PLoS ONE: El cad destabilizacijos sąskaitos už Missense mutacijų patogeniškumas yra įgimtas Difuzinė Skrandžio Cancer

Anotacija

El cad yra ypač svarbus audinių architektūros priežiūrai dėl savo vaidmenį ląstelių ląstelių sukibimą. E-cad mutacijos yra genetinė priežastis paveldimas Difuzinė Skrandžio vėžys (HDGC) ir missense mutacijų atstovauti klinikinį naštą, atsižvelgiant į jų patogeniškumo vaidmens neapibrėžtumas. In vitro ir in vivo, dauguma mutacijų prarasti-of-funkcija, nors priežastinis veiksnys yra nežinoma dauguma. Mes iškėlė hipotezę, kad destabilizacija gali atsiskaityti už E-cad missense mutacijų HDGC patogeniškumo ir išbandyti mūsų hipotezę, naudojant in silico ir in vitro įrankių. FoldX algoritmas buvo naudojamas apskaičiuoti kiekvieno mutacijos E-cad gimtoji valstybės stabilumui poveikį, o analizė buvo papildyta su evoliuciniu išsaugojimo, kurias atsijoti. Įdomu tai, kad HDGC pacientai slėpimas gemalo E-cad destabilizuojančiu mutantai pateikti jaunesnio amžiaus diagnozės ar mirties, o tai rodo, kad gimtoji valstybės stabilumo E-cad sąskaitų ligos fenotipo praradimas. Norėdami išsiaiškinti biologinį tinkamumą El cad nestabilumo HDGC, mes tyrė naujai nustatytų HDGC susijusių mutacijų (E185V, S232C ir L583R), iš kurių L583R Prognozuojama, kad destabilizuoti grupę. Mes parodysime, kad tai mutacija yra nefunkcionuojanti in vitro pasižymi trumpesniu pusinės ir negali subręsti dėl priešlaikinio proteasomos priklauso nuo degradacijos, fenotipą grįžtamąja stabilizavimo su dirbtinio mutacijos L583I (struktūriškai toleruoja). Čia mes pranešime El cad struktūrinius modelius tinkamas prognozuoti vėžio susijęs missense mutacijų dauguma poveikį ir mes parodome, kad El-cad destabilizacija veda prie netekus funkcijos in vitro ir padidėjusio patogeniškumo in vivo.

nurodomoji dalis: Simões-Correia, J Figueiredo J Lopez R Stricher F Oliveira, C, Serrano, L et al. (2012) El-cad destabilizacijos sąskaitos už Missense mutacijų patogeniškumas yra įgimtas Difuzinė skrandžio vėžio. PLoS vieną iš 7 (3): e33783. Doi: 10,1371 /journal.pone.0033783

redaktorius: Masaru Katoh, Nacionalinis vėžio centras, Japonija

Įstojo: lapkričio 9, 2011; Priėmė: Vasario 17, 2012 m Paskelbta: Kovo 21, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Simões-Correia, et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Fundação para ciencia e Tecnologia, Portugalija (PTDC /SAU-TPD /64.319 /2006, PTDC /SAU-TPD /104.017 /2008, SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (trumpalaikis bendravimas ASTF 60- 2009) ir ES dotacijų perspektyvos (sveikata-F4-2008-201648). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

E-cad yra ląstelė-ląstelės adhezijos glikoproteinas susideda iš penkių ekstraląstelinio cad-tipo kartojasi, po vieną transmembraniniu regione ir labai konservatyvios citoplazminio uodegos [1], [2]. El cad išreiškiamas pirmiausia epitelio ląstelių ir yra pagrindinis komponentas Adherens sankryžos (AJ). Tai sankryžos klasteris, per homophilic sąveikos per ekstraląsteliniuose sričių kalcio priklausomą El cad molekulių, dėl Homotypic kaimyninių ląstelių paviršiuje.

E-cad vaidmuo auglių vystymuisi yra gerai aprašyta, ir jos praradimas išraiška yra karcinoma [3] bruožas. Eksperimentiniai duomenys patvirtina, vaidmenį, E-cad komplekso tiek slopina invazija ir metastazes formavimąsi [4]. Praradimas El cad išraiška dažnai susijęs su genetiniais renginių, tokių kaip sudurti svetainėje ir trumpinimą mutacijų sukelia intarpais, trynimų ir beprasmes mutacijas, be missense mutacijas [5]. Be pavienių difuzinio skrandžio vėžio, keičiant genas, koduojantis E-cad (CDH1) randama pirmenybė į egzonų 7- 9 [5], o skiltelių krūties vėžio jie išplito palei geno, be lengvatinio hotspot [6]. Missense mutacijos randama šių dviejų tipų atsitiktinio vėžio, taip pat sąnarių sarkomą [7].

Šeimyniniai agregacija pasklidosios Skrandžio vėžys (DGC) sudaro 10% visų skrandžio vėžio (GC) atvejais ir tik 1-3% yra paveldimas [8]. Iš šių paveldimų atvejais Paveldima Difuzinė Skrandžio vėžys (HDGC) apibrėžia griežtus kriterijus, kurie buvo apibrėžtas Tarptautinės skrandžio vėžio sąsajas konsorciumo (IGCLC) 1999: (1) du ar daugiau dokumentais atvejai difuzinio skrandžio vėžio pirmą /antrą laipsnį giminaičiai, kai bent vienas iš diagnozuota iki 50 metų amžiaus; arba (2) trijų ar daugiau atvejų dokumentais difuzinio skrandžio vėžio FIRST /antrojo laipsnio giminaičiai, nepriklausomai nuo amžiaus. Ankstyva pradžia Difuzinė Skrandžio vėžys (EODGC) laikoma, kai izoliuotas individas yra diagnozuota DGC su mažiau nei 45 metų amžiaus. Germinacinės CDH1 mutacijos randama 30% HDGC [9] atvejais. Iš CDH1 mutacijų ir šeimine skrandžio vėžio asociacija pirmą kartą buvo aprašyta Guilford ir kt
1998 [10], ir nuo tada daug tyrimų pranešė skirtingų tipų CDH1 mutacijų HDGC [11], [12], [13 ]. Tarp visų užregistruotų CDH1
gemalo mutacijų, 77,9% yra nesąmonė, sukirpimo-svetainė ir rėmelio mutacijos (prognozuojama, kad gaminti anksčiau nutraukti codons) ir 22,1% yra missense mutacijos [9]. Mutacijos, kad generuoti PTC paprastai žalingas, pacientai yra laikomi didelės rizikos vežėjai, ir patariama turėti profilaktinį bendras pašalintas skrandis [14]. Iš missense mutacijų patogeniškumo nėra paprasta, ir šie pakeitimai paprastai vadinama neįslaptintai Sequence atmainų (USVs) dėl griežtų kriterijų, įvertinti jų poveikį stokos. Keli parametrai buvo atsižvelgta į E-cad USVs klasifikavimo HDGC: 1) bendrai segregacija mutacijos DGC (per genealogija); 2) mutacija dažnumas sveikų asmenų kontroline gyventojų; 3) mutacija pasikartojimo (nepriklausomų šeimoms). Atskyrimas analizė dažnai yra neįmanoma, su nedideliu skaičiumi paveiktų atvejais galimų molekulinės diagnozę [15], ir klinikinės informacijos nebuvimas yra ribojantis žingsnis daryti išvadą, jog patogeninės reikšmę šių mutacijų. Apeiti šį apribojimą mes jau anksčiau sukurtą vitro
funkciniai tyrimai, siekiant įvertinti funkcinį poveikį El cad gonocitų linijos missense mutacijų [16], [17]. Tačiau tokie tyrimai įpainioti lab konkrečius eksperimentines sąlygas, ty ląstelių biologijos tyrimus, atliekamus, ir jie daug laiko naudojimas rutinos. Silico
prognozės yra patikimi ir greitai analizė, kad galima naudoti prognozuoti taškinių mutacijų poveikį, ypač kai struktūrinis informacijos [18], [19].

Šiame darbe, mes ištirti potencialių struktūros pagrindu silico
prognozes įvertinti El cad missense mutacijų, rasti paveldimos ir atsitiktinio vėžio poveikį. Mūsų analizė buvo grindžiama gimtoji valstybės stabilumo pokyčių, sukeltų kiekvieno varianto skaičiavimo (ΔΔG = ΔG _{WT-ΔG Mut), gaunamas baltymas dizainas FoldX algoritmas [20], [21]. Įdomu tai, kad pacientų slėpimas destabilizuojančiu mutacijas (ΔΔG > 0,8 kcal /mol) grupė yra būdinga jaunesnio amžiaus diagnozės ar mirtį DGC, tai rodo, kad E-cad gimtoji valstybės stabilumo praradimas prisideda prie ligos fenotipą. Naudojant ląstelių modelį, mes išanalizavo El cad destabilizacijos fenotipą ir nustatė, kad kai mutacija sukelia sumažėjo gimtoji valstybė stabilumas, El cad pirma laiko degradavo iki proteasomos, eksponatų trumpesnis pusinės eliminacijos, todėl nuostolių klijų funkcija. Iš viso, mūsų rezultatai rodo, kad destabilizacija sąskaitas už E-cad missense mutacijų patogeniškumo rasti HDGC.}

Medžiagos ir metodai

Kolekcija E-cad seka variantai ir PDBs

susijusios su HDGC ar EODGC El cad variantai buvo surinkti iš literatūros ir somatinių variantai buvo surinkti iš somatinių mutacijų katalogas vėžiu (COSMIC) duomenų bazė (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/~~HEAD=pobj kosminis /). Trys nauji El cad seka variantai, kur pranešė, kad mūsų laboratorijoje funkcinių analizė: E185V, S232C ir L583R. Neseniai buvo pranešta, L583R, ir su juo susijusių funkcinių duomenų [22].

El cad susijusių PDBs buvo nustatyti naudojant automatinę paiešką su Šveicarijos Modelis kapinyno (http://swissmodel.expasy.org). Seka suderinimas žmogaus E-cad ir kiekvienas iš sekų, naudojamų tiems skirtingų modelių buvo atlikta su M-kavos [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Vaizdai buvo parengtas Pymol. Išanalizavus seka ir struktūrinį homologiją trys PDBs buvo pasirinktas naudoti kaip modelių. Xenopus, C-cad ektodomeną (PBP 1L3W), pelė El cad prodomain (PBP 1OP4) ir pele β-kateninai bendrauja domeną (PBP 1I7X)

FoldX skaičiavimai ir perkratyti analizė

Naudojant FoldX (http://foldx.crg.es/) komanda, Buildmodel
mes sukūrėme trijų skirtingų modelių (prodomain tarpląsteliniai ir citoplazmos); trys struktūros buvo humanizuotų keitimą, kiekvienos skirtingos aminorūgšties. Gautas struktūra buvo optimizuota naudojant komandą, RepairPDB
ir energija, kur analizuojami su Stabilumo
arba AnalyseComplex
komandomis. Ligos susijusios mutacijos buvo sukurtas su Buildmodel
komandą, kiekvieną mutacijos pakartotinai per penkerius veikia. Energijas yra automatinis produkcijos FoldX ir gimtosios valstybės stabilumo kaita, ΔΔG tarp WT ir mutantas (ΔΔG = ΔG _{WT-ΔG Mut) taip pat sukurtas atskirame faile, su atitinkamu standartu nukrypimai, ir visi energingi nuobaudos, susijusią su kiekviena mutacijos. Tik mutacijos su ΔΔG > 0,8 kcal /mol buvo laikoma žalinga}

Mes naudojome atsijoti (http://sift.jcvi.org/~~HEAD=dobj, Rūšiavimo netoleruojantiems Nuo Tolerantiško) įvertinti kiekvieno aminorūgščių keitimą išsaugojimą, kaip anksčiau. aprašyta [25] naudojant Blink funkcija GN. buvo laikomi 31073. tik mutacijos su vagele žemiau 0,05 būti netolerantiški

Prop (http://www.cbs.dtu.dk/services /Prop /) [26] buvo naudojamas siekiant įvertinti, ar mutacijos gali turėti įtakos prodomain skilimo poveikį.

Mobilusis kultūra ir transfekcija

El cad WT kDNR buvo klonuotas pIRES2-EGFP vektoriumi pagal gaminti instrukcijos (Klontex, Takara "Bio) ir mutacijos E185V, S232C, L583R ir L583I HE-cad buvo sukeltas sait mutagenezes kaip aprašyta anksčiau [27]. O tuščia vektorius (Mock) buvo naudojamas kaip kontrolės

CHO (kininio žiurkėno kiaušidžių) ląstelės (ATCC numeris: CCL-61). Buvo auginamos Alfa-MEM terpėje (Gibco, Invitrogen), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumas (FBS; Gibco, INVITROGEN) ir 1% penicilino streptomicino (Lanksčiai, Invitrogen). Ląstelės buvo sporadiškai vertintas mikoplazmos užterštumo imunofluorescence su DAPI. Ląstelės buvo transfekuota su 1 UG kiekvienos vektorių, koduojančią įvairių formų E-cad (WT, E185V, S232C, L583R ir L583I), naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen), atsižvelgiant į gamybos procedūrą. Dėl stabilios ląstelių linijos nustatymo, ląstelės buvo atrenkamos pagal atsparumą antibiotikams 5 mikrogramai /ml blasticidin (Gibco, Invitrogen). Visi mobilieji linijos buvo prižiūrimi drėgnoje inkubatoriuje su 5% CO _{2 37 ° C temperatūroje}

Funkciniai tyrimai

laikinai Transfekuoti CHO (kiniškojo žiurkėno kiaušidžių) ląstelėse (ATCC numeris:. KKM -61) buvo atliktas tekėti citometry, naudojant GFP fluorescencijos matavimas, įvertinti transfekcijq efektyvumą prieš kiekvieną eksperimentą. Lėto agregacijos tyrimas, šulinių 96 duobučių plokštės buvo padengtas 50 pL agaro tirpalo (100 mg Bacto-agaro 15 ml sterilaus PBS). Ląstelės buvo individualus su tripsino ir suspenduotos mitybinės terpės. A 1 × 10 ^{5 ląstelių /ml suspensija buvo parengtas ir 2 × 10 4 ląstelės buvo pasėjamos į kiekvieną duobutę. Plokštelė buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje drėgnoje kameroje su 5% CO _{2 už 48 h. Sumavimas buvo įvertintas apverstos mikroskopu (4 × padidinama) ir fotografavo su skaitmeniniu fotoaparatu.}}

imunoblotingu

Mobilaus ryšio fragmentai buvo gauti kateninai lizės buferiniame tirpale (1% Triton X-100, 1 % Nonidet P-40 PBS), papildytas proteazės inhibitorių kokteilis (Roche) ir fosfatazės inhibitoriaus kokteilis (Sigma). Baltymų įvertinimas buvo padaryta modifikuotu Bradfordo metodu (Bio-Rad). Kiekvienam mėginiui 25 mikrogramų baltymo buvo pakrautas, atskirti 7,5% SDS-PAGE ir electroblotted į nitroceliuliozinio membranos (GE Healthcare Life Sciences). Membranos buvo užblokuotas su 5% ne-riebalų sausojo pieno ir 0,5% Tween-20-PBS. Imunoblotas buvo atliktas su antikūnų E-cad (1:1000; BD Biosciences) aktino (1:1000; Santa Krusas biotechnologijos) ir α-tubulino (1:10000; Sigma "). Avys kovos su pele (GE Healthcare Life Sciences) arba asilas kovos su ožka (Santa Krusas biotechnologijos) buvo naudojami kaip antriniai antikūnai, po ECL aptikimo (GE Healthcare Life Sciences). Immunoblots buvo kiekybiškai Kiekis One "programinė įranga (Bio-Rad).

Fluorescencinis aktyvuota ląstelių rūšiavimo (FACS)

Ląstelės buvo auginamos iki susiliejantis monosluoksnio, deleguotiems su Versene (Gibco, Invitrogen) ir resuspenduojamos lediniu PBS su 0,05 mg /ml CaCl _{2. A pakaba 5 × 10 ^{5 ląstelės buvo 5 minutes centrifuguojami 1500 apsisukimų per minutę 4 ° C, ir išplautos PBS su 0,05 mg /ml CaCl 2 3% BSA. Ląstelės inkubuojamos 60-ąją minutę po pirminio antikūno prieš E-cad, HECD1 (Zymed Laboratories) ne 1:100 praskiedimo. Ląstelės buvo plaunamos du kartus, ir inkubuojami su anti-pelės biotinilintu (Dako) ne 1:100 praskiedimo. Ląstelės buvo plaunamos du kartus, ir inkubuojami su streptavidino PE-CY5 (BD Pharmingen) ne 1:40 praskiedimo. Galiausiai, ląstelės buvo nuplauti, sumaišymo 500 įxL PBS ir 50000 ląstelės buvo analizuojami srauto citometro (Coulter epų XL-MCL). Duomenys buvo analizuojami WinMDI programinės įrangos.}}

imunofluorescencinių dažymo

IMUNOFLUORESCENCIJOS ir mikroskopijos, ląstelės buvo pasėtos ant stiklo coverslips ir išaugo apie 80% santakoje, nustatyta ledinio metanolio 15 minučių, plauti 2 kartus su PBS, ir inkubuojami su pirminiais antikūnais, praskiesto PBS 5% BSA, 60 minučių kambario temperatūroje. naudojami pirminiai antikūnai: pele monokloninis anti-E-cad (BD biomokslai); triušio prieš Calnexin (Stressgen). Antriniai antikūnai naudojamas: Alexa Fluor 488 anti-pelės (1:500; Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-triušis (1:500; Invitrogen). Į coverslips buvo montuojamas ant stikliukų, naudojant Vectashield su DAPI už branduolinių medžiagų aptikimas (Vector Laboratories). Vaizdo įsigijimas buvo atliekamas Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 m fluorescencijos Mikroskopas naudojant 40 × tikslus. Vaizdai buvo įsigytas su Axiocam HRM kameros ir apdoroja programinė įranga Axiovison versija 4,8.

Mobilaus ryšio gydymas

baltymų sintezės slopinimu, ląstelės buvo gydomi 25 mikromolių iš cikloheksimidas už 8 val ir 16 val, o bendros E-cad suma buvo analizuojami WB, kaip aprašyta anksčiau. Už proteasomos inhibicijos tyrimas, ląstelės buvo pasėjamos 6 duobučių lėkštelėse, išaugo iki maždaug 80% santakoje, ir inkubuojami už 16 h su 10 mikromolių MG132 (CalBiochem). Ląstelių fragmentai buvo analizuojami WB, kaip aprašyta anksčiau.

Rezultatai

1. E-cad struktūriniai modeliai

Yra keletas žmonių El cad (HE-CAD) struktūros yra, ir jie apima tik mažomis porcijomis baltymų (lentelė S1). Naudojant automatinį paiešką Šveicarijos Modelis saugyklos, mes nustatėme, kad PBP 1L3W, komentuojami pilnas ilgis tarpląstelinio domeno Xenopus EP-cad (EP-cad), yra labai homologiczne pačiame domene žmonijos E-cad. Tyrėme sekos homologiją išlyginimo naudojant M-kavos daugkartinę sekos derinimą, kuris jungia kelių kelių sekos suderinimo paketai išvestis (PCMA, GOP, mafft, raumenų, T-Kava, clustalw, probcons, DialignTX) [23], [24 ]. 1A paveiksle parodyta dviejų ekstraląsteliniuose domenų sekomis derinimą. Raudonos plytos regionai atstovauja puikus susitarimas tarp metodų, ty labai panašūs sekas. Norėdami sukurti modelio struktūrą, mes pašalinome regionus be panašumo (pav 1A, žvaigždės) ir apribojo regionams modelį su patikima suderinimo (juoda rodykle 1a pav.) Xenopus struktūra humanizuoti, kaip aprašyta medžiaga ir metodai ir 1B pav struktūrinį derinimą HE-cad EB1-EC2 srityse (nuo PBP 2O72) ir EB1-EC2 domenus Xenopus gautų struktūrinis modelis. Kad abi struktūros yra beveik uždėtų, nurodant, kad tarp ekstraląstelinio domenų žmogaus E-cad ir Xenopus EP-cad panašumas yra ne tik sekos lygiu, bet ir struktūrinio lygio. Modelio struktūra žmogaus E-cad eksponatų suderinamus energijas su struktūros nuo Xenopus, su šiek tiek sumažėja laisvojo energijos (ΔG) gauto modelio (ΔG _{Nekilnojamas = 559,99 kcal /mol ir ΔG Modelis = 531.77 kcal /mol), tai rodo, kad humanizavimas nenustato papildomų susidūrimų. Pastaruoju metu pelės tarpląstelinio domeno struktūra buvo išleistas (PBP 3Q2V, Stalo S1), ir mes taip pat naudojo šią struktūrą kaip pavyzdį, kaip būdas patikslinti gautus su Xenopus modelio rezultatus.}

Mes sukūrėme kiti du modeliai, apimantys Prodomain (PBP 1OP4 nuo pelių N-cad) ir β-kateninai citoplazmos domenas (PBP 1I7X nuo pelių E-cad), naudojant tą pačią metodiką. Iš viso trys modeliai apima daugumą baltymų struktūros (1c pav): į prodomain modelis apima pozicijas 28-117, tarpląstelinio modeliai pozicijas 155-697 ir β-kateninai citoplazmos sritis apima 782-838. Ties juxtamembrane domeno lygiu, vienas struktūra yra apibūdinta gavimo būdas, apimantis, kuri sąveikauja paviršių tarp E-cad ir P120 [28]. Ši struktūra yra nedidelis, 18 aminorūgštys ilgą peptido (įskaitant pozicijas 756-773 nuo HE-cad), labai mažo struktūrinės turinio, veiksnių, kurie mažina energijos skaičiavimų patikimumą, todėl išmesti šią struktūrą iš analizės.

2. Silico
prognozavimas vėžio susijęs El cad USVs

E-cad mutacijų poveikį ne tik genetinė priežastis HDGC, tačiau jie taip pat dažnai randamas įvairių tipų atsitiktinis vėžio. Tyrėme silikochromatas Viesbutis The visų vėžio susijęs El cad missense mutacijų, kad lokalizuoti regionams, kuriems taikomas struktūrinių modelių sukurtas Poveikis: 22 gemalo mutacijų rasti apie HDGC ir EODGC parametrus ir 57 rasta pavienių vėžio. Gemalo E-cad USVs buvo surinkti iš literatūros, o kai kurie asmeniniai ryšiai mūsų laboratorijoje. Kai HDGC /EODGC mutacijos yra neįmanoma modeliuoti, dėl struktūrinio informacijos trūkumo (pavyzdžiui, tie, lokalizuota į juxtamembrane domeno E-cad), ir nebuvo įtraukti į šią analizę. Somatinės mutacijos buvo renkami iš Vėžys genomo projektas duomenų bazėje, ir mutacijų nerasta skrandžio ir skiltelinės krūties vėžiu (tik du rūšių vėžį susijusios su HDGC), bet ir kitų tipų vėžys, pavyzdžiui, sąnarių sarkomos ar tulžies latakų karcinoma (lentelė S2 ).

Naudojant anksčiau aprašytų struktūrinių modelių, mes panaudojome FoldX generuoti kiekvienai iš vėžio susijęs USVs, ir įvertinti savo gimtosios valstybės stabilumą, ΔG (paprastai vadinamos bendrosiomis energijos paprastumo) [20]. Energinga skirtumas tarp WT nuoroda ir atitinkamu mutantas (ΔΔG = ΔG _{WT-ΔG Mut) buvo apskaičiuotas 22 HDGC /EODGC El cad USVs lokalizuota regionų, kuriems taikomas modelio struktūras ir rezultatai yra išvardyti 1 lentelėje Kai ΔΔG yra neigiamas, tai atspindi gimtoji valstybės stabilumo mutantas forma pelną; kai ji yra teigiamas, tai reiškia, kad mutantas yra mažiau stabilus tada WT nuoroda. Ankstesni tyrimai kituose baltymuose parodė, kad stabilumas pokyčius, apskaičiuotus su FoldX algoritmas žemiau 0,8 kcal /mol yra per programinės įrangos klaidos kaita, ir todėl laikoma nereikšminga [21]. Taigi, mes tik laikomi mutacijos bus destabilizuoti kai jie sukelia energijos pokyčius virš 0,8 kcal /mol. 2A pav, mutacijos virš schemos destabilizuojantys, o apatinis iš jų yra struktūriškai toleruojamas. Akivaizdu, kad destabilizuoti mutacijos spead palei baltymų, be lengvatinio domeno įtakos.}

He-cad prodomain skyla brendimo metu ir jei tai nėra įvykdyta, El cad klijai funkcija sutrikusi [ ,,,0],29], [30]. Dėl mutacijos lokalizuota šioje srityje, mes įvertino bendro energijos poveikį su FoldX, apsaugos su atsijoti, ir taip pat įvertino, ar kišimasis į prodomain skilimo vietoje su Prop (detales Medžiagos ir metodai). Mes nustatėme, kad tiek paveldimas (G62V ir T118R) ir atsitiktinis (P30T, G62D, H92Y, H121R ir H123Y) mutacijos lokalizuota E-cad prodomain struktūriškai toleruojamas, kaip pranašavo FoldX (lentelė S3). Kai mes analizuoti poveikį remiantis išsaugojimo naudojant perkratyti, mes taip pat nustatė, kad nė vienas iš mutacijų buvo laikoma žalinga, nes jų apsaugos laipsnis yra žemas (lentelė S3). Šie rezultatai rodo, kad E-cad USVs patogeniškumo lokalizuotas prodomain greičiausiai nepriklauso nuo destabilizavimo. Mes taip pat nustatė, jokio poveikio dėl propeptide skilimo, kaip ir buvo numatyta prop (duomenys neparodyta). Todėl mes manome, kad e-cad mutacijų patogeniškumo šioje srityje gali atsirasti trukdžių su baltymų dalyvaujančių prodomain perdirbimo pjaustymas, neįmanoma prognozuoti silico
.

Paveldima El -cadherin USVs span visą ilgį neląstelinio domeno, o pavienių mutacijos yra daugiausiai nustatoma EC2-EC3, kaip pagal hotspot anksčiau aprašytą egzonų 7-9 [5]. Iš viso 18 gemalo HDGC /EODGC mutacijų lokalizuota šioje srityje, mes nustatėme, kad 10 turi didelį struktūrinį poveikį baltymų (1 lentelė). Maždaug pusė atsitiktinis mutacijų taip pat destabilizuoti (lentelė S3), nepriklausomai nuo to, EB domeno, kur jie yra lokalizuota, o tai rodo, kad gimtoji valstybė destabilizacija gali būti susijęs su esminio frakcija atsitiktinis vėžio dalyvauja El cad nuostolius taškinės mutacijos.

tik trys mutacijos lokalizuotas regione susieto iki citoplazmos β-kateninai rišantis domenas (P799R, V832M, S838G) modelis: pirmieji du identifikuoti HDGC /EODGC aplinkoje, o kitas atsitiktinis, rasti kiaušidėje karcinoma [31]. Dėl šių mutacijų Tyrėme privalomą energijos tarp E-cad ir beta-kateninai ir nustatė, kad nė vienas iš jų smarkiai keičia afinitetas beta-kateninai pagal FoldX prognozavimas. Tai pagal in vitro
rezultatai, rodantys, kad paveldima mutacija V832M efektyviai suriša ß-kateninai, o jo patogeniškumas atrodo priklauso nuo E-cad /β-kateninai komplekso negalėjimo įpareigoti α -catenin [32], [33].

Mes surinkome visas prognozes ir funkcionalus in vitro
duomenys HDGC /EODGC mutacijų ir analizavo į prognostinius Naudota (1 lentelė) patikimumą. Mes suskirstyti rezultatus iš prognozių, kaip: True Teigiamas (TP), kai mutacija Prognozuojama, kaip žalingas silikochromatas
(arba pagal FoldX arba atsijoti) ir eksponuoti nuostolių funkciją in vitro
; Tiesa Neigiamas (TN), kai mutacija Prognozuojama, kaip toleruojamas silico parsisiųsti ir funkcionalus in vitro
; Klaidingi teigiami (BP), kai mutacija Prognozuojama, kaip žalingas silico
bet yra funkcinis in vitro
; ir klaidingai neigiamų (FN), kai mutacija Prognozuojama, kaip toleruojamas silikochromatas
bet eksponatai in vitro
nuostolių funkcija. TP ir TN yra teigiami rezultatai, tai reiškia, kad prognozuoti sugeba aptikti mutacijos poveikį funkciją; BP ir FN atstovauti savo laipsnį nepakankamumas. Mes nustatėme, kad abu algoritmai sugeba prognozuoti funkcinį poveikį iki 70% gemalo HDGC /EODGC mutacijų (11 iš 16 mutacijų), su spėjimai sutampa pusė mutacijų (1 lentelė, 2B pav.)

išanalizavo turimus už gonocitų linijos HDGC /EODGC mutacijos vežėjų ir duomenis, nors informacija yra ribota, mes nustatėme, kad labiausiai komplektas duomenų yra pradžios ar mirties, susijusios su DGC amžiaus. Kai mes BOX-sklypas ši duomenų grupavimas "destabilizuojančius" ir "Ne-destabilizacijai" mutacija vežėjais, mes stebime akivaizdų jaunesni ligos pradžios (diagnostikos ar mirties) už pirmosios grupės (2d pav), o tai rodo, kad gimtoji valstybės destabilizacija sudaro ankstesnio plėtros DGC.

3. Biologinė reikšmė E-cad destabilizacijos

Norėdami nustatyti biologinę reikšmę El cad destabilizacija, mes naudojamas kaip modelinė sistema trys naujai nustatytus El cad gemalo missense mutacijas, apie kuriuos pranešta, kad mūsų laboratorijoje funkcinių charakteristika: E185V, S232C ir L583R, vėliau neseniai aprašyti literatūroje [22]. in silico
analizė aprašyta anksčiau buvo atlikta šių trijų naujų mutacijų ir rezultatai yra įtraukti į 1 lentelėje (žemiau tamsiai linija). Mutacijos E185V ir S232C yra struktūriškai toleruojamas, su ΔΔG = 0,29 kcal /mol ir -0,9 kcal /mol atitinkamai (1 lentelė), laikoma nereikšminga dėl valstybių narių įstatymų struktūroje poveikį. Mutacija S232C skatina į energijos sumažėjimą, stabilizuoti baltymą, ir tai yra dėl to, kad aukštos energijos serino palaidotas OH grupė, kuri nėra įtrauktos į kokį H-jungtimi praradimo, ir į cisteino sidechain apgyvendinimo. Mutacijos L583R sukelia nestabilumo, su ΔΔG = 2,72 kcal /mol, atspindintis dramatišką pokytį nuo hidrofobine į hidrofilinis aminorūgšties, kad rezultatai arginino negalėjo susidaryti H. obligacijas, bus nepalankiai palaidotas.

N vitro
funkciniai tyrimai buvo atlikti minėtų HDGC /EODGC mutacijų, ir mes radome puikią koreliaciją tarp funkcionalumo in vitro parsisiųsti ir buvimas /nebuvimas struktūrinį poveikį: E185V ir S232C išlaikyti klijai funkcija E-cad, ir sugeba formuoti stora korinio agregatus, o L583R eksponatų aiškų išsklaidytą modelį, primenantys Mock ląsteles (3a paveikslas) rodo, kad E185V ir S232C yra ne patogeniškumo ir L583R yra patogeniškas.

Kai mes analizuojami El cad išraišką įvairiose ląstelių linijų, mes nustatėme, kad bendra suma mutantas L583R yra mažesnis, kad WT išraiška tomis pačiomis sąlygomis, o mutacijų E185V ir S232C, išlaikyti normalius (3b pav.) Įdomu tai, kad juosta, atitinkantis L583R yra saugomi gelio, nurodant, kad L583R negali tinkamai subrendęs (nesubrendusių formą E-cad yra 130 kDa, brandus yra 120 kDa) ir tėkmės citometrijos rezultatai rodo, kad ji yra mažiau išreikštas į plazmos membrana (3C pav.)

baltymo brendimo nepavyksta, tai dažniausiai sukelia Endoplazminis tinklas (ER) išlaikymą nesubrendusios baltymų. Norėdami patikrinti, ar L583R iš tiesų buvo saugomi kaip nesubrendusios, mes analizuojami, jei jis lieka ER pagal bendro imr.rnofluorescencija su ER žymeklio calnexin (4a paveikslas), ir nustatė, kad iš L583R signalo dalis iškaltas su ER persekiotoją, nurodant padidėjo ER susilaikymas.

jei suprasti, jei destabilizacija gali būti aptikta in vitro
, mes išanalizavo L583R stabilumą ląstelę, įvertinant jos apyvartos. Mes užblokuotas baltymų sintezę su cikloheksimidui ir nustatė, kad L583R netrukus pablogėti, nes vertino jo likutinės išraiškos netrukus po 8 val baltymų sintezės slopinimu, priešingai nei WT ir kitų mutantų, kurie vis dar labai išreikštų ta pačia sąlyga (4B diagrama) tai rodo, kad L583R yra nestabili ląstelėje. Nesubrendusių juostos buvimas WT arba mutantas El cad mėginių (viršuje grupė, 4B diagrama) yra dėl baltymų pertekliaus atsiranda trumpalaikis transfekciją.

nestabilus arba neteisingai Suskleisti baltymai sandariai reglamentuoja Baltymų kokybės kontrolės mechanizmus kad apsaugoti ląstelę nukreipiant naujai susintetinti prasidėjusios baltymų skilimo į proteasomos [34]. Spręsti, jei tai yra už L583R atveju, mes slopino proteosomos veiklą su MG132 ir pastebėjo, kad, nepaisant skirtingų pradinių lygių E-cad, kad mutantas L583R išraiška yra visiškai atstatytas nuo gydymo (4c pav), nurodant, kad jis yra anksti degradavo iki proteasomos po sintezės, kaip aprašyta anksčiau kitų juxtamembranar HDGC susijęs E-cad mutacijų [35]. Įdomu tai, kad, kai proteasomos degradacija yra slopinamas, yra nesubrendusios E-cad kaupimosi visų ląstelių linijų, pasireiškia, kad proteasomos svarbą naujai susintetintas E-cad reguliavimo, nepriklausomai būti mutuotos, ar ne.

Norėdami dar labiau patvirtinti silico
prognozes, mes analizuojama tam grįžo sutrikdė mutacijos Fenotipų sukeliant struktūriškai toleruojamas keisti toje pačioje padėtyje mutantas forma E-cad. Naudojant FoldX, mes apskaičiavome kiekvieno galimo pakeitimo poveikio 583 poziciją ir nustatė, kad pakeitimas paskatinti mažiau destabilizacija buvo L583I (ΔΔG = 0,56 kcal /mol kaip prognozuojama naudojant pelės modelį, stalo S3). Įdomu, kad tai mutacija pasilieka lipni funkcija E-cad, todėl kompaktiškas mobilus agregatų (4d pav), ir nėra destabilizavo in vitro
, eksponuoti cicloheximide pasipriešinimą, panašų į WT formą (4E pav.) Šie rezultatai pabrėžti patikimumą silikochromatas
pagrįstos prognozės El cad stabilumo ir aiškiai asociacijos El cad destabilizacija su nuostolių lipnia funkcija.

Diskusijos

El cad pakitimai (mutacijos, išbrauktas ir metilinimas) yra vienintelė pripažinta genetinė priežastis HDGC [36], [37], [38]. Dauguma nustatytos HDGC mutacijos yra nesąmonė tipo, bet didelė dalis (20%) ir gemalo mutacijų atsiranda pavienių aminorūgščių substitucijos, iš kurių patogeniškumo sunku įvertinti ir dažnai neaišku, [39], [40]. Svarbiausia informacija, kalbant apie genetinio konsultavimo gemalo missense mutacijų vežėjų yra šeiminė klinikinė informacija (segregacija analizė, dažniausiai), bet ši informacija dažnai yra menki su kilmės dydis dažniausiai yra per mažas, kad būtų galima atskyrimo studijas ir patogeniškumas vertinimas paprastai kilęs iš ląstelių pagrindu in vitro
funkciniai tyrimai [15], [17], kurie yra laiko ir techniškai sudėtinga, ir todėl nėra plačiai taikomas įprastinių molekulinės laboratorijose. Vadinasi, yra poreikis kurti naujus metodus, siekiant nustatyti El cad missense mutacijų, susijusių su HDGC [40] patogeniškumą.

• PLoS ONE: integracija DNR kopijų skaičiaus pakeitimus ir transkripcijos išraiška analizė žmogiškųjų skrandžio vėžio
• PLoS ONE: Pieno fermentuotas Propionibacterium freudenreichii sukelia apoptozę HGT-1 Žmonių Skrandžio vėžio ląsteles