PLoS ONE: MED30 Reguliuoja platinimu ir judrumas skrandžio vėžio Cells

Anotacija

MED30 yra esminis narys tarpininko komplekso, kuris sudaro šakotuvą tarp transkripcijos aktyvatorių ir RNR polimerazės II. Tačiau, išraiškos ir vaidmuo MED30 buvo prastai besiskiriantis tuo, vėžio. Šiame tyrime mes išnagrinėjo funkcinius vaidmenis MED30 metu skrandžio vėžio progresavimą. Buvo nustatyta, kad MED30 buvo aktyvuojami skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų. Be to, MED30 raiška padidėjo dauginimosi, migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląsteles, o MED30 nokdaunas slopina šiuos efektus. Be to, nokdaunas gerokai slopinamas tumorogeniš- SCID pelių. MED30 taip pat skatino genų, susijusių su epitelio-mezenchiminių perėjimo išraiškas ir sukėlė fibroblastų kaip morfologiją. Šis tyrimas rodo, MED30 turi patofiziologinių vaidmenis dauginimosi, migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląsteles ir leidžia manyti, kad MED30 turėtų būti vertinama kaip stiprus terapinio tikslo piktybinio skrandžio karcinoma

Citation: Lee YJ, Han ME, BAEK SJ Kim SY, oh so (2015) MED30 Reguliuoja platinimu ir judrumas skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 10 (6): e0130826. Doi: 10,1371 /journal.pone.0130826

redaktorius: Aamir Ahmadas Wayne State University School of Medicine, JAV

Įstojo: rugsėjo 22, 2014; Priėmė: Gegužės 26, 2015 m Paskelbta: Birželis 25, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Lee et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus

finansavimas:. Šis darbas buvo remiamas Bio & Medicinos technologijų plėtros programa (2012M3A9C6050213) ir pagrindinių mokslo tyrimų fondas (2012R1A1A3010521) Nacionalinės mokslinių tyrimų fondo (NRF), finansuojamą iš Korėjos valdžiai (Mest) ir dotacijos iš Nacionalinio mokslinių & D vėžio kontrolės programa ministerijos Sveikatos, gerovės ir šeimos reikalų, Korėjos Respublika (0920050). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš pagrindinių priežasčių, vėžio mirties visame pasaulyje [1, 2]. Maždaug 95% skrandžio vėžio yra adenokarcinomos ir epidemiologinių tyrimų skrandžio vėžys buvo klasifikuojami pagal anatominės vietoje kaip CARDIA /proksimalinės ar noncardia /distalinio [3] ir histologinio fenotipo, žarnų, difuzinis arba mišri /nepriskirtinus kaip aprašyta Lauren [4 ]. Be to, pacientams, sergantiems proksimalinės skrandžio vėžiu prasčiau išgyvenimo nepriklausomai nuo TNM etape [5]. Helicobacter pylori
infekcija buvo įrodyta, kad būti etiologinis agentas skrandžio vėžio, ypač vėžio rasti distalinių skrandžius vyresnio amžiaus vyrų, kurie paprastai žarnyno tipo. Visai neseniai buvo pasiūlyta keletas molekulinės klasifikacijos skrandžio vėžio remiantis viso genomo genų ekspresijos tyrimus ir /ar genų kopijų skaičiumi tyrimų rezultatus [6-10].

Transkripcinis reglamentas yra svarbus žingsnis, kuris kontroliuoja ląstelių tapatybė, augimas, diferenciacija, ir vystymasis. Žmogaus tarpininkas (MED) kompleksas, kuriame yra ~ 30 baltymų, yra pagrindinis coactivator /aktyvatorius iš RNR polimerazės II (Pol II) išraiškos -transcribed genus [11]. MED kompleksas palengvina anksto inicijavimas kompleksas (PIC) surinkimas sąveikaujant su Pol II ir genų specifinis transkripcijos faktorių (TFS), pavyzdžiui,, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF ir TFIIH [12, 13]. MED kompleksas susideda iš trijų skirtingų struktūrinių submodules (vadovas, viduryje, ir uodegos). Galva modulis tiesiogiai sąveikauja su Pol II, o pailgos uodega modulis sąveikauja su genų būdingų reguliuojančių baltymų [12, 13], o viduriniosios modulis veikia reguliavimo signalo perdavimo metu post-privalomas etape [13]. Nors mechanizmas nėra visiškai aiškus, MED kompleksas sandariai jungiasi prie Pol II, keičia savo pavidalą ir įtakos transkripcijos iniciacijos procesą [14, 15]. Nuo MED kompleksas yra esminė transkripcijos mašinų, dauguma padalinių į MED branduolys yra reikalingi embriono augimą ir ląstelių gyvybingumą [16].

Vėžys genomo iššifravimas tyrimai pranešė mutacijas arba keičiant RNR transkripcija mašinos dalis, esančias MED padaliniuose, ir koreliacijos tarp kai kurių iš šių pokyčių MED subvienetų (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8 ir cikloniniai C) ir vėžio progresavimas buvo pranešta apie įvairių vėžio, nors mechanizmų, atsakingų už šios koreliacijos yra nežinoma [17].

Neseniai buvo pranešta, kad MED19 gali dalyvauti skrandžio vėžio progresavimą, nes jo triuškinantis smarkiai slopino ląstelių proliferacija ir kolonijų sudarymas talpa ir sukeltas G1 fazės ląstelių ciklo arešto dviem žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų (SGC7901 ir MGC803) [18]. Tačiau, funkciniai vaidmenys ir patologinė reikšmė kitų MED padalinių skrandžio vėžio lieka neaiški.

Šiame tyrime atskleisti funkcinę svarbą MED30 metu skrandžio vėžio progresavimą, mes išanalizavome savo vaidmenis ginklo platinimo, migracija, invazija ir tumorogeniškumo skrandžio vėžio ląsteles. Prieš funkcinio tyrimo, mes patikrinome išraiška modelio MED30 skrandžio vėžio ląstelių ir audinių.

Medžiagos ir metodai

Mobilaus kultūros ir transfekcija

Skrandžio vėžio ląstelių linijas (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 ir N87) buvo nupirkta iš Korėjos ląstelių linijos bankas (Seulas). Ląstelės buvo auginamos RPMI1640 papildytas 25 mm HEPES, 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS), o 100 mikrogramų /ml penicilino /streptomicino (1 × P /S) 5% CO _{2/95% oro 37 ° C. Ląstelės buvo pernešta su siRNR naudojant DharmaFECT reagentas 1 arba 3 (Dharmacon, Lafayette, CO), pagal gamintojo instrukcijas. Į siRNA sekas, buvo taip: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Pietų Korėja), 5'-CGA GCA ACU Aminorūgštis koduojančios sekos UCC AUA U (dTdT) -3 ', 5'-GCU Persijos AAA tipo UGG UGU ŠMC U (dTdT) - 3 "ir 5'-CGA GAA AUU GCU GAA GUA A (dTdT) -3"; plakta (MKR) siRNR (Dharmacon, Lafajetas, CO) 5'-Gau CCG CAA ARG AGC GAA A (dTdT) -3 ".}

MED30 raiškos

Norint statyti MED30- daugiau ekspresijos vektorių, mes panaudojome pLenti6.3-V5 /Pask lentiviruso vektorių (Invitrogen, Karlovi Varai, Kalifornija). Trumpai tariant, MED30 kDNR buvo klonuotas į pLenti6.3-V5 /DEST vektoriaus naudojant vivo
rekombinacijos pagrindu Gateway klonavimo sistemą (Invitrogen). Donoras vektorius (pDONR221), kuriame yra koduojančią seką MED30 (MED30 kDNR) buvo įsigytas iš Ultimate ^{TM ORF Klonai (INVITROGEN) ir atgamintas su kovos su pasirenkama ccdB pervežimas geno Vartai paskirties vektoriaus pLenti6.3-V5 /DEST naudojant LR clonase fermentų mišinys (Invitrogen). Tuščia vektorius pLenti6.3 /V5-DEST buvo naudojamas kaip juoktis kontrolę. Rekombinaciniai lentiviruses buvo pagaminta 293FT ląstelių, ir naudojamas užkrėsti SNU638 ląsteles pagal gamintojo nurodymus (ViraPower lentiviruso išraiška sistemą; INVITROGEN). Stabilus ląstelių linijos buvo nustatytos atrankos su blasticidin (7,5 mikrogramų /ml) (Invitrogen).}

Realaus laiko PGR

skrandžio vėžio audiniuose buvo gautas, gavusi rašytinį informuoto sutikimo iš pacientų, kuriems buvo atlikta chirurginė rezekcija esant Pusano nacionalinio universiteto ligoninės ar Pusano nacionalinio universiteto Yangsan ligoninėje. Tyrimas patvirtino Pusano nacionalinio universiteto ligoninė institucijų priežiūros valdyba (PNUH-IRB) ir Pusano nacionalinio universiteto Yangsan ligoninė institucijų priežiūros valdyba (PNUYH-IRB). Iš viso RNR buvo išskirta iš audinių ar ląstelių, naudojant Trizol reagento (Invitrogen) arba RNeasy Mini komplektas (Qiagen, Valensija, Kalifornija), pagal gamintojo instrukcijas. kDNR buvo susintetintas naudojant MMLV atvirkštinės transkriptazės (Promega, Madison, WI) trifosfato ir oligo-DT pradmenis. Iš gruntai naudojami sekas buvo taip: MED30, 5'-ACC GGT TPI CAA AGC BLSK AGG -3 "(prasme) ir 5'-TPI GTT GCT CGA KTG GAA TGG G -3" (priešprasminį); CDH1, 5'-TGG Persijos AGG AAA TBS CAT CK -3 "ir 5'-BTK AGC CCG AGT GGA AAT VS -3"; CDH2, 5'-ŠMC TGT GGA Persijos TGA TGC ĮA -3 "ir 5'-TCC CCA ATG TCT CCA ggg TG -3"; CDH3, 5'-BMK CCA GAA GTA CGA GGC CK -3 "ir 5'-ACG CCA CGC TGG TGA GTT VS -3"; TWIST1, 5'-CGG GAG TCC GCA GTC TTA -3 "ir 5'-TGG, ATC TTG BTK AGC TTG TC -3"; TWIST2, 5'-CTT ATG TTT ggg ggg AGG TT -3 "ir 5'-TAG CCA AGC AAT ŠMC GGA GA -3"; VIM, 5'-TGA GTA CCG GAG PPK GGT GCA G -3 "ir 5'-TAG PVG CTT CAA CGG CAA AGT TC -3"; SNAI1, 5'-GAG GCG GTG GCA GAA TAG -3 "ir 5'-GAA PPK TCG GTC" AGA CCA G -3 "; SNAI2, 5'-TAG GAA GAG, ATC TGC PVG AC -3 "ir 5'-BMK CAA GGC PPK BLSK TGT TA -3"; GAPDH, 5'-GCA Persijos TCC CGC TTC GCT KT -3 "ir 5'-TGG TGA CCA GGC Persijos CAA BLSK G -3". Realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant LIGHTCYCLER ^{TM 96 realaus laiko PGR sistema (Roche Nutley NJ, JAV) su Faststart Eteriniai DNR Žaliosios Master (Roche), pagal gamintojo nurodymus. GAPDH buvo naudojamas kaip vidinis kontrolės.}

Western blot analizė

Ląstelės buvo lizuojamos Ripa buferio, buvo įtraukta proteazės inhibitorius kokteilis, ir baltymų koncentracija buvo nustatoma naudojant Bio-Rad baltymų reagentq rinkini ( Bio-Rad, Hercules, CA). Pavyzdžiai (80 g /gerai) buvo atliktas SDS-PAGE ir tada perkelti į PVDF membranos. Anti-MED30 (1: 500, baltymų Technika.787-1-AP, Čikaga, IL), anti-E-cad (1: 1000, BD biologijosɢ.181, San Chosė, CA), anti-N-cad (1 : 1000, BD biologijosɢ.920), anti-P-cad (1: 1000, BD biologijosɢ.227), anti-Twist1 /2 (1: 750, Santa Cruz biotechnologijos # SC-15393, Santa Krusas, Kalifornija), anti -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Karpentarijos, CA) ir anti-β-aktino (1: 2000, Santa Cruz biotechnologijos # SC-47778) antikūnai buvo praskiesti 5% lieso pieno ir inkubuojami su membranomis, esant 4 ° C per naktį. buvo taikomos atitinkamos antrinės antikūnas (1: 2000, krienų peroksidazės-konjuguoto anti-pelės ar anti-triušis) kambario temperatūroje 1 val. Metodas nustatymas "(GE sveikata, Mažasis Chalfontas, Jungtinė Karalystė) buvo naudojamas vizualizuoti MED30, E-cad, N-cad, kad P-cad, Twist1, vimentin ir β-aktino. Vakarų dėmė analizė buvo atliekama trimis egzemplioriais.

imunohistocheminis

Audinių mikrogardeliq skyriai, kuriuose yra skrandžio vėžys audinius iš pacientų buvo gauti iš SuperBiochip (Seulo). Histopatologinis diagnozės buvo atliekami tuo patologijos katedra, Pusano nacionalinio universiteto ligoninės ir clinicopathologic sustojimo buvo atlikta naudojant TNM klasifikaciją (AJCC, 7. Red.). Visi pacientai buvo histologiškai patvirtinta skrandžio vėžio, ir buvo patikrinti navikų mėginiuose, siekiant užtikrinti, kad naviko audinio, kurį sudaro daugiau kaip 80% mėginių. Dėl imunohistocheminiu, skaidres buvo deparaffinized ir rehidratuoti gydomi 0,3% vandenilio peroksido 30 min numalšinti vidinį peroksidazės aktyvumo, ir blokavo 10% normalaus asilas serume (NDS) ir 1% BSA 1 × fosfatinio buferio druskų tirpalu (PBS). tada skaidres buvo inkubuojami per naktį 4 ° C blokuojančiu buferiu, kuriuose yra pirminių antikūnų (anti-žmogaus MED30; 01:50, Proteintech). Antrinis antikūnas (HRP-konjuguoto) rišasi atliekamas praskiesto santykiu 1:: 200 blokuojančiu buferiu 2 val kambario temperatūroje. tada Skaidrės buvo tamsintas už HRP (Vector Laboratories) ir counterstained hematoksilinu dažymo buferis (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 1 min. Procentiniai ląstelių, kad dažytų už MED30 į skyrių buvo nustatytas ir tada dalys buvo rūšiuojami naudojant 1-4 skalėje (1, < 24%; 2, 25-49%; 3, 50-74%; 4, 75-100% ). Intensyvumas naviko ląstelių dažymo buvo rūšiuojami kaip 0, 1, 2, arba 3, ir tai atitiko bazinei, silpnas, vidutinio sunkumo ir stipri atitinkamai. tada Apskritai dažymo atstovavo kompozitinių rezultatus, kurie buvo apskaičiuotas padauginus šiuos du pažymius. Taigi, bendras tamsintas buvo rūšiuojami nuo 0 iki 12.

ląstelių proliferacija tyrimas

Jei išnagrinėti siRNA poveikį skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, kultūros žiniasklaidos buvo pakeista 1% FBS vidutinio vieną dieną po siRNA transfekciją. Penkias dienas po transfekciją, 10 įxL EZ-Cytox (ITSBIO, Seulas) buvo pridėta ir ląstelės inkubuojamos 0,5-2 val normaliomis auginimo sąlygomis. Tada absorbcija buvo matuojamas 450 nm, naudojant ELISA skaitytuvu (TECAN, Männedorf, Šveicarija). Išnagrinėti MED30 raiškos poveikį, ląstelės buvo pasėjamos į 1% FBS terpėje. buvo įtraukta trims dienoms po sėjos 10 įxL EZ-Cytox.

Boyden kamera testas

apačioje kamera iš transwell kameroje buvo pilna terpė su 10% FBS. Vieną dieną po to, kai transfekciją su plakta (MKR) arba MED30 siRNR, skrandžio vėžio ląstelės buvo pasėjamos į viršutinę kamerą, kurios tankis 5 × 10 ^{5 ląstelių /ml 50 pL terpėje serumo neturinčioje. Išnagrinėti MED30 raiškos poveikį, ląstelės (juoktis ir MED30-vyresni) buvo pasėjamos tokiu tankumu 1 × 10 5 ląstelių /ml. Norėdami pašalinti platinimo susijusius poveikius, mitomicino C (0,01 mikrogramo /ml, Sigma-Aldrich) buvo pridėta. Ląstelės buvo leidžiama migruoti keturias arba šešių val. tada membranos buvo fiksuotas ir dažomi DA-Quik tirpalo (SYSMEX, Kobe, Japonija) ir nuplauti distiliuotu vandeniu. Mobilaus ryšio numeriai 10 atsitiktinai pasirinktose srityse buvo skaičiuojami naudojant šviesos mikroskopu.}

Matrigel invazija tyrimas

skrandžio vėžio ląstelių gebėjimas įsiveržti buvo tiriama naudojant 24 šulinėlių BioCoat ^{TM TM kameriniai įdėklai (BD biologijos, San Jose, CA, JAV). Viršutinio paviršiaus intarpais invazija kamerose buvo padengtas 0,5 mg /ml augimo faktoriaus sumažinto Matrigel (BD Bioscience) ir apatinio paviršiaus su 0,5 mg /ml fibronektino (Sigma-Aldrich). Vieną dieną po transfekciją su SCR arba MED30 siRNA, ląstelės buvo pasėjamos esant tankiui 5 × 10 4 ląstelių /ml terpės serumo neturinčioje į 8-mikrometrai porėtos BioCoat Matrigel kamerinių intarpais, ir įdedamas į šulinius alsuoja 750 įxL vidutinės papildytas 10% FBS kaip chemoattractant. Išnagrinėti MED30 raiškos, ląstelių (juoktis ir MED30-ekspresija ląstelių) poveikį buvo pasėjamos tokiu tankumu 1 × 10 4 ląstelių /ml. Norėdami pašalinti platinimo susijęs poveikis, mitomicino C (0,01 mikrogramų /ml, Sigma-Aldrich) buvo pridėta. Po inkubacijos 24 val, ne invazija ląstelės ant paviršių membranas buvo ištrintas, grandymo. Invazija ląstelės apačioje paviršių buvo nustatyti ir tamsintas su DA-Quik tirpalu. Eksperimentai buvo atliekami tris kartus, ir ne mažiau kaip 5 laukai buvo skaičiuojami už eksperimentą.}

ksenografiniuose tyrimas

SNU638 ląstelės buvo pernešta su SCR ar MED30 siRNA. Po 2 dienų, ląstelės buvo surinkti trypsinization, plaunama du kartus PBS, ir buvo suleistas į poodį (1 × 10 ^{6 ląstelių 100 pL PBS) į sunkus kombinuotas imunodeficito (SCID) pelių. Naviko apimtys buvo skaičiuojamos kiekvieną savaitę iš trijų savaitės iki septynių savaitę po injekcijos, naudojant šią formulę: naviko apimtį (mm 3) = (
× b
2 ) /2, kur
= ilgis milimetrais ir b
= plotis mm. Tuo septynias savaites, pelėms buvo aukojami ir auglio apimtis ir svoriai buvo registruojami. Šis eksperimentas buvo atliktas griežtai laikantis vadove rekomendacijas dėl priežiūros ir naudojimo Nacionalinio sveikatos instituto išleistų laboratoriniams gyvūnams. Pusano nacionalinio universiteto institucinė Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas (PNUIACUC) patvirtino eksperimento protokolu.}

Statistinė analizė

Rezultatai pateikiami kaip reiškia ± SDS. Neparametrinis Mann-Whitney U testas arba Stjudento t-testas (neporiniai) buvo siekiama nustatyti skirtumų tarp vidurkiams dvi grupes reikšmes, o į vieną pusę buvo naudojamas dispersinė analizė (ANOVA), po Tukey anketa daugeliui lyginimų analizuoti tris arba daugiau grupių. * Rodo, P
vertę "< 0,05. Išgyvenimo laikas buvo apibrėžiama kaip laikas praėjo nuo gydymo ir mirties arba kol buvo gautas paskutinis tikslas tolesnės informacijos. Kaplan-Meier metodu buvo siekiama nustatyti ryšį tarp išlikimo ir MED30 išraiškos santykį. Kreivės buvo lyginami naudojant log-rank testą atlikti statinio lygis yra 95%. P
vertės < buvo laikoma 0,05 statistiškai reikšmingas. Duomenys buvo analizuojami naudojant SPSS programinės įrangos versija 12,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, JAV).

rezultatai

Padidėjusi MED30 skrandžio vėžio audiniuose

Jei ištirti vaidmenis iki MED30 skrandžio vėžio, pirmiausia išnagrinėjo išraiška statusą MED30 į naviko audiniuose 23 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. buvo rastas MED30 baltymų turi būti plačiai ekspresija ir vėžinių audinių regionuose (pav 1A-1D) ir buvo akivaizdu, ekspresija ir užplūsta skrandžio vėžio ląstelių (pav 1c) ir metastazavusiu vėžinių ląstelių viduje nukentėjusių limfmazgių (pav 1d). Kad patvirtintų savo imunohistocheminis rezultatus, atliekama kiekybinė realaus laiko PGR skrandžio vėžio audiniuose naudojant MED30-specifinius pradmenis. Kaip parodyta Fig 1F, DPY30 buvo aktyvuojami 10 atvejų (10/23, 43%). Mes taip pat išnagrinėjo išraiška modelio MED30 skrandžio vėžio ląstelių linijų realaus laiko PGR, ir nustatė, kad ji būtų ekspresija penkiose iš skrandžio vėžio ląstelių linijų išbandytų (išskyrus SNU1), palyginti su normaliomis skrandžio audinių (pav 1e). Norėdami ištirti ryšį tarp MED30 saviraiškos ir klinikinių charakteristikų tarpusavio santykį, mes atliekame imunohistocheminis naudojant 41 skrandžio vėžiu audinių mėginius (1 lentelė). Įdomu tai, kad MED30 išraiška buvo teigiamai koreliuoja su N etape (pav 1G), bet ne su pacientų išgyvenimo (duomenys neparodyti).

Vaidmenys MED30 į proliferaciją, migraciją ir invazija skrandžio vėžio ląstelių

Jei išnagrinėti vaidmenis MED30 skrandžio kancerogenezėje, mes išnagrinėjo MED30 triuškinantis ar raiškos dėl dauginimosi, migracijos poveikį, ir invazija iš šešių skrandžio vėžio ląstelių linijas (SNU1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638 ir NVI -N87 ląstelės). Realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė buvo naudojami analizuoti triuškinantis ir Padidėjusi MED30 į SNU216 ir SNU638 ląstelių (pav 2A-2C). Kai šios ląstelės buvo pernešta su MED30 siRNA (100 Nm), MED30 išraiška sumažėjo ne baltymų ir mRNR lygių apie 80% po dviejų dienų, lyginant su SCR siRNA ir MED30 raiškos iki kDNR transfekciją padidėjo MED30 mRNR ir baltymų lygį, palyginti su tuščiu valdymo užkrato platintojus Transfekuoti ląstelių (juoktis ląstelių) daugiau kaip 3 kartus.

kitas tyrė MED30 vaidmenį vėžinių ląstelių proliferaciją. Platinimu tyrimai buvo atlikti praėjus 5 dienoms po transfekciją su SCR ar MED30 siRNA. Nokdaunas iš MED30 slopino visų skrandžio vėžio ląstelių išbandytų (SNU16, SNU216, SNU620 ir SNU638), palyginti su SCR dauginimasis 18%, 68%, 98% ir 42%, atitinkamai (pav 2D). Panašūs rezultatai buvo pastebėta, kai mes atliekame platinimo tyrimus, atliekamus dvi ar tris dienas po transfekciją (duomenys neparodyti). Nuosekliai, MED30 raiškos sustiprino SNU216 išaugos ir SNU638 ląsteles 1,9 ir 2,2 karto, palyginti su juoktis ląsteles.

Norėdami nustatyti vaidmenį MED30 vaidmenį skrandžio vėžio ląstelių migracija, mes panaudojome Boyden kamerą tyrimas. Nokdaunas iš MED30 sumažėjo FBS sukelta migracija iš SNU216 ir SNU638 ląstelių 90% ir 52%, atitinkamai, lyginant su SCR perkeltų ląstelių (pav 3A ir 3C). Be to, MED30 raiška padidėjo FBS sukeltas migracijos SNU216 ir SNU638 ląstelių 3,2 ir 2,8 karto, palyginti su juoktis ląstelių (pav 3b ir 3c). Šie rezultatai paskatino mus išnagrinėti MED30 vaidmenį skrandžio vėžio ląstelių invaziją. Be Matrigel invazijos metodu, MED30 siRNR slopinamas FBS sukeltos pažeidžiančių SNU216 ir SNU638 ląstelių, palyginti su SCR siRNA atitinkamai 64% ir 47%, atitinkamai (pav 4a ir 4c) ir MED30 raiškos paspartino FBS sukeltos pažeidžiančių SNU216 ir SNU638 ląstelių prieš juoktis ląstelių 2,5 ir 2,2 karto, atitinkamai (pav 4b ir 4c).

poveikis MED30 triuškinantis ant vivo
tumorogeniškumo

Jei išnagrinėti MED30 poveikį naviko augimas, mes po oda švirkščiamas SNU638 ląsteles transfektuotose SCR ar MED30 siRNA į SCID pelėmis, o tada stebėti naviko augimą septynias savaites (pav 5A). Apčiuopiamas navikų buvo aptikti per tris savaites SCR kontrolės pusių. Tačiau vėžio ląstelės transfektuotose MED30 siRNA eksponuojami lėtesnį augimą. Septynias savaites po injekcijos, pelėms buvo paaukota, o auglio apimtis ir svoriai buvo matuojamas (pav 5B ir 5C). Rezultatai parodė, MED30 triuškinantis žymiai sumažino naviko apimtį ir svorius.

reguliavimas EMT keliu iki MED30

Norėdami nustatyti mechanizmo, lemiančio skrandžio kancerogenezėje pagal MED30 skatinimą, mes ištirti raiškos modelius genų dalyvauja epitelio-mezenchiminių perėjimas (EMT: pagrindinis procesas metastazių ir invazijos) realaus laiko PGR. Nokdaunas iš MED30 šiek tiek padidino E-cad lygį (CDH1) mRNR SNU638 ląstelių, palyginti su SCR transfekciją, bet sumažėjo išraiškas N-cad (CDH2), P-cad (CDH3) ir vimentin (VIM) 42% 36% , ir 41%, atitinkamai (pav 6A). Nuosekliai, MED30 raiškos sumažėjo CDH1 iRNR lygį 35%, lyginant su juoktis ląstelių, tačiau padidino N-cad (CDH2), P-cad (CDH3), TWIST šeimos bHLH transkripcija 1 veiksnys ir 2 (TWIST1 /2) ir vimentin išraiškos (VIM) 2,9, 3,3, 3,4, 2,4, 2,2, ir 4,2 karto, atitinkamai (pav 6A). MRNR lygiai sraigė šeimos cinko pirštu 1 ir 2 (SNAI1 /2) nepakito. Mes tada patvirtino, kad MED30 raiška taip pat padidėjo baltymų lygius E-cad, N-cad, p-cad, Twist1 ir vimentin (pav 6b). Norint tiksliai SNU638 ląstelių morfologijos tyrimas atskleidė, kad MED30 raiškos sukėlė perėjimas nuo grindiniu panašus į pailgos fibroblastų-kaip morfologijos (pav 6c), o MED30 nokdaunas nepakeitė morfologiją (duomenys neparodyti). Šie rezultatai rodo, kad MED30 teigiamai reguliuoja EMT.

Diskusijos

funkciniai vaidmenys MED subvieneto MED30 (taip pat žinomas kaip TRAP25) yra sunkiai suprantamas. Neseniai pranešime MED30 buvo nustatyta, kad svarbų vaidmenį reguliuojant mitochondrinio funkcijas ir vientisumą homozigotiniu pelių [19]. Šioje studijoje, mes išnagrinėjome funkcinius vaidmenis MED30 metu skrandžio vėžio progresavimą. Buvo nustatyta, MED30 reglamentavo dauginimosi, migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląstelių ir jų vivo
tumorogeniškumo. Po užtikrinti triuškinantis ir raiška efektyvumą kiekybiniais realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė analizė (2 pav), mes nustatėme, kad MED30 nokdaunas nepaprastai slopino proliferaciją, migraciją, ir invazija skrandžio vėžio ląstelių, ir kad MED30 raiška turėjo priešingą poveikį (Figos 2-4). Be to MED30 nokdaunas sumažintas vivo
tumorogeniškumo (5 pav). Be to, mes taip pat nustatė, kad MED30 buvo ekspresija skrandžio vėžio audiniuose ir skrandžio vėžio ląstelių linijas (1 pav). Šie rezultatai rodo, kad MED30 gali žaisti svarbius patofiziologinių vaidmenis metu skrandžio kancerogenezėje.

Kadangi specifiniai MED subvienetų yra susiję su signalų aktyvuota transkripcijos veiksnių ir RNR polimerazės II (Pol II) [20] ir veikti kaip tarpininkės ir integratorius nukreipti įvairias signalines kelius, pavyzdžiui, dėl atominės hormono receptorių keliu (per MED1) [21], The TGF-β-signalizavimo kelias (per MED12 ar MED15) [22, 23], The WNT signalo kelias (per MED12) [ ,,,0],24], o RAS-MAPK signalizacijos kelias (per MED23) [25-27]. Buvo pasiūlyta, kad šie signaliniai keliai gali sukelti EMT [28-32], kuri yra žinoma, kad būti susijęs su metastazėmis invazijos, platinimu ir Atsparumas cheminėms epitelinio vėžio [29, 33, 34]. Todėl mes paprašėme, ar MED30 sukelia EMT. MED30 paskatino EMT susijusių genų raišką (N-cad; CDH2 P-cad; CDH3, Tvist susijęs baltymas 1 ir 2; TWIST1 /2, vimentin; VIM), tačiau slopino El cad (CDH1) A išraiška žinomas navikas slopintuvas (pav 6A ir 6B). Be to, MED30 raiškos sukėlė fibroblastų kaip morfologiją (pav 6c), rodo, MED30 sukelia EMT skrandžio vėžio ląsteles.

Apibendrinant, ši studija palaiko mintį, kad MED30 veikia kaip onkogeno metu skrandžio kancerogenezėje ir siūlo MED30 gali reguliuoti EMT skrandžio vėžio. Nors tolesni tyrimai reikalingi, siekiant nustatyti, kaip MED30 sukelia EMT, mūsų rezultatai rodo, kad MED30 būti laikomi naujais molekulinės taikiniu skrandžio vėžiui gydyti.

Padėka

Šis darbas buvo remiamas Bio & Medicinos technologijų plėtros programa (2012M3A9C6050213) ir pagrindinių mokslo tyrimų fondas (2012R1A1A3010521) Nacionalinės mokslinių tyrimų fondo (NRF), finansuojamą iš Korėjos vyriausybės (Mest), ir dotacijos iš Nacionalinio mokslinių & D vėžio kontrolės programa ministerijos Sveikatos , gerovės ir šeimos reikalų, Korėjos Respublika (0.920.050).

• PLoS ONE: vaidmenys DPY30 į platinimu ir judrumas skrandžio vėžio ląsteles
• PLoS ONE: Photoimmunotherapy skrandžio vėžio peritoninės karcinomatoze pelių modelis