PLOS ONE: E-cadherina Cuentas de desestabilización para la patogenicidad de mutaciones en sentido erróneo gástrico difuso hereditario Cancer

Extracto

E-cadherina es fundamental para el mantenimiento de la arquitectura del tejido debido a su papel en la adhesión célula-célula. E-cadherina mutaciones son la causa genética de cáncer gástrico difuso hereditario (CGDH) y mutaciones sin sentido representan una carga clínica, debido a la incertidumbre de su papel patogénico. In vitro e in vivo, la mayoría de las mutaciones conducen a la pérdida de función, aunque el factor causal es desconocido para la mayoría. La hipótesis de que la desestabilización podría ser responsable de la patogenicidad de mutaciones sin sentido E-cadherina en CGDH, y puesto a prueba nuestra hipótesis utilizando en silico e in vitro herramientas. FoldX algoritmo se utilizó para calcular el impacto de cada mutación en estabilidad en estado nativo de la E-cadherina, y el análisis se complementa con la conservación evolutiva, por SIFT. Curiosamente, los pacientes que albergan CGDH línea germinal E-cadherina mutantes desestabilizan presentan una menor edad en el diagnóstico o la muerte, lo que sugiere que la pérdida de estabilidad en estado natural de las cuentas de E-cadherina para el fenotipo de la enfermedad. Para dilucidar la relevancia biológica de la desestabilización de E-cadherina en CGDH, se investigó un grupo de mutaciones identificadas recientemente asociados-CGDH (E185V, S232C y L583R), de los cuales L583R se prevé que sea desestabilizador. Se demuestra que esta mutación no es funcional in vitro, exhibe vida media más corta y no es capaz de madurar, debido a la degradación del proteasoma dependiente de prematuro, un fenotipo revertido por la estabilización con la mutación artificial L583I (estructuralmente tolerada). Aquí nos presenta modelos estructurales E-cadherina adecuados para predecir el impacto de la mayoría de las mutaciones de sentido erróneo asociadas al cáncer y se muestra que la desestabilización E-cadherina conduce a la pérdida de la función in vitro e in vivo una mayor patogenicidad.

Visto: Simões-Correia J, J Figueiredo, Lopes R, Stricher F, C Oliveira, Serrano L, et al. (2012) E-cadherina Cuentas de desestabilización para la patogenicidad de sentido erróneo Las mutaciones en el cáncer gástrico difuso hereditario. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10.1371 /journal.pone.0033783

Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón

Recibido: 9 de noviembre de 2011; Aceptado: February 17, 2012; Publicado: 21 Marzo 2012

Derechos de Autor © 2012 Simões-Correia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación para a Ciência e Tecnologia, Portugal (PTDC /SAU-DAB /64319/2006, PTDC /SAU-DAB /104017/2008, SFRH /TLP /48765/2008), EMBO (ASTF comunión corto plazo 60- 2009) y de la UE Las perspectivas de subvención (SALUD-F4-2008-201648). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

e-cadherina es una glicoproteína de adhesión célula-célula compuesta de cinco repeticiones de tipo cadherina extracelulares, una región transmembrana y una cola citoplásmica muy conservadas [1], [2]. E-cadherina se expresa principalmente en las células epiteliales y es el componente principal de Adherentes uniones (AJ). Estos clúster uniones, a través de interacciones homofílicas, a través de los dominios extracelulares de moléculas de cadherina E-dependientes de calcio, en la superficie de las células vecinas homotipica.

El papel de la E-cadherina en el desarrollo tumoral está bien descrito, y su pérdida de la expresión es un sello en carcinomas [3]. La evidencia experimental apoya un papel para el complejo de E-cadherina tanto en la supresión de la formación de la invasión y metástasis [4]. La pérdida de expresión de E-cadherina se asocia frecuentemente a eventos genéticos como el sitio de empalme y truncado mutaciones causadas por inserciones, deleciones y mutaciones sin sentido, además de las mutaciones de sentido erróneo [5]. En el cáncer gástrico difuso esporádico, las alteraciones en el gen que codifica E-cadherina (CDH1) se encuentran preferentemente en los exones 7-9 [5], mientras que en los cánceres de mama lobular que se extienden a lo largo del gen, sin punto de acceso preferencial [6]. mutaciones de aminoácidos se encuentran en estos dos tipos de cáncer esporádico y también en sarcomas sinoviales [7].

La agregación familiar de cáncer gástrico difuso (DGC) representa el 10% de los casos de cáncer gástrico (CG), y sólo 1-3% son hereditarios [8]. A partir de estos casos familiares, cáncer gástrico difuso hereditario (CGDH) se define por criterios estrictos que fueron definidos por el ligamiento Consorcio Internacional del Cáncer Gástrico (IGCLC) en 1999: (1) dos o más casos documentados de cáncer gástrico difuso en el primer segundo grado /parientes, con al menos un diagnosticados antes de los 50 años; o (2) tres o más casos de cáncer gástrico difuso documentado en parientes de primer /segundo grado, independientemente de la edad. El inicio temprano de cáncer gástrico de (EODGC) se considera cuando un individuo aislado es diagnosticado con DGC con menos de 45 años de edad. mutaciones de la línea germinal CDH1 se encuentran en 30% de los casos CGDH [9]. La asociación de mutaciones de CDH1 y cáncer gástrico familiar fue descrito por primera vez por Guilford et al
en 1998 [10] y, desde entonces, muchos estudios informaron diferentes tipos de mutaciones de CDH1 en CGDH [11], [12], [13 ]. Entre todos los reportados CDH1
mutaciones en la línea germinal, el 77,9% son absurdo, el sitio de empalme y mutaciones de cambio (predichos para producir codones de terminación prematuros) y el 22,1% son mutaciones sin sentido [9]. Las mutaciones que generan PTC normalmente son perjudiciales, los pacientes se consideran portadores de alto riesgo, y se les recomienda tener una gastrectomía total profiláctica [14]. La patogenicidad de mutaciones de sentido erróneo no es sencillo, y estas alteraciones se denominan comúnmente como sin clasificar variantes de secuencia (USVs) debido a la falta de criterios estrictos para evaluar su impacto. Varios parámetros se han tenido en cuenta para la clasificación de USV E-cadherina en CGDH: 1) co-segregación de la mutación con DGC (dentro de las genealogías); 2) la frecuencia de mutación en la población control sana; 3) la recurrencia de mutación (en familias independientes). El análisis de segregación es a menudo imposible, con un pequeño número de casos afectados disponibles para el diagnóstico molecular [15], y la ausencia de información clínica es un paso limitante para inferir el significado patogénico de estas mutaciones. Para evitar esta limitación, hemos desarrollado previamente in vitro
ensayos funcionales para evaluar el impacto funcional de E-cadherina mutaciones de la línea germinal missense [16], [17]. Sin embargo, tales estudios implican condiciones experimentales específicas de laboratorio, a saber, ensayos de biología celular, y que están consumiendo tiempo para usar en la rutina. in silico
predicciones son fiables y análisis rápido que se puede utilizar para predecir el impacto de las mutaciones puntuales, especialmente cuando la información está disponible estructural [18], [19].

En este trabajo, hemos explorado el potencial de la estructura de base In silico
predicciones para evaluar el impacto de las mutaciones sin sentido e-cadherina, que se encuentran en el cáncer hereditario y esporádico. Nuestro análisis se basa en el cálculo de los cambios de estabilidad en estado nativo inducidos por cada variante (ΔΔG =? G _{WT-Delta G Mut), obtenido por el algoritmo de proteína diseño FoldX [20], [21]. Curiosamente, el grupo de pacientes con mutaciones que desestabilizan (ΔΔG > 0,8 kcal /mol) se caracteriza por una menor edad al momento del diagnóstico o la muerte por DGC, lo que sugiere que la pérdida de estabilidad en estado nativo de la E-cadherina contribuye al fenotipo de la enfermedad. El uso de un modelo celular, se analizó el fenotipo de la desestabilización de E-cadherina, y encontramos que cuando A induce mutación disminuyeron-estado nativo estabilidad, E-cadherina se prematuramente degradada por el proteasoma, exhibe vida media más corta, lo que resulta en la pérdida del adhesivo función. En conjunto, nuestros resultados sugieren que las cuentas de la desestabilización de la patogenicidad de mutaciones sin sentido E-cadherina se encuentra en CGDH.}

Materiales y Métodos

Colección de secuencia E-cadherina y variantes PDBs

e-cadherina variantes asociadas a CGDH o EODGC se obtuvieron de la literatura, y las variantes somáticas se recogieron del Catálogo de mutaciones somáticas en el cáncer (cósmica) de base de datos (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cósmico/). Tres nueva secuencia de E-cadherina variantes cuando se informó a nuestro laboratorio para el análisis funcional: E185V, S232C y L583R. Recientemente, se informó L583R, con datos funcionales asociados [22].

PDB relacionados con E-cadherina se identificaron mediante la búsqueda automática con Swiss Modelo Repositorio (http://swissmodel.expasy.org). Secuencia de la alineación de E-cadherina humana y cada una de las secuencias utilizadas para los diferentes modelos se realizó con M-café [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Las imágenes fueron preparados con PyMoI. Tras el análisis de la secuencia y homología estructural, se seleccionaron tres PDBs utilizar como modelos:. Ectodominio Xenopus C-cadherina (AP 1L3W), prodominio ratón E-cadherina (AP 1OP4) y el dominio de ratón β-catenina interacción (AP 1I7X)

FoldX cálculos y análisis SIFT

Mediante el comando FoldX (http://foldx.crg.es/) Buildmodel
hemos construido tres modelos diferentes (prodominio, extracelular y citoplásmico); las tres estructuras fueron humanizados por sustitución de cada aminoácido diferente. La estructura resultante se optimiza mediante el comando RepairPDB
y las energías donde analizaron con Estabilidad
o AnalyseComplex
comandos. Las enfermedades asociadas a mutaciones se generaron con el Buildmodel
de comandos, cada mutación repetida en cinco carreras. Las energías son una salida automática en FoldX, y el cambio de estabilidad en estado nativo, ΔΔG, entre el TE y mutante (ΔΔG =? G _{WT-? G Mut) también se genera en un archivo separado, con la norma correspondiente desviaciones, y todas las sanciones energéticos asociados a cada mutación. Sólo con mutaciones ΔΔG > 0,8 kcal /mol se consideraron perjudicial}

Se utilizó SIFT (http://sift.jcvi.org/, clasificación intolerante De Tolerante) para evaluar la conservación de cada sustitución de aminoácidos, como anteriormente. se describe [25], utilizando la función de abrir y cerrar de GI:. 31073. Sólo mutaciones con una puntuación inferior a 0,05 fue considerado intolerante

ProP (http://www.cbs.dtu.dk/services /prop /) [26] se utilizó para evaluar si las mutaciones podrían tener un efecto sobre la escisión prodominio.

cultivo de células y transfección

e-cadherina WT cDNA fue clonado en pIRES2-EGFP vector de acuerdo para la fabricación de instrucciones (Clontech, Takara Bio) y mutaciones E185V, S232C, L583R y L583I hE-cadherina fueron inducidos por mutagénesis dirigida al sitio tal como se describe anteriormente [27]. El vector vacío (Mock) se utilizó como control
células

CHO (ovario de hámster chino) (número ATCC: CCL-61). Se cultivaron en medio Alfa-MEM (Gibco, Invitrogen) suplementado con 10% de bovino fetal suero (FBS; Gibco, Invitrogen) y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen). Las células se evaluaron de forma esporádica de la contaminación por micoplasmas inmunofluorescencia con DAPI. Las células fueron transfectadas con 1 ug de cada uno de los vectores que codifican las diferentes formas de E-cadherina (WT, E185V, S232C, L583R y L583I) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con el procedimiento de fabricación. Para el establecimiento de la línea celular estable, las células fueron seleccionadas por resistencia a los antibióticos a 5 mg /ml de blasticidina (Gibco, Invitrogen). Todas las líneas celulares se mantuvieron en un incubador humidificado con un 5% de CO _{2 a 37 ° C}

Los ensayos funcionales

Las células transfectadas transitoriamente CHO (ovario de hámster chino) (ATCC número:. CCL -61) fueron sometidos a fluir citometría, mediante la medición de la fluorescencia GFP, para evaluar la eficacia de la transfección antes de cada experimento. Para el ensayo de agregación lento, pocillos de 96 pocillos de la placa se revistieron con 50 l de solución de agar (100 mg Bacto-Agar en 15 ml de PBS estéril). Las células se separaron con tripsina y se suspendieron en medio de cultivo. Una suspensión de 1 × 10 ^{5 células /ml y se preparó 2 × 10 4 células fueron sembradas en cada pocillo. La placa se incubó a 37 ° C en una cámara humidificada con 5% de CO _{2 para 48 h. La agregación se evaluó en un microscopio invertido (4 aumentos) y se fotografió con una cámara digital.}}

Western blotting

Los lisados ​​celulares se obtuvieron con tampón de lisis catenina (1% Triton X-100, 1 % Nonidet P-40 en PBS), suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa (Roche) y cóctel inhibidor de fosfatasa (Sigma). La cuantificación de proteínas se realizó mediante un ensayo de Bradford modificado (Bio-Rad). Para cada muestra, 25 g de proteína se cargaron, separados en 7,5% de SDS-PAGE, y a electrotransferencia a membrana de nitrocelulosa (GE Healthcare Life Sciences). Las membranas se bloquearon con leche en polvo 5% no grasa y 0,5% de Tween-20 en PBS. Immunoblotting se realizó con anticuerpos contra la E-cadherina (1:1000; BD Biosciences), actina (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), y α-tubulina (1:10000; Sigma). Ovejas anti-ratón (GE Healthcare Life Sciences) o burro anti-cabra (Santa Cruz de Biotecnología) se utilizaron como anticuerpos secundarios, seguidos de detección ECL (GE Healthcare Life Sciences). Las inmunotransferencias se cuantificaron en un software Cantidad (Bio-Rad).

celular activada por fluorescencia (FACS)

Las células fueron cultivadas a una monocapa confluente, individual con Versene (Gibco, Invitrogen) y se resuspendieron en PBS enfriado con hielo con 0,05 mg /ml CaCl _{2. Una suspensión de 5 × 10 ^{5 células se centrifugó durante 5 minutos a 1500 rpm 4 ° C, y se lavaron en PBS con 0,05 mg /ml CaCl 2 3% de BSA. Las células se incubaron durante 60 minutos con un anticuerpo primario contra la E-cadherina, HECD1 (Zymed Laboratories) a una dilución 1:100. Las células se lavaron dos veces y después se incubaron con anti-ratón biotinilado (Dako) a una dilución 1:100. Las células se lavaron dos veces y después se incubaron con estreptavidina-PE CY5 (BD Pharmingen) a una dilución de 1:40. Finalmente, se lavaron las células, se resuspendieron en 500 l de PBS, y se analizaron 50000 células en un citómetro de flujo (Coulter Epics XL-MCL). Los datos se analizaron con el software WinMDI.}}

Inmunofluorescencia tinción

para inmunofluorescencia y microscopía, las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio y se dejaron crecer hasta aproximadamente 80% de confluencia, se fijaron en metanol enfriado con hielo durante 15 minutos, lavaron 2 veces con PBS, y se incubaron con el anticuerpo primario, diluido en PBS 5% de BSA, durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios utilizados: monoclonal de ratón anti-E-cadherina (BD Biosciences); conejo anti-calnexina (Stressgen). Los anticuerpos secundarios utilizados: Alexa Fluor 488 anti-ratón (1:500; Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-conejo (1:500; Invitrogen). Los cubreobjetos fueron montados en portaobjetos de vidrio, utilizando Vectashield con DAPI para la detección nuclear (Vector Laboratories). La adquisición de imágenes se realizó en Carl Zeiss Axiovert 200 M Apotome microscopio de fluorescencia utilizando 40 × objetivos. Las imágenes fueron adquiridas con una cámara Axiocam gestión de recursos humanos y procesados ​​por el software versión 4.8 Axiovison.

tratamientos con células

Para la inhibición de la síntesis de proteínas, las células fueron tratadas con 25 M de cicloheximida durante 8 hy 16 h, y la cantidad de total de e-cadherina se analizó por WB como se describió anteriormente. Para el ensayo de la inhibición del proteasoma, las células se sembraron en placas de 6 pocillos, cultivadas a aproximadamente 80% de confluencia, y se incubaron durante 16 h con 10 mM MG132 (Calbiochem). Los lisados ​​celulares se analizaron por WB como se describió anteriormente.

Resultados

1. modelos estructurales E-cadherina

Hay pocas estructuras humana E-cadherina (HE-CAD) disponibles, y sólo cubren pequeñas porciones de la proteína (Tabla S1). Mediante la búsqueda automática de Swiss Modelo de repositorio, se encontró que el AP 1L3W, anotado de la longitud total dominio extracelular de Xenopus EP-cadherina (EP-cad), es altamente homólogo al mismo dominio de E-cadherina humana. Se analizaron homología de secuencia por la alineación utilizando M-café, un alineamiento de secuencias múltiples que combina la salida de varios paquetes múltiples alineación de secuencias (PCMA, Poa, MAFFT, músculo, T-Coffee, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. La figura 1A muestra la alineación de las dos secuencias de dominio extracelular. Las regiones de ladrillo rojo representan perfecto acuerdo entre los métodos utilizados, lo que representa secuencias muy similares. Para construir la estructura del modelo, hemos eliminado las regiones con ninguna similitud (Figura 1A, estrellas), y limitado el modelo a las regiones con la alineación fiable (flecha negro, Figura 1 A). La estructura de Xenopus se humanizó como se describe en Materiales y Métodos y Figura 1B muestra el alineamiento estructural de He-Cd dominios EC1 EC2-(de AP 2O72) y dominios EC1-EC2 de la Xenopus derivados modelo estructural. Las dos estructuras están casi superpuestos, lo que indica que la similitud entre los dominios extracelulares de cadherina E humana y Xenopus EP-cadherina es no sólo en el nivel de secuencia, pero también a nivel estructural. La estructura del modelo de E-cad humana exhibe energías compatibles con la estructura de Xenopus, con una ligera disminución de la energía libre (? G) obtenido para el modelo (? G _{verdadera = 559.99 kcal /mol y Delta G modelo = 531,77 kcal /mol), lo que indica que la humanización no introduce enfrentamientos adicionales. Recientemente, una estructura del dominio extracelular del ratón fue liberado (AP 3Q2V, el cuadro S1), y también utiliza esta estructura como modelo, como una forma de refinar los resultados obtenidos con el modelo de Xenopus.}

Hemos establecido otros dos modelos, que cubren el prodominio (AP 1OP4, de ratón N-cadherina) y el dominio citoplásmico β-catenina (AP 1I7X, de ratón e-cadherina), utilizando la misma metodología. En conjunto, los tres modelos cubren la mayor parte de la estructura de la proteína (Figura 1C): el modelo prodominio cubre las posiciones 28-117, los modelos extracelulares posiciones 155 a 697 y el dominio citoplásmico β-catenina cubre 782-838. A nivel del dominio juxtamembrane, una estructura está anotado, que comprende la superficie de interacción entre E-cadherina y p120 [28]. Esta estructura contiene un péptido pequeño, 18 aminoácidos de largo (que abarca las posiciones 756-773 en HE-CAD), con muy bajo contenido estructural, factores que disminuyen la fiabilidad de los cálculos de energía, por lo que descarta esta estructura del análisis.

2. in silico
predicción del impacto de USVs E-cadherina asociados con el cáncer

mutaciones E-cadherina no sólo son la causa genética de CGDH, sino que también se encuentran con frecuencia en diferentes tipos de esporádica tipos de cáncer. Se analizaron in silico
el impacto de todas las mutaciones asociadas al cáncer de E-cadherina de sentido erróneo que localizar a las regiones cubiertas por los modelos estructurales generados: 22 mutaciones de la línea germinal que se encuentran en la configuración de CGDH y EODGC y 57 encontramos en cánceres esporádicos. USV línea germinal E-cadherina se obtuvieron de la literatura, y algunos son comunicaciones personales de nuestro laboratorio. Algunas mutaciones CGDH /EODGC no son posibles para modelar, debido a la falta de información estructural (por ejemplo, los localizados en el dominio de juxtamembrane E-cadherina), y no se incluyeron en este análisis. Las mutaciones somáticas se obtuvieron de la base de datos de proyecto del genoma del cáncer, y contienen mutaciones encontradas en el cáncer gástrico y lobular de mama (los dos únicos tipos de cáncer asociados a CGDH), sino también otros tipos de cáncer tales como sarcoma sinovial o carcinoma del conducto biliar (Tabla S2 ).

Uso de los modelos estructurales descritos anteriormente, se utilizó FoldX para generar cada uno de los USVs cáncer asociado, y se evaluó su estabilidad en estado nativo,? G (comúnmente denominado como energía total por simplicidad) [20]. La diferencia energética entre la referencia WT y el mutante correspondiente (ΔΔG =? G _{WT-? G Mut) se calculó para los 22 CGDH /EODGC USV E-cadherina localizadas en las regiones cubiertas por las estructuras de modelos, y la resultados se enumeran en la Tabla 1. Cuando ΔΔG es negativa, esto refleja una ganancia de estabilidad en estado nativo en la forma mutante; cuando es positiva, implica que el mutante es menos estable entonces la referencia WT. Estudios previos en otras proteínas han demostrado que los cambios en la estabilidad calculados con el algoritmo FoldX debajo de 0,8 kcal /mol se encuentran dentro del cambio error del software, y por lo tanto se considera que es no significativa [21]. En consecuencia, sólo se consideran mutaciones para ser desestabilizadora cuando se inducen cambios de energía por encima de 0,8 kcal /mol. En la Figura 2A, mutaciones anteriores son el esquema desestabilizador, mientras que las de abajo se toleran estructuralmente. Está claro que las mutaciones que desestabilizan se esparza a lo largo de la proteína, sin dominio preferencial afectados
.}

El prodominio de He-cad se escinde durante la maduración, y si esto no se logra, se deteriora la función de adhesión E-cadherina [ ,,,0],29], [30]. Para las mutaciones localizadas en este campo, se evaluó el impacto de la energía total, con FoldX, la conservación con SIFT, y también se evaluó si la interferencia con el sitio de corte con prodominio ProP (detalles en Materiales y Métodos). Se encontró que tanto hereditaria (G62V y T118R) y esporádicas mutaciones localizadas en el prodominio de E-cadherina (P30T, G62D, H92Y, H121R y H123Y) son estructuralmente tolerados, según lo predicho por FoldX (Tabla S3). Cuando analizamos el impacto basado en la conservación usando SIFT, también se encontró que ninguna de las mutaciones se consideró perjudicial, ya que su grado de conservación es bajo (Tabla S3). Estos resultados indican que la patogenicidad de USVs E-cadherina localizada en el dominio pro probablemente se no depende de la desestabilización. También se encontró ningún efecto sobre la escisión del propéptido, según lo predicho por ProP (datos no mostrados). En consecuencia, creemos que la patogenicidad de mutaciones de E-cadherina en este dominio puede ser el resultado de la interferencia con el acoplamiento de las proteínas implicadas en el procesamiento prodominio, imposible predecir in silico
.

E hereditaria USVs -cadherin abarcan toda la longitud del dominio extracelular, mientras que las mutaciones esporádicas se encuentran predominantemente en EC2-EC3, como de acuerdo con el punto de acceso se ha descrito anteriormente en los exones 7-9 [5]. Del total de mutaciones CGDH /EODGC 18 de la línea germinal localizadas en este campo, se encontró que 10 tienen un impacto estructural significativo en la proteína (Tabla 1). Aproximadamente la mitad de las mutaciones esporádicas también están desestabilizando (Tabla S3), independientemente del dominio EC donde se localizan, lo que sugiere que la desestabilización del estado nativo puede estar asociada a una fracción sustancial de los cánceres esporádicos que implican la pérdida de E-cadherina por mutación puntual.

Sólo tres mutaciones se localizan en la región asignada por el modelo del dominio citoplásmico de unión β-catenina (P799R, V832M, S838G): los dos primero identificado en la configuración CGDH /EODGC y el otro esporádica, que se encuentra en el carcinoma de ovario [31]. Por estas mutaciones se analizó la energía de enlace entre E-cadherina y β-catenina y se encontró que ninguno de ellos altera significativamente la afinidad de unión de β-catenina, de acuerdo a la predicción FoldX. Esto está de acuerdo con el in vitro
resultados que muestran que la mutación V832M hereditaria une eficientemente β-catenina, y su patogenicidad parece ser dependiente de la incapacidad del complejo E-cadherina /β-catenina de obligar α -catenina [32], [33].

Se recogieron todas las predicciones y funcional in vitro
de datos de mutaciones CGDH /EODGC y analizado la fiabilidad de los indicadores utilizados (Tabla 1). Se clasificaron los resultados de las predicciones como: verdadero positivo (TP) cuando la mutación se predice como nocivo in silico gratis (ya sea por FoldX o SIFT) y la exposición de la pérdida de función in vitro
; Es cierto Negativo (TN) cuando la mutación se prevé según la tolerancia in silico Opiniones y es funcional in vitro
; Falso Positivo (FP) cuando la mutación se predice como nocivo in silico
pero es funcional in vitro
; y falso negativo (FN), cuando la mutación se prevé según la tolerancia in silico
pero exhibe in vitro
pérdida de la función. PT y NT son resultados positivos, lo que significa que los predictores son capaces de detectar el impacto mutación en la función; FP y FN representan el grado de fracaso. Se encontró que ambos algoritmos son capaces de predecir el impacto funcional de hasta el 70% de las mutaciones CGDH /EODGC de la línea germinal (11 de las 16 mutaciones), con las predicciones superpuestas para medio de las mutaciones (Tabla 1, Figura 2B).

se analizaron los datos disponibles para la línea germinal mutaciones CGDH EODGC vehículos y /, aunque la información es limitada, se encontró que el conjunto más completo de los datos es la edad de inicio o la muerte asociada a la DGC. Cuando diagrama de caja de estos datos, la agrupación de portadores de la mutación "desestabilizadoras" y "para no desestabilizar", se observa una edad más joven evidente del inicio de la enfermedad (diagnóstico o la muerte) para el primer grupo (Figura 2D), lo que sugiere que la desestabilización del estado nativo explica el desarrollo temprano de la DGC.

3. importancia biológica de la desestabilización E-cadherina

Para determinar la importancia biológica de la desestabilización E-cadherina, se utilizó como sistema modelo tres mutaciones de sentido erróneo E-cadherina en la línea germinal recientemente identificados reportados en nuestro laboratorio para la caracterización funcional: E185V, y S232C L583R, la tarde describió recientemente en la literatura [22]. El in silico
análisis descrito anteriormente se llevó a cabo para estas tres nuevas mutaciones y los resultados se incluyen en la Tabla 1 (por debajo de la línea oscura). Las mutaciones E185V y S232C están estructuralmente tolerados, con ΔΔG = 0,29 kcal /mol y -0,9 kcal /mol, respectivamente (Tabla 1), considerado insignificante con respecto al impacto de la estructura. La mutación S232C promueve una disminución de la energía, la estabilización de la proteína, y esto es debido a la pérdida de la alta energía de una serina enterrado grupo OH, que no está implicado en un enlace de H, y para el alojamiento de la cadena lateral de cisteína. La mutación L583R induce la desestabilización, con ΔΔG = 2,72 kcal /mol, lo que refleja el dramático cambio de un aminoácido hidrófobo a hidrófilo, que da como resultado una arginina que no tengan capacidad para formar enlaces de H, siendo desfavorable enterrados.

n vitro
ensayos funcionales se realizaron para las mutaciones CGDH /EODGC antes mencionados, y hemos encontrado una correlación perfecta entre la funcionalidad in vitro en
y la presencia /ausencia de impacto estructural: E185V y retienen S232C la función adhesiva de e-cadherina, y son capaces de formar agregados celulares apretados, mientras L583R exhibe un patrón disperso clara, se asemeja a las células Mock (Figura 3A), lo que indica que E185V y S232C no son patógenos y L583R es patógena.

Cuando se analizó la expresión de e-cadherina en las diferentes líneas celulares, se encontró que la cantidad total de L583R mutante es más baja que la expresión WT en las mismas condiciones, mientras que las mutaciones E185V y S232C, retener niveles normales (Figura 3B). Curiosamente, la banda correspondiente a L583R es retenido en el gel, lo que indica que L583R no es capaz de madurar correctamente (forma inmadura de E-cadherina es de 130 kDa, madura es 120 kDa) y citometría de flujo resultados muestran que es menos expresado en el membrana plasmática (Figura 3C).

Cuando maduración de la proteína falla, esto comúnmente se traduce en retículo endoplasmático (ER) la retención de proteína inmadura. Para probar si L583R fue efectivamente retenido como inmaduras, analizamos si es retenido en el ER por la co-inmunofluorescencia con la calnexina marcador ER (Figura 4A), y se encontró que parte de la señal L583R se superpone con el marcador ER, lo que indica una mayor retención en el RE.

Para entender si se pudo detectar la desestabilización in vitro
, se analizó la estabilidad de L583R en la célula, la evaluación de su volumen de negocios. Hemos bloqueado la síntesis de proteínas con cicloheximida y encontramos que L583R pronto es degradada, tal como se evaluó por su expresión residual pronto después de 8 h de la inhibición de la síntesis de proteínas, en contraste con WT y los otros mutantes que son aún altamente expresado en las mismas condiciones (Figura 4B) , lo que indica que L583R es inestable en la célula. La presencia de la banda de inmaduros en las muestras de E-cadherina WT o mutantes (banda superior, la figura 4B) se debe a la sobrecarga de proteínas derivados de la transfección transitoria.

proteínas inestables o mal plegadas son estrictamente regulados por mecanismos de control de calidad de las proteínas que proteger a la célula por la dirección de proteínas desplegadas recién sintetizados para la degradación en el proteasoma [34]. Para abordar si este es el caso para L583R, que inhibieron la actividad del proteasoma MG132 y observó que, a pesar de los diferentes niveles iniciales de E-cadherina, la expresión de L583R mutante está completamente restaurada tras el tratamiento (Figura 4C), que indica que es prematuramente degradada por el proteasoma después de la síntesis, como se ha descrito previamente para otras mutaciones de E-cadherina CGDH asociada juxtamembranar [35]. Curiosamente, cuando se inhibe la degradación del proteasoma, hay una acumulación de inmaduros E-cad en todas las líneas celulares, que se manifiesta la importancia del proteasoma en la regulación de la nueva síntesis de E-cad, independientemente de ser mutado o no.

a fin de validar el In silico
predicciones, se analizó el fenotipo de una mutación desestabilizado revertido mediante la inducción de una alteración estructural tolerado en la misma posición de la forma mutante de la E-cadherina. Usando FoldX, se calculó el impacto de cada una alteración posible en la posición 583 y encontramos que la alteración inducir menos desestabilización era L583I (ΔΔG = 0,56 kcal /mol, como se predijo usando el modelo de ratón, el cuadro S3). Curiosamente, esta mutación conserva la función adhesiva de E-cadherina, lo que resulta en los agregados de células compactas (Figura 4D), y no se desestabiliza in vitro
, exhibiendo resistencia cicloheximide comparable a la forma WT (Figura 4E). Estos resultados hacen hincapié en la fiabilidad de la in silico predicciones basadas
de estabilidad E-cadherina y la asociación clara de desestabilización E-cadherina con la pérdida de la función adhesiva.

Discusión

e-cadherina alteraciones (mutaciones, deleciones y metilación) son la única causa reconocida genética de CGDH [36], [37], [38]. La mayoría de las mutaciones identificadas en CGDH son del tipo sin sentido, pero una proporción significativa (20%) de mutaciones de línea germinal da lugar a sustituciones de aminoácidos individuales, de los cuales la patogenicidad es difícil de evaluar y es a menudo poco clara [39], [40]. La información más importante en términos de asesoramiento genético de los portadores de mutaciones de sentido erróneo de la línea germinal es la información clínica familiar (análisis de segregación, en su mayoría), pero esta información es a menudo escasa con el tamaño del pedigrí comúnmente ser demasiado pequeño como para permitir estudios de segregación, y la evaluación de la patogenicidad por lo general proviene de in vitro
ensayos basados ​​en células funcionales [15], [17], que son mucho tiempo y técnicamente exigente, y por lo tanto no son ampliamente aplicables en laboratorios moleculares de rutina. En consecuencia, hay una necesidad de nuevos métodos para determinar la patogenicidad de mutaciones de sentido erróneo E-cadherina asociados a CGDH [40].

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