PLoS ONE: E-kadheriinin destabilisaatio tilinpidon patogeenisyyden missensemutaatioita perinnöllistä Diffuusi Mahalaukun Cancer

tiivistelmä

E-kadheriinin on kriittinen kudoksen säilyttämisen arkkitehtuurin vuoksi sen rooli solu-adheesio. E-kadheriinin mutaatiot ovat geneettinen syy Perinnöllinen Diffuusi mahasyövän (HDGC) ja missensemutaatioita edustavat kliininen taakka, epävarmuudesta johtuen niiden synnyssä. In vitro ja in vivo, useimmat mutaatiot johtavat menettämisestä toiminnon, vaikka syynä on tuntematon enemmistön. Oletimme, että epävakauden voisi selittää patogeenisyyden E-kadheriinin missensemutaatioita vuonna HDGC, ja testataan hypoteesia käyttäen in silico ja in vitro työkaluja. FoldX algoritmia käytettiin laskettaessa vaikutusta kunkin mutaation E-kadheriinin native-tilassa vakautta, ja analyysi täydennettiin evoluution säilyttämistä, jonka SEULOA. Mielenkiintoista, HDGC potilaat kätkeminen ituradan E-kadheriinin epävakautta mutanttien esittää nuorempi ikä diagnoosin tai kuolema, mikä viittaa siihen, että menetys natiivin tilan vakaus E-kadheriinin tilit sairausfenotyyppi. Valaista biologista merkitystä E-kadheriinin epävakautta HDGC, tutkimme joukko vasta havaituille HDGC liittyvää mutaatiota (E185V, S232C ja L583R), joista L583R ennustetaan olevan epävakautta. Osoitamme, että tämä mutaatio ei toimi in vitro, osoittaa lyhyempi puoliintumisaika ja ei kykene kypsä, ennenaikaisen proteasomin riippuvan hajoamisen, fenotyypin palautui tasaantuminen keinotekoisen mutaation L583I (rakenteellisesti siedetty). Tässä raportoimme E-kadheriinin rakenteellisia malleja sopivia ennustaa vaikutuksen enemmistön syöpään liittyvän missensemutaatioita ja osoitamme, että E-kadheriinin epävakauden johtaa menetykseen-of-function in vitro ja kasvoivat patogeenisuutta in vivo.

Citation: Simões-Correia J, Figueiredo J, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-kadheriinin destabilisaatio tilinpidon patogeenisyyden missensemutaatioita perinnöllistä Diffuusi syöpään. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10,1371 /journal.pone.0033783

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: Marraskuu 9, 2011; Hyväksytty: 17 helmikuu 2012; Julkaistu: 21 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Simões-Correia ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugali (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (lyhytaikainen apurahan ASTF 60- 2009) ja EU: n avustus Prospects (TERVEYS-F4-2008-201648). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

E-kadheriinin on solu-solu-adheesion glykoproteiini koostuu viidestä ekstrasellulaarisen kadheriinin-tyypin toistoja, yksi transmembraaninen alue ja erittäin konservoitunut sytoplasminen häntä [1], [2]. E-kadheriinin ilmentyy pääasiallisesti epiteelisoluissa ja se on tärkeä osa vyöliitos (AJ). Näiden liittymien klusterin kautta homofiilisiä vuorovaikutusten kautta solunulkoisten domeenien kalsiumista riippuvan E-kadheriinin molekyylien pinnalla homotyyppisessä naapurisolujen.

rooli E-kadheriinin kasvaimen kehitys on hyvin kuvattu, ja sen menetys ilmaisu on tunnusmerkki syövissä [3]. Kokeelliset todisteet tukevat rooli E-kadheriinin monimutkainen sekä tukahduttamaan invaasiota ja etäpesäkkeiden muodostumista [4]. Menetys E-kadheriinin ilmentyminen liittyy usein geneettisiä tapahtumia, kuten silmu- ja katkaisu mutaatioiden aiheuttamat insertioita, deleetioita, ja nonsensemutaatiota lisäksi missense mutaatioiden [5]. Satunnaista diffuusi mahalaukun syöpä, muutokset koodaavan geenin E-kadheriinin (CDH1) löytyy ensisijaisesti eksoneissa 7-9 [5], kun taas lobulaarinen rintasyöpiä ne leviävät pitkin geenin, jolla ei ole etuoikeutetut hotspot [6]. Missensemutaatioita löytyy näiden kahden satunnaista syövän ja myös nivelkalvon sarkooman [7].

familiaalinen yhdistäminen Diffuusi mahasyövän (DGC) edustaa 10% tapauksista mahasyövän (GC), ja vain 1-3% ovat perinnöllisiä [8]. Näistä familiaalinen tapauksissa Perinnöllinen Diffuusi mahasyövän (HDGC) määritellään tiukat kriteerit, jotka on määritelty kansainvälisessä mahasyövän Linkage Consortium (IGCLC) vuonna 1999: (1) kahden tai useamman dokumentoituja tapauksia hajanainen mahasyövän ensimmäisen /toisen asteen sukulaisia, joilla on vähintään yksi diagnosoitu ennen ikää 50; tai (2) kolme tai enemmän tapauksia dokumentoitu hajanainen mahasyövän ensimmäisen /toisen asteen sukulaiset, riippumatta iästä. Early Onset Diffuusi mahasyövän (EODGC) pidetään, kun yksittäinen henkilö on diagnosoitu DGC kanssa alle 45-vuotiaita. Ituradan CDH1 mutaatioita esiintyy 30%: n HDGC tapauksissa [9]. Yhdistyksen CDH1 mutaatioiden ja familiaalinen mahasyövän kuvasi ensimmäisenä Guilford et al
vuonna 1998 [10] ja sen jälkeen monet tutkimukset raportoitu erityyppisiä CDH1 mutaatioiden HDGC [11], [12], [13 ]. Kaikista raportoitu CDH1
ituradan mutaatioita, 77,9% ovat hölynpölyä, liitos päällä ja lukukehysmutaatioita (ennustettiin tuottavan ennenaikainen päättäminen kodoneja) ja 22,1% ovat missensemutaatioita [9]. Mutaatiot, jotka tuottavat PTC ovat yleensä vahingollisia, potilaita pidetään korkean riskin kantajia, ja kehotetaan olla ehkäisevää yhteensä gastrektomia [14]. Patogeenisyys joiden mutaatiot ei ole yksinkertaista, ja nämä muutokset ovat yleisesti tarkoitettu niin Unclassified sekvenssivariantit (USVs) puutteen tiukkojen kriteerien arvioida niiden vaikutuksia. Useat parametrit on otettu huomioon luokittelu E-kadheriinin USVs in HDGC: 1) co-erottelua mutaation kanssa DGC (vajaan polveutumisten); 2) mutaatio taajuus terveillä verrokeilla väestön 3) mutaatio toistuminen (itsenäisissä perheitä). Eriytyminen analyysi on usein mahdotonta, jossa on pieni määrä vaikuttaa tapauksia saatavilla molekyylitason diagnoosin [15], ja koska kliinistä tietoa on rajoittava vaihe päätellä patogeeninen merkitys näistä mutaatioista. Voit kiertää tämän rajoituksen olemme aiemmin kehittäneet in vitro
funktionaalisia määrityksiä arvioimaan toiminnallisia vaikutuksia E-kadheriinin ituradan missensemutaatioita [16], [17]. Tällaiset tutkimukset sekaantumaan lab erityiset koeolosuhteissa, nimittäin solubiologian määrityksissä, ja ne ovat aikaa vieviä käyttää rutiinia. In silico
ennusteet ovat luotettavia ja nopeasti analyysi, voidaan käyttää ennustamaan vaikutus pistemutaatioiden, varsinkin kun rakenteellinen informaatio on saatavilla [18], [19].

Tässä työssä selvitimme mahdollisuuksia rakenne-pohjainen in silico
ennusteet vaikutusten arvioimiseksi E-kadheriinin missensemutaatioita todetut perinnöllinen ja satunnaista syöpä. Analyysimme perustui laskemiseen natiivin tilan vakaus aiheuttamien muutosten kunkin variantin (AAG = AG- _{WT-AG- Mut), saadaan proteiini suunnittelu FoldX algoritmi [20], [21]. Mielenkiintoista, potilaiden ryhmässä kätkeminen epävakautta mutaatioita (AAG > 0,8 kcal /mol) on ominaista nuorempi ikä diagnoosin tai kuoleman DGC, mikä viittaa siihen, että menetys E-kadheriinin native-tilassa vakaus myötävaikuttaa sairauden fenotyyppi. Käyttämällä solu malli, olemme analysoineet fenotyyppi E-kadheriinin epävakautta, ja totesi, että kun mutaatio indusoi vähentynyt natiivin tilan vakautta, E-kadheriinin ennenaikaisesti hajota proteasomin, osoittaa lyhyempi puoliintumisaika, aiheuttaen liima toiminto. Kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että epävakauden osuus patogeenisyyden E-kadheriinin missensemutaatioita löytyy HDGC.}

Materiaalit ja menetelmät

Collection of E-kadheriinin sekvenssivariantit ja PDBs

E-kadheriinin variantit liittyvät HDGC tai EODGC kerättiin kirjallisuudesta, ja somaattisten variantit kerättiin Luettelon somaattiset mutaatiot Cancer (COSMIC) tietokanta (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/kosminen/). Kolme uutta E-kadheriinin sekvenssivariantit jossa ilmoitetaan meidän lab toiminnallista analyysiä: E185V, S232C ja L583R. Äskettäin L583R ilmoitettiin, johon liittyy toiminnallinen liittyvät tiedot [22].

E-kadheriinin liittyviä PDBs tunnistettiin käyttämällä automaattista hakua Sveitsin Model Repository (http://swissmodel.expasy.org). Rinnastus ihmisen E-kadheriinin ja kunkin sekvenssit, joita käytetään eri malleja suoritettiin M-kahvia [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Kuvat valmistettiin Pymol. Tutkittuaan järjestyksessä ja rakenteellinen homologia, kolme PDBs valittiin käyttää malleina: Xenopus C-kadheriinin ektodomeeni (ATE 1L3W), hiiren E-kadheriinin prodomeenille (ATE 1OP4) ja hiiren β-kateniinin vuorovaikutuksessa domain (ATE 1I7X).

FoldX laskelmat ja SIFT analyysi

Käyttämällä FoldX (http://foldx.crg.es/) komento Buildmodel
rakennettiin kolme erilaista mallia (prodomeenia, solunulkoinen ja soluliman); Kolmen rakenteet ihmismäistetty korvaaminen kunkin eri aminohappoa. Tuloksena rakenne optimoitiin komennolla RepairPDB
ja energiat, jossa analysoitiin Stability
tai AnalyseComplex
komentoja. Sairaus liittyvät mutaatiot muodostettiin kanssa Buildmodel
komento, kukin mutaatio toistuvat viidessä kulkee. Energiat ovat automaattinen tuotanto FoldX, ja natiivi-tilan vakaus muutos, AAG, välillä WT ja mutanttien (AAG = AG- _{WT-AG- Mut) syntyy myös erilliseen tiedostoon, jossa vastaava standardi poikkeamat, ja kaikki energinen seuraamukset liittyvät kunkin mutaatio. Vain mutaatiot AAG > 0,8 kcal /mol pidettiin vahingollisia.}

Käytimme SEULOA (http://sift.jcvi.org/, lajittelu Intoleranssi Vuodesta Suvaitsevainen) arvioimaan suojeluun kussakin aminohappoa korvaaminen, kuten aiemmin kuvattu [25], käyttäen Blink piirre GI: 31073. Vain mutaatiot pistemäärällä alle 0,05 pidettiin Intoleranssi.

prop (http://www.cbs.dtu.dk/services /prop /) [26] käytettiin arvioimaan, jos mutaatiot voivat vaikuttaa prodomeenille pilkkominen.

Soluviljely ja transfektiot

E-kadheriinin WT cDNA kloonattiin pIRES2-EGFP mukaisen vektorin valmistaa ohjeet (Clontech, Takara Bio) ja mutaatioita E185V, S232C, L583R ja L583I hE-kadheriinin indusoitiin kohdennetulla mutageneesillä, kuten on kuvattu aiemmin [27]. Tyhjän vektorin (vale), käytettiin kontrollina.

CHO (kiinalaisen hamsterin munasarja) -solut (ATCC-numero: CCL-61) kasvatettiin Alfa-MEM-alustassa (Gibco, Invitrogen), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco, Invitrogen) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Gibco, Invitrogen). Solut satunnaisesti arvioitiin mycoplasm saastumisen imunofluorescence DAPI. Solut transfektoitiin 1 ug kutakin vektorit koodaavat eri E-kadheriinin (WT, E185V, S232C, L583R ja L583I) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen), noudattamalla valmistajan menettelyä. Vakaan solulinjan perustaminen, solut valitaan antibioottiresistenssin 5 ug /ml blastisidiinia (Gibco, Invitrogen). Kaikkia solulinjoja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 5% CO _{2 37 ° C: ssa.}

Funktionaaliset määritykset

transfektoitiin CHO (kiinalaisen hamsterin munasarja) (ATCC numero: CCL -61) saatettiin virtaamaan citometry käyttäen GFP fluoresenssin mittausta, voidaan arvioida transfektiotehokkuuden ennen kutakin koetta. Hitaaseen -aggregaatioanalyysi, kuoppiin 96-syvennyksen levy päällystettiin 50 ul: agar-liuosta (100 mg Bacto-Agar 15 ml: ssa steriiliä PBS: ää). Solut irrotettiin trypsiinillä ja suspendoitiin elatusaineeseen. Suspensiota, jossa oli 1 x 10 ^{5 solua /ml, valmistettiin ja 2 x 10 4-solut ympättiin kuhunkin kuoppaan. Levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa kammiossa, 5% CO _{2: ssa 48 tuntia. Aggregaatiota arvioitiin käännettyä mikroskooppia (4-kertainen suurennus) ja valokuvattiin digitaalikameralla.}}

Western blotting

Solulysaatteja saatiin kateniinin lyysipuskuria (1% Triton X-100, 1 % Nonidet P-40 PBS: ssä), täydennettynä proteaasiestäjäseostabletit (Roche) ja fosfataasinestäjällä cocktail (Sigma). Proteiini määrän tehtiin modifioitu Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad). Kustakin näytteestä 25 ug proteiinia ladattiin, erotettiin 7,5% SDS-PAGE, ja elektroblotattiin nitroselluloosamembraanille (GE Healthcare Life Sciences). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta ja 0,5% Tween-20 PBS: ssä. Immunoblottaus suoritettiin vasta-aineilla E-kadheriinin (1:1000, BD Biosciences), aktiinin (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), ja α-tubuliinin (1:10000; Sigma). Lampaan anti-hiiri (GE Healthcare Life Sciences) tai aasin anti-vuohi (Santa Cruz Biotechnology) käytettiin toissijainen vasta sen jälkeen ECL havaitseminen (GE Healthcare Life Sciences). Immunoblotit oli määrällisesti Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad).

Fluoresenssi soluerotte- (FACS) B

Solut kasvatettiin yksisolukerroksena, irrotetaan Versene (Gibco, Invitrogen) ja uudelleensuspendoitiin jääkylmään PBS 0,05 mg /ml CaCl _{2. Suspensiota, jossa oli 5 x 10 ^{5-soluja sentrifugoitiin 5 minuuttia 1500 rpm 4 ° C: ssa, ja pestiin PBS: ssä, jossa 0,05 mg /ml CaCl 2 3% BSA: ta. Soluja inkuboitiin 60 minuutin ajan primäärisen vasta-ainetta E-kadheriinin, HECD1 (Zymed Laboratories) on 1:100 laimennus. Solut pestiin kahdesti ja inkuboitiin sitten anti-hiiri-biotinyloidun (Dako) on 1:100 laimennus. Solut pestiin kahdesti ja inkuboitiin sitten streptavidiini PE-CY5 (BD Pharmingen) klo 01:40 laimennus. Lopuksi solut pestiin, suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää, ja 50000-solut analysoitiin virtaussytometrillä (Coulter Epics XL-MCL). Aineisto analysoitiin WinMDI ohjelmisto.}}

immunofluoresenssivärjäyksellä

Immunofluoresenssi- ja mikroskopia, solut ympättiin lasipeitinlevyille ja kasvanut noin 80% konfluenssiin, kiinteä jääkylmässä metanoli 15 minuuttia, pestiin 2 kertaa PBS: llä, ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen, laimennettiin PBS 5% BSA: ta, 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet: hiiren monoklonaalinen anti-E-kadheriini (BD Biosciences); kanin anti-kalneksiini (Stressgen). Toissijainen vasta käytetty: Alexa Fluor 488 anti-hiiri (1:500, Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-kani (1:500; Invitrogen). Peitinlasit asetettiin lasilevyille käyttäen Vectashield DAPI ydin- havaitsemiseen (Vector Laboratories). Kuvan hankinta suoritettiin Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 M fluoresenssimikroskooppiin käyttäen 40 × tavoitteita. Kuvat hankittiin AxioCam HRM kamera ja käsitellään ohjelmiston Axiovison version 4.8.

Cell Hoidot

inhibition, soluja käsiteltiin 25 uM Sykloheksimidi 8 h ja 16 h, ja määrä koko E-kadheriinin analysoitiin WB, kuten aikaisemmin on kuvattu. Proteasomia inhibition määrityksessä, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, kasvatettiin noin 80% konfluenssiin, ja inkuboitiin 16 h 10 uM MG132 (Calbiochem). Solulysaatit analysoitiin WB edellä kuvatulla tavalla.

Tulokset

1. E-kadheriinin rakenteellisia malleja

On olemassa muutamia ihmisen E-kadheriinin (HE-cad) rakenteet saatavilla, ja ne kattavat vain pieniä osia proteiinin (taulukko S1). Käyttämällä automaattinen haku Sveitsin Model Repository, huomasimme, että ATE 1L3W, selityksineen koko pituudeltaan solunulkoista domeenia Xenopus EP-kadheriinin (EP-cad), on erittäin homologinen saman toimialueen ihmisen E-kadheriinin. Analysoimme sekvenssihomologia rinnastamalla käyttäen M-kahvia, usean sekvenssin rinnastus, joka yhdistää lähtö useiden useita sekvenssin rinnastus paketteja (PCMA, Poa, Mafft, Lihas, T-Coffee, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. Kuvio 1A esittää kohdistuksen kaksi solunulkoisen domeenin sekvenssejä. Punainen tiili alueet edustavat täydellinen yksimielisiä käytetyt menetelmät, jotka edustavat hyvin samankaltaisia ​​sekvenssit. Mallin laatimisessa rakenne, poistimme alueilla, joilla ei ole samankaltaisuutta (kuvio 1A, tähdet) ja rajoitti mallin alueille luotettavien tulosten saamiseksi (musta nuoli, kuva 1A). Xenopus rakenne humanisoitiin kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät ja kuvio 1B esittää rakenteellista linjaus He-cad EC1-EC2 verkkotunnuksia (ATE 2O72) ja EC1-EC2 domeenit Xenopus johdettujen rakennemalli. Molemmat rakenteet ovat lähes päällekkäin, mikä osoittaa, että samankaltaisuus solunulkoiset domeenit ihmisen E-kadheriinin ja Xenopus EP-kadheriinin ei ole ainoastaan ​​sekvenssin tasolla vaan myös rakenteellisella tasolla. Mallin rakenne ihmisen E-cad esittelee yhteensopiva energiat rakenteen kanssa Xenopus, väheten vapaan energian (AG-) saatu mallin (AG- _{real = 559,99 kcal /mol ja AG- malli = 531,77 kcal /mol), mikä osoittaa, että inhimillistämisen ei aiheuta ylimääräistä yhteenottoja. Äskettäin rakenne hiiren solunulkoisen alueen julkaistiin (ATE 3Q2V, taulukko S1), ja meillä on myös käytetty tätä rakennetta mallina, keinona tarkentaa saatujen tulosten kanssa Xenopus malliin.}

Olemme perustettu kaksi muuta mallia, joka kattaa prodomeenin (ATE 1OP4, hiiren N-kadheriinin) ja β-kateniinin sytoplasmisen domeenin (ATE 1I7X, hiiren E-kadheriinin), käyttäen samaa menetelmää. Kaikkiaan kolme mallia kattavat suurimman osan proteiinien rakenteeseen (kuvio 1C): prodomeenin Malli kattaa asemat 28-117, solunulkoinen mallien asennot 155-697 ja β-kateniinin sytoplasminen domeeni kattaa 782-838. Tasolla jukstamembraanidomeenissa, yksi rakenne selityksineen, joka käsittää interaktiivisen pinnan välillä E-kadheriinin ja p120 [28]. Tämä rakenne sisältää pienen, 18 aminohappoja pitkä peptidi (joka kattaa asemat 756-773 on hE-cad), joilla on hyvin alhainen rakenteellisten sisältöä, tekijät, jotka vähentävät luotettavuus energian laskelmiin, joten hävittää tämän rakenteen analyysiin.

2. In silico
ennustaminen vaikutus syöpään liittyvän E-kadheriinin USVs

E-kadheriinin mutaatiot ovat geneettisen syy HDGC, mutta ne ovat myös usein löytyy erilaisia ​​satunnaista syövät. Analysoimme in silico
vaikutus kaikkien syöpään liittyvän E-kadheriinin missensemutaatioita että paikallistaa alueille kattamien rakenteellisten mallien luotu: 22 ituradan mutaatioita löytyy asetukset HDGC ja EODGC ja 57 löytyy satunnaista syöpiä. Ituradan E-kadheriinin USVs kerättiin kirjallisuudesta, ja jotkut ovat henkilökohtaisen viestinnän meidän lab. Jotkut HDGC /EODGC mutaatiot eivät mahdollista mallintaa, puutteen vuoksi rakenteellisten tietojen (esim. Ne, lokalisoitu jukstamembraanidomeenissa E-kadheriinin), ja ei sisällytetty tähän analyysiin. Somaattiset mutaatiot kerättiin Cancer Genome Project tietokantaan, ja ne sisältävät mutaatioita löytyy maha- ja lobulaarinen rintasyöpä (vain kaksi syöpätyypit liittyvät HDGC), mutta myös muiden syöpien kuten nivelkalvon sarkooma tai sappiteiden karsinooma (taulukko S2 ).

käyttäen rakenteellisia malleja on kuvattu aikaisemmin, käytimme FoldX tuottamaan kullekin syöpään liittyvän USVs, ja arvioitiin niiden natiivin tilan vakautta, AG-(kutsutaan yleisesti kuin kokonaisenergia yksinkertaisuuden vuoksi) [20]. Energinen ero WT viite ja vastaava mutantti (AAG = AG- _{WT-AG- Mut) laskettiin 22 HDGC /EODGC E-kadheriinin USVs lokalisoitu alueille mallin kattamaa rakenteita, ja tulokset on esitetty taulukossa 1. Kun AAG on negatiivinen, tämä kuvastaa voitto natiivin tilan vakaus mutanttimuotoon; kun se on positiivinen, se merkitsee sitä, että mutantti on epävakaampi sitten WT viite. Aiemmat tutkimukset muut proteiinit ovat osoittaneet, että vakaus muutokset lasketaan FoldX algoritmin alle 0,8 kcal /mol ovat virhe muutos ohjelmiston, ja ovat siten pidetään ei-merkitsevä [21]. Niinpä me vain katsoi mutaatioita olevan epävakautta kun ne aiheuttavat energia muuttuu yli 0,8 kcal /mol. Kuviossa 2A, mutaatiot yläpuolella järjestelmä ovat epävakautta, kun pohja ne ovat rakenteellisesti siedettyjä. On selvää, että epävakautta mutaatioita spead pitkin proteiinia, ilman etuuskohteluun domain vaikuttanut.}

prodomeenille He-cad lohkeaa kypsymisen aikana, ja jos näin ei tapahdu, E-kadheriinin liima vajaatoimintaa [ ,,,0],29], [30]. Sillä mutaatiot lokalisoitu tällä alalla, arvioimme vaikutus kokonaisenergiasta kanssa FoldX, säilyttämisen kanssa SEULOA, ja arvioitiin myös, jos häiriöitä prodomeenille katkaisukohdan kanssa Prop (yksityiskohdat Materiaalit ja menetelmät). Huomasimme, että molemmat perinnöllinen (G62V ja T118R) ja satunnaista (P30T, G62D, H92Y, H121R ja H123Y) mutaatiot lokalisoitu E-kadheriinin prodomeenille ovat rakenteellisesti siedettyjä, kuten ennustaa FoldX (taulukko S3). Kun analysoimme vaikutus perustuu säilyttämiseen käytetään SEULOA, Huomasimme myös, että yksikään mutaatioiden pidettiin vahingollisia, koska niiden aste säilyttäminen on alhainen (taulukko S3). Nämä tulokset osoittavat, että patogeenisyyden E-kadheriinin USVs lokalisoitu prodomeenille todennäköisesti ole riippuvainen epävakautta. Meillä on myös havaittu mitään vaikutusta katkaisun propeptidin, kuten ennustaa Prop (tuloksia ei ole esitetty). Näin ollen uskomme, että patogeenisyyden E-kadheriinin mutaatiot tällä alalla voi johtua häiriöitä telakointi osallistuvien proteiinien prodomeenille käsittelyyn, mahdotonta ennustaa in silico
.

Perinnöllinen E -cadherin USVs ulottuvat koko pituudeltaan solunulkoisen domeenin, kun taas satunnaista mutaatioita esiintyy lähinnä EC2-EC3, kuten mukaisesti hotspot on aiemmin kuvattu eksonit 7-9 [5]. Kokonaismäärästä 18 ituradan HDGC /EODGC mutaatioita lokalisoitu tällä alalla, huomasimme, että 10 on merkittävä rakenteellinen vaikutus proteiinin (taulukko 1). Noin puolet satunnaista mutaatiot ovat myös horjuttavat (taulukko S3), riippumatta n domain, jossa ne ovat paikallisia, mikä viittaa siihen, että natiivi-tilassa epävakauden voi liittyä huomattavaan osa satunnaista syöpiä E-kadheriinin tappio pistemutaatio.

Vain kolme mutaatiota on lokalisoitu alueella kartoitettu mallin sytoplasmisen β-kateniinin sitovan domeenin (P799R, V832M, S838G): kaksi ensimmäistä tunnistettu HDGC /EODGC asetus ja toinen satunnaista, löydetty munasarjasyöpänäytteissä [31]. Näiden mutaatioiden olemme analysoineet sitovan energian välisen E-kadheriinin ja β-kateniinin ja havaitsi, että mikään niistä ei merkittävästi muuttaa sitoutumisaffiniteetin β-kateniinin, mukaan FoldX ennustamiseen. Tämä on sopusoinnussa in vitro
tulokset osoittavat, että perinnöllinen mutaatio V832M tehokkaasti sitoo β-kateniinin, ja sen patogeenisyys näyttää olevan riippuvainen kyvyttömyys E-kadheriinin /β-kateniinin monimutkainen sitoa α kateniinin [32], [33].

kerännyt kaikki ennusteet ja toiminnallinen in vitro
tietoja HDGC /EODGC mutaatioita ja analysoidaan luotettavuutta ennustavia (taulukko 1). Me luokitteli tulokset ennusteita: True Positiivinen (TP), kun mutaatio on ennustettu vahingollisia in silico
(joko FoldX tai SIFT) ja näyttelytila ​​toiminnan menetys in vitro
; Todellinen negatiivinen (TN), kun mutaatio on ennustettu sietokyvyn in silico
ja on toiminnallinen in vitro
; False Positive (FP), kun mutaatio on ennustettu vahingollisia in silico
mutta on toiminnallinen in vitro
; ja väärä negatiivinen (FN), kun mutaatio on ennustettu sietokyvyn in silico
mutta näyttelyissä in vitro
toimintakyvyn menetystä. TP ja TN ovat positiivisia tuloksia, mikä tarkoittaa, että ennustajia pystyvät havaitsemaan mutaation vaikutukset funktio; FP ja FN edustavat tutkintoonsa epäonnistumisen. Huomasimme, että molemmat algoritmit voivat ennustaa toiminnallisia vaikutuksia jopa 70%: n ituradan HDGC /EODGC mutaatioita (11 out of 16 mutaatioiden), jossa ennusteita päällekkäisiä puolet mutaatioista (taulukko 1, kuvio 2B).

Analysoimme tietoja käytettävissä ituradan HDGC /EODGC mutaatioita harjoittajien ja vaikka tieto on rajallinen, huomasimme, että useimmat täydelliset tiedot on alkamisiällä tai kuoleman liittyvät DGC. Kun laatikko-alaa koskeva data, ryhmittely "epävakautta" ja "ei-epävakautta" mutaatio kantajia, havaitsemme ilmeinen nuorempana taudin puhkeamisen (diagnoosi tai kuolema) ensimmäisessä ryhmässä (kuvio 2D), mikä viittaa siihen, että natiivi valtion epävakauteen tilit aikaisempi kehitys DGC.

3. Biologinen merkitys E-kadheriinin epävakautta

Voit selvittää biologisen merkityksen E-kadheriinin epävakautta, käytimme mallina järjestelmän kolme vastatunnistetun E-kadheriinin ituradan missensemutaatioita ilmoitetaan meidän lab toiminnallinen luonnehdinta: E185V, S232C ja L583R, myöhemmin hiljattain kuvattu kirjallisuudessa [22]. in silico
analyysi aiemmin kuvattu suoritettiin näiden kolmen uuden mutaatioiden ja tulokset sisältyvät taulukkoon 1 (alle tumma viiva). Mutaatiot E185V ja S232C ovat rakenteellisesti siedetään, jossa AAG = 0,29 kcal /mol ja -0,9 kcal /mol (taulukko 1), pitää merkityksettömänä koskien vaikutusta rakenteeseen. Mutaatio S232C edistää lasku energia, vakauttaa proteiinia, ja tämä johtuu menetys korkea energia Serine haudattu OH-ryhmä, joka ei osallistu H-sidosta, ja majoitukseen sivuketjun kysteiini. Mutaatio L583R indusoi epävakautta, jossa AAG = 2,72 kcal /mol, mikä dramaattinen muutos hydrofobisesta hydrofiiliseksi aminohappoa, joka johtaa arginiini ei pysty muodostamaan H-sidoksia, epäedullisesti haudattu.

I n vitro
toiminnalliset analyysit tehtiin edellä mainitun HDGC /EODGC mutaatioita, ja löysimme täydellisen korrelaation toiminnallisuuden in vitro
ja läsnäolo /puuttuminen rakenteellisia vaikutuksia: E185V ja S232C säilyttää liima-toiminto E-kadheriinin ja kykenevät muodostamaan tiukka soluaggregaateiksi, kun taas L583R osoittaa selvästi hajallaan kuvio, joka muistuttaa Mock-solut (kuvio 3A), joka osoittaa, että E185V ja S232C ovat ei-patogeeninen ja L583R on patogeeninen.

Kun analysoimme E-kadheriinin ilmentymisen eri solulinjoissa, huomasimme, että kokonaismäärä mutantti L583R on alhaisempi, että WT ilmaisu samoissa olosuhteissa, kun taas mutaatiot E185V ja S232C, säilyttää normaalitasolle (kuvio 3B). Mielenkiintoista on, että nauha, joka vastaa L583R säilytetään geeliä, joka osoittaa, että L583R ei pysty kunnolla kypsyä (epäkypsä muoto E-kadheriinin on 130 kDa, kypsä on 120 kDa) ja virtaussytometria tulokset osoittavat, että se on vähemmän ilmaistu solukalvon (kuvio 3C).

Kun proteiinin kypsymisen epäonnistuu, tämä yleisesti johtaa Endoplasmakalvosto (ER) säilyttäminen epäkypsä proteiini. Sen testaamiseksi L583R todellakin säilytettiin kehittymätön, analysoimme jos sitä säilytetään ER samanaikaisella immunofluoresenssilla ER merkki kalneksiini (kuvio 4A), ja totesi, että osa L583R signaalin päällekkäin kanssa ER merkki, osoittaen lisääntynyt ER säilyttäminen.

Ymmärtääksemme jos epävakautta voitiin havaita in vitro
, analysoimme vakautta L583R solussa, arvioimalla sen liikevaihdon. Me estetty proteiinisynteesiä sykloheksimi- ja totesi, että L583R on pian hajoaa, kun arvioidaan sen jäljellä ilmaisu pian 8 h proteiinisynteesin inhibition, toisin kuin WT ja muut mutantit, jotka ovat edelleen erittäin ilmaistaan ​​samassa kunnossa (kuva 4B) osoittaa, että L583R on epävakaa solussa. Läsnäolo epäkypsä nauhan WT tai mutantti E-kadheriinin näytteistä (top bändi, kuva 4B) johtuu ylikuormituksen proteiinia johtuvien lyhytaikaisella transfektiolla.

epävakaa tai väärin laskostuneet proteiinit ovat tiukasti säännelty Protein laadunvalvontamekanismit jotka suojaavat solun suuntaamalla syntetisoituneeseen unfolded proteiinien hajoamisen proteasomin [34]. Tilanteen korjaamiseksi, jos näin on asia L583R, me esti proteasomiaktiivisuus kanssa MG132 ja totesi, että huolimatta eri lähtötasoa E-kadheriinin, ilmaus mutantin L583R palautetaan täysin käsittelemällä (kuvio 4C), mikä osoittaa, että se on ennenaikaisesti hajota proteasomin synteesin jälkeen, kuten on aiemmin kuvattu muille juxtamembranar HDGC liittyvät E-kadheriinin mutaatioita [35]. Mielenkiintoista, kun proteasomin hajoaminen estyy, on kertyminen epäkypsä E-cad kaikissa solulinjoissa, ilmentää merkitys proteasomin sääntelyn juuri syntetisoidun E-cad, riippumatta mutatoitavan vai ei.

edelleen vahvistaa in silico
ennustukset, olemme analysoineet fenotyypin palautui epävakaiksi mutaatio aiheuttamalla rakenteellisesti siedetty muutos samassa asemassa mutantin muodon E-kadheriinin. Käyttäen FoldX, laskimme vaikutusta kunkin mahdollisen muutoksen asennossa 583 ja havaitsi, että muutos indusoivan vähemmän epävakautta oli L583I (AAG = 0,56 kcal /mol, kuten on ennustettu käyttäen hiirimallissa, taulukko S3). Kiinnostavaa kyllä, tämä mutaatio säilyttää adheesiofunktion E-kadheriinin, syntyy tiivis soluaggregaatteja (kuvio 4D), ja ei horjuttanut in vitro
osoittaen cicloheximide kestävyys verrattavissa WT muotoon (kuvio 4E). Nämä tulokset korostavat luotettavuutta in silico
perustuu ennusteisiin E-kadheriinin vakauden ja selkeä yhdistyksen E-kadheriinin epävakauden menetys liiman funktion.

Keskustelu

E-kadheriinin muutoksia (mutaatioita, poistot ja metyloinnin) ovat ainoat tunnustettu geneettinen syy HDGC [36], [37], [38]. Useimmat mutaatiot tunnistettiin HDGC ovat hölynpölyä tyyppiä, mutta merkittävä osa (20%) ituradan mutaatioita aiheuttaa yhden aminohapon substituutioita, joista patogeenisuuden on vaikea arvioida ja se on usein epäselvä [39], [40]. Tärkeimmät tiedot kannalta Perinnöllisyysneuvonnan ituradan missensemutaatio harjoittajien on familiaalinen kliininen tieto (eriytyminen analyysi, enimmäkseen), mutta tämä tieto on usein niukka koon kanssa sukutaulun yleisesti liian pieniä, jotta erottelun tutkimuksia, ja patogeenisyyden arviointi yleensä peräisin solusta-pohjainen in vitro
funktionaalisia määrityksiä [15], [17], jotka ovat aikaa vieviä ja teknisesti vaativa, ja eivät siten ole laajasti sovellettavissa rutiini molekyyli labs. Näin ollen, on olemassa tarve uusille menetelmille määrittämiseksi patogeenisyyden E-kadheriinin, joiden mutaatiot liittyvät HDGC [40].

• PLoS ONE: integrointi DNA Kopioi numero muutostyöt ja transkription Expression Analysis in Human mahasyövän
• PLoS ONE: Maito käymisen Propionibacterium freudenreichii indusoi apoptoosia HGT-1 ihmisen mahasyövän Cells