktivnost, ter blokirali z 10% normalno osla seruma (NDS) in 1% BSA v 1 x fosfatnim pufrom (PBS). Ploščice smo potem inkubirali preko noči pri 4 ° C v pufru, ki vsebuje primarna protitelesa blokiranje (anti-humani MED30, 01:50, Proteintech). Sekundarna protitelesa (HRP-konjugiranimi) vezavo izvedemo pri razredčenju 1: 200 v 2 uri pri sobni temperaturi pufru za blokiranje. Ploščice smo nato obarvamo za HO (Vector Laboratories) in jih nasprotno s hematoksilin obarvanje pufra (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 1 minuto. Odstotki celic, ki obarvajo za MED30 v bili odseki določiti in profili so nato ocenjena s pomočjo 1-4 lestvico (1, < 24%, 2, 25-49%, 3, 50-74%, 4, 75-100% ). Intenzitete tumorskih celic obarvanjem bila ocenjena vrednost 0, 1, 2 ali 3, kar je ustrezalo bazalne, šibke, zmerno in močno oz. Na splošno obarvanje je nato zastopal kompozitnih rezultate, ki so bili izračunani z množenjem teh dveh razredov. V skladu s splošno obarvajo bila ocenjena od 0 do 12.

Cell širjenje test

Da bi preučili vpliv siRNA na proliferacijo želodčnih rakavih celic, gojišča so nadomestili z 1% FBS srednje enega dan po siRNA transfekciji. Pet dni po transfekciji dodamo 10 ul EZ-Cytox (ITSBIO, Seul) in celice inkubirali 0,5 do 2 uri v normalnih pogojih gojenja. Nato smo merili absorbanco pri 450 nm ob uporabi ELISA čitalnika (TECAN, Männedorf, Švica). Da bi preučili vpliv MED30 prekomerno smo celice zasejali v 1% FBS mediju. Dodali smo tri dni po sejanju 10 ml EZ-Cytox.

Boyden komora test

Dno komora iz transwell komore je bila napolnjena z medijem, ki vsebuje 10% FBS. En dan po transfekciji s zakodirane (SCR) ali MED30 siRNA so želodčni rakave celice zasejali v zgornjo komoro pri gostoti 5 x 10 ^{5 celic /ml v 50 ul v mediju brez seruma. Da bi preučili učinke MED30 prekomerno, so bile celice (mock in MED30-več) zasejali z gostoto 1 × 10 5 celic /ml. Za odpravo orožja, povezane učinke, mitomicina C (0,01 g /ml, Sigma-Aldrich) smo dodali. Celice pustimo, da migrirajo na štiri ali šest ur. Membrane so nato določene in obarvajo z uporabo Diff-Quik rešitev (SYSMEX, Kobe, Japonska) in speremo z destilirano vodo. Cell številke v 10 naključno izbranih področjih so bili prešteti s pomočjo svetlobnega mikroskopa.}

poskus vdora v Matrigel

Sposobnost želodčnih rakavih celic, da napadejo smo raziskovali z uporabo 24-ter BioCoat ^{TM Matrigel TM komora vložki (BD bioznanosti, San Jose, CA, ZDA). Vrhnja površina vložkov v invazijo komorah obložimo z 0,5 mg /ml rastni faktor-znižanem Matrigel (BD Bioscience) in spodnji površini z 0,5 mg /ml fibronektina (Sigma-Aldrich). En dan po transfekciji s SCR ali MED30 siRNA, smo celice zasejali v gostoti 5 x 10 4 celic /ml v mediju brez seruma v 8-mikrometrskimi poroznih komornih vložki BioCoat Matrigel in nameščeni v vdolbinice napolnimo z 750 ul medija dopolnjen z 10% FBS kot chemoattractant. Da bi preučili učinke MED30 prekomerno, celic (modelnimi in MED30-prekomerno ekspresijo celic) so zasejali z gostoto 1 × 10 4 celic /ml. Če želite odstraniti učinke orožja povezana, je bila dodana mitomicina C (0,01 mg /ml, Sigma-Aldrich). Po inkubaciji 24 ur, je bilo non-vdrla celic na vrhu površine membrane odstraniti s strganjem. Preplavljajo celic na spodnji strani so bile določene, in obarvamo z raztopino Diff-Quik. Poskuse smo izvedli v treh izvodih, in vsaj 5 polja smo šteli za vsak poskus.}

ksenotransplantskih test

SNU638 Celice so transfekciji s SCR ali MED30 siRNA. Po 2 dneh smo celice zbrali s trypsinization dvakrat izprali s PBS in smo injicirali subkutano (1 x 10 ^{6 celic v 100 ul PBS) v hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (SCID) miši. volumne tumorjev smo izračunali vsak teden od treh tedna do sedem teden po injiciranju z uporabo naslednje formule: volumen tumorja (mm 3) = ( A
x b
2 ) /2, kjer je A
= dolžina v mm in b
= širina v mm. Sedem tednov, smo miši žrtvovali in zabeležili volumne tumorjev in uteži. Ta poskus je bil izveden strogo v skladu s priporočili v navodilih za nego in uporabo, ki jih je Nacionalni inštitut za zdravje izdanih laboratorijskih živalih. Pusan ​​National University institucionalno varstvo živali in uporaba odbor (PNUIACUC) odobrila eksperimentalni protokol.}

Statistična analiza

Rezultati so predstavljeni kot sredstvo ± SDS. Neparametrični Mann-Whitney U test ali na t-test (brez para) smo ugotavljali pomene razlik med srednjimi vrednostmi dveh skupin, in je bila uporabljena enosmerna analiza variance (ANOVA), ki ji sledi Tukey za multiple primerjave analizirati tri ali več skupin. * Označuje P
vrednost < 0,05. Preživetje čas je opredeljen kot čas, ki je potekel med zdravljenjem in smrtjo ali do zadnjega cilj nadaljevanje informacija je bila pridobljena. Metoda Kaplan-Meier je bila uporabljena za določitev razmerja med preživetjem in MED30 izražanja. Krivulje smo primerjali s testom log-rang pri stopnji značilnosti 95%. P
vrednosti < 0,05 naj bi bile statistično značilne. Podatke smo analizirali s pomočjo SPSS različico programske opreme 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA).

Rezultati

Čezmerno MED30 v želodčni rak tkiva

Da bi raziskali vlogo igral s MED30 raka želodca, moramo najprej preučiti status ekspresije MED30 v tumorskih tkivih 23 bolnikov z rakom želodca. MED30 protein smo ugotovili, da je treba močno izraženi pri regijah rakavih tkiv (slika 1A-1D), je očitno prekomerno v vdrla želodčnem rakavih celic (Fig 1C) in metastaznih rakave celice znotraj prizadetih bezgavk (Slika 1D). Da bi potrdili naše rezultate imunohistokemija, smo izvedli kvantitativno PCR v realnem času na želodcu tumorskih tkivih, ki uporabljajo MED30-specifičnih začetnih oligonukleotidov. Kot je prikazano na sliki 1F je DPY30 prekomerno v 10 primerih (10/23, 43%). Proučili smo tudi izraz vzorec MED30 v želodčnih linij rakavih celic s PCR v realnem času, in ugotovila, da se prekomerno v petih od želodčnega raka celičnih linij testiranih (razen SNU1) v primerjavi z običajnimi želodčnega tkiva (slika 1E). Da bi raziskali korelacijo med MED30 izražanja in kliničnih značilnosti, smo izvedli imunohistokemično uporabo 41 želodčne vzorcev rak tkiva (tabela 1). Zanimivo je, da je bil izraz MED30 v pozitivni korelaciji z N fazi (slika 1G), ne pa s preživetjem bolnikov (podatki niso prikazani).

Vloge MED30 v proliferacijo, migracijo in vdori v želodcu rakavih celic

Da bi preučili vlogo MED30 v želodcu rakotvornosti, smo preučili učinke MED30 rasklapanje ali prekomerno na proliferacijo, migracijo in vdori v šestih želodca raka celičnih linijah (SNU1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638 in NCI -N87 celice). PCR v realnem času in western blot smo uporabili za analizo rasklapanje in čezmerno MED30 v SNU216 in SNU638 celic (slika 2A-2C). Ko so te celice transfekciji s MED30 siRNA (100 Nm), MED30 izražanja zmanjšala na beljakovine in mRNA za približno 80%, dva dni kasneje pa v primerjavi z SCR siRNA in MED30 prekomerno ga cDNA transfekciji povečala MED30 mRNA in raven beljakovin v primerjavi s praznim nadzorni vektorji transficirane celice (mock celice), za več kot 3-krat.

Naslednja raziskovali vlogo MED30 pri širjenju rakavih celic. Širjenja teste smo izvedli 5 dni po transfekciji s redukcije ali MED30 siRNA. Rasklapanje od MED30 inhibira proliferacijami vseh rakavih želodca celic testiranih (SNU16, SNU216, SNU620 in SNU638) v primerjavi z SCR za 18%, 68%, 98% in 42%, v tem zaporedju (slika 2D). Podobne rezultate smo opazili, ko smo izvedli teste orožja dva ali tri dni po transfekciji (podatki niso prikazani). Dosledno, MED30 čezmernim okrepljeno z poganjkov SNU216 in SNU638 celice za 1,9 in 2,2-krat, v tem zaporedju, v primerjavi z modelnim celic.

Če želite ugotoviti vlogo, ki jo MED30 igral v migracije želodčnih rakavih celic, smo uporabili Boyden komoro esej. Rasklapanje od MED30 zmanjšala FBS-inducirane migracije iz SNU216 in SNU638 celic za 90% in 52%, v tem zaporedju, v primerjavi z SCR transfekciji celic (slika 3A in 3C). Poleg tega MED30 čezmernim povečala FBS-inducirano migracijo SNU216 in SNU638 celic za 3,2 in 2,8-krat, v tem zaporedju, v primerjavi z modelnimi celic (slika 3B in 3C). Ti rezultati nas je preučiti vlogo MED30 v invaziji želodca rakavih celic. V poskus vdora v Matrigel, MED30 siRNA zaviral FBS-induciranih vdori SNU216 in SNU638 celic v primerjavi z SCR siRNA za 64% in 47%, v tem zaporedju (slika 4A in 4C), in MED30 čezmernim pospešili FBS-induciranih vdori SNU216 in SNU638 celic v primerjavi z modelnimi celic z 2,5 in 2,2-krat, v tem zaporedju (slika 4B in 4C).

vpliv MED30 rasklapanje na in vivo
tumorogenosti

Da bi preučili vpliv MED30 na tumorske rasti, smo podkožno injicirali SNU638 celice transfektirane s redukcije ali MED30 siRNA v SCID miši in nato spremljajo tumorske rasti sedem tednov (slika 5A). Otipljiv tumorji so bile ugotovljene v treh tednih na kontrolnih straneh SCR. Vendar rakave celice, transfektirane z MED30 siRNA razstavljene počasnejšo rast. Sedem tednov po injekciji, smo žrtvovali miši in volumne tumorjev in teže so bili izmerjeni (slika 5B in 5C). Rezultati so pokazali, MED30 rasklapanje bistveno zmanjša obseg tumorjev in uteži.

Urejanje EMT poti, ki jo MED30

Za določitev mehanizma, ki je podlaga za spodbujanje želodca rakotvornosti ga MED30, smo raziskovali izrazne vzorce genov vključeni v epitela-mezenhimskih prehod (EMT: ključni proces v metastaz in invazije) s PCR v realnem času. Rasklapanje od MED30 nekoliko povečala raven E-kadherina (CDH1) mRNA v SNU638 celicah v primerjavi z SCR transfekciji, ampak se je zmanjšalo izraze N-kadherina (CDH2), P-kadherina (CDH3) in vimentin (VIM) za 42%, 36% in 41%, v tem zaporedju (slika 6A). Dosledno, MED30 čezmernim znižane vrednosti CDH1 mRNK za 35% v primerjavi s modelnih celic, vendar je povečana izraze N-kadherina (CDH2), P-kadherina (CDH3), zasuk družine bHLH transkripcijski faktor 1 in 2 (TWIST1 /2), in vimentina (VIM) z 2,9, 3,3, 3,4, 2,4, 2,2, in 4,2-krat, v tem zaporedju (slika 6A). Ravni mRNA iz polž družinskega cinkovega prsta 1 in 2 (SNAI1 /2) so ostale nespremenjene. Nato smo potrdili, da MED30 prekomerno povečala tudi raven proteinskih E-kadherina, N-kadherina, P-kadherina, Twist1 in vimentina (slika 6B). Preizkus morfologije SNU638 celic, je pokazala, da MED30 prekomerno sprožil prehod iz tlakovanih, kot na podolgovatem fibroblastom morfologijo (slika 6C), medtem ko MED30 rasklapanje ni spremenila morfologijo (podatki niso prikazani). Ti rezultati kažejo, da MED30 pozitivno ureja EMT.

Pogovor

Funkcionalne Vloge podenoto MED30 MED (znan tudi kot TRAP25) so slabo razume. V nedavnem poročilu, je bilo MED30 ugotovljeno, da imajo pomembno vlogo pri uravnavanju mitohondrijev funkcij in integritete v homozigotno miši [19]. V tej študiji smo preučili funkcionalne vloge MED30 v želodcu napredovanju raka. Ugotovljeno je bilo, MED30 urejeno proliferacije, migracije in invazijo želodčnih rakavih celic in njihovo in vivo
tumorogenosti. Po zagotavljanju rasklapanje in učinkovitost Čezmerno s kvantitativno PCR v realnem času in zahodne analize blot (slika 2), smo ugotovili, da MED30 rasklapanje izredno zavre proliferacijo, migracijo in invazijo želodčnih rakavih celic, in da je MED30 prekomerno nasprotne učinke (sl 2-4). Poleg MED30 rasklapanje zmanjša in vivo
tumorogenosti (slika 5). Poleg tega smo tudi ugotovili, da je MED30 prekomerno v želodčnih tkivih rakom in želodca raka celičnih linij (slika 1). Ti rezultati kažejo, da bi lahko MED30 igrajo pomembno patofiziološke vloge v želodcu rakotvornost.

Ker so posebne MED podenote povezana s signalom aktivira transkripcijski faktorji in RNA polimerazo II (Pol II) [20] in delujejo kot vodov in integratorjev za usmerjanje različnih signalnih poti, na primer, receptorjev poti jedrski hormona (preko MED1) [21], TGF-β-signalne poti (via MED12 ali MED15) [22, 23] je NT-signalne poti (via MED12) [ ,,,0],24], in signalne poti Ras-MAPK (preko MED23) [25-27]. Predlagano je bilo, da lahko te signalne poti povzroči EMT [28-32], za katerega je znano, da je povezana z metastazami, invazije, proliferacijo in chemoresistance raka epitela [29, 33, 34]. Zato smo se vprašali, ali MED30 sproži EMT. MED30 povzroča izraze, povezane z EMT genov (N-kadherina; CDH2, P-kadherina; CDH3, povezane zasuk protein 1 in 2; TWIST1 /2, vimentin, VIM), vendar je zaviral izražanje E-kadherina (CDH1) a znano tumor supresorski (slika 6A in 6B). Poleg tega MED30 čezmernim sprožilo fibroblastov podobno morfologijo (slika 6c), ki predlaga MED30 sproži EMT v želodčnih rakavih celic.

, ki povzema, ta študija podpira idejo, da MED30 deluje kot onkogen v želodcu rakotvornost in predlaga MED30 mogoče urediti EMT na raka želodca. Čeprav so potrebne nadaljnje študije, da ugotovi, kako MED30 sproži EMT, naši rezultati kažejo, da se MED30 šteje za novo molekularno tarča za zdravljenje raka želodca.

Priznanja

To delo je podprl Bio & Medicinska Program tehnološki razvoj (2012M3A9C6050213) in Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) National Research Foundation (NRF), ki jih je korejska vlada (MEST), ter z nepovratnimi sredstvi iz državnega R &financira; D Program za raka nadzor, Ministrstvo za zdravje , dobro počutje in družinske zadeve, republika Koreja (0.920.050).

• Plos ONE: Vloge DPY30 pri širjenju in gibljivost Rak želodca Cells
• Plos ONE: Photoimmunotherapy želodčnega raka peritonealno karcinomatozo v Mouse Model